病毒感染的分子诊断-20180423.ppt

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,病毒感染的分子诊断,刘映乐,病毒学国家重点实验室,武汉大学,2018-,4,-,2,3,病毒,感染,的分子诊断,利用分子生物学方法对病毒进行检测,分子生物学方法包括核酸扩增、核酸杂交、等温反应、质谱、普通测序、二代测序等,检测对象主要是病毒核酸,病毒,感染,的核酸检测,普通,PCR,、,real-time PCR,、巢式,PCR,、多重,PCR,FISH,一代测序,高通量测序,PCR,Kary B.Mullis,USA,美国教授,Kary B.Mullis,于,1983,年发明了,PCR,技术，他因此获得了,1993,年诺贝尔奖,PCR,PCR,优缺点及应用,优点,灵敏度高，特异性强,操作简单,设备要求低,缺点,PCR,产物分析较繁琐，容易出现人为判读错误,只能进行定性检测，无法实现定量分析,应用,病毒鉴定,联合测序用于病毒分型和病毒耐药突变位点分析,Real-time PCR,2025/12/4 周四,Real-time PCR,Real-time PCR,的优缺点及应用,优点,灵敏度极高，特异性极强,机器分析判读结果，减少人工判读失误,可实现高通量检测,缺点,易出现污染，对人员操作要求高,要求房间分区，对场地硬件条件要求较高,不同种属病毒之间没有相似核酸序列，多种病毒同时检测较难实现,应用,几乎应用于所有病毒感染的检测，且在不同国家地区应用最为广泛,诺如病毒荧光探针法检测试剂盒,全国首家获批诺如病毒核酸检测试剂盒,诺如病毒核酸检测试剂盒（国械注准 20153400293,）（核酸类国内空白）,人鼻病毒核酸检测试剂盒（国械注准,20153400295,）,（国内空白）,人博卡病毒核酸检测试剂盒（国械注准,20153400294,）,（国际空白）,眼部病毒感染多重,real-time PCR,检测试剂盒,一个反应管中可同时检测肠道病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒,探针分别用,FAM,HEX,，,CY3,和,CY5,四种荧光标记的探针,有内参，构建好了标准品，可进行绝对定量,加入了,UNG,酶，可有效控制污染,检出限可达,1-10 copiesml,成本仅为市售试剂盒的,1/10,效益成本比：,TAKARARocheBio-RadThermo,Fluorescence,In Situ,Hybridization(FISH),Carlo Foresta et al.,PLOS ONE,2011,Clare Connor,Nature,2008,HPV,感染,FISH,的优缺点及应用,优点,直接检测病变组织细胞标本，对疾病的诊断意义更大,可检测病毒是否整合到人基因组,缺点,操作繁琐，对人员素质要求高,需要单独的细胞培养间,应用,HPV,EBV,登革热病毒，,HIV,基于转录的扩增,种酶：逆转录酶、酶和聚合酶,条特别设计的寡核苷酸引物,恒温反应，不需要,PCR,仪,能将病原体,RNA,扩增,10,9,倍，比常规,PCR,高个数量级,基于转录的扩增的优缺点及应用,优点,扩增时间短，恒温反应条件，不需要PCR,仪,在等温条件下，快速降解的,RNA,可极大减少扩增过程中污染的可能性,缺点,缺点是不能用于DNA,病毒的检测,以及多种酶混合体系的不稳定性,应用,在临床上应用于HCV,、,HIV,、肠道病毒和呼吸道,RNA,病毒的检测,loop-mediated isothermal amplification,（,LAMP,）,LAMP,的优缺点及应用,优点,等温扩增，不需PCR,仪，可实现床旁或野外环境,灵敏度和特异性均较高,缺点,引物设计极为复杂，研发门槛高，获批检测试剂盒少,应用,目前仅结核分枝杆菌获得CFDA,认证，病毒检测尚处于研发阶段,数字,PCR,数字,PCR,的优缺点及应用,优点,无需标准品，可直接进行绝对定量,对标本中的抑制剂有较高耐受性,为跨实验室比较提供绝对参照标准,缺点,样品分散技术的稳定性有待提高，且成本较高,通量较低，目前通常能检测的信号为FAM,和,VIC,应用,目前仅用于科研，但在临床病毒检测和定量方面极具应用前景,Sanger,测序,Sanger,测序的优缺点及应用,优点,能对病毒进行分型、突变分析,为病毒的传播路径等流行病学提供信息,缺点,通量低，一个反应体系只能分析一种病毒,应用,HBV,、,HCV,、,HIV,、,HSV,、,CMV,、,VZV,、,EBV,、流感病毒等的抗病毒药物适用性分析,深度测序,深度测序的优缺点及应用,优点,不需要对标本中的病毒有预期判断，可以发现新发病毒感染,通量高，可检测到标本中含量少的病毒,对于无菌体液中发现的病毒诊断价值高,缺点,海量数据，分析有难度,部分标本中发现的病毒不一定与疾病相关,应用,重症感染及新发突发传染病疫情，比如埃博拉病毒，寨卡病毒，H7N9,均是通过深度测序被诊断发现,法国梅里埃公司,FilmArray,病原体全自动多重,real-time PCR,检测系统,终点熔解曲线分析,法国梅里埃公司,FilmArray,病原体全自动多重,real-time PCR,技术原理,FilmArray,呼吸道病原体,检测组套,美国,FDA,认证,一个反应板能能同时检测呼吸道相关的,17,种病毒和,3,种细菌,仅需,2,分钟,将样本加入反应管中，剩下的病原体核酸提取、PCR,和结果判断均为全自动操作,1,小时,出结果,但,费用高昂,病毒：,腺病毒,冠状病毒,229E,冠状病毒,HKU1,冠状病毒,OC43,冠状病毒,NL63,人偏肺病毒,人鼻病毒,/,肠道病毒,甲型流感病毒,甲型流感病毒,H1,亚型,甲型流感病毒,H1-2009,亚型,甲型流感病毒,H3,亚型,乙型流感病毒,副流感病毒,1,型,副流感病毒,2,型,副流感病毒,3,型,副流感病毒,4,型,呼吸道合胞病毒,细菌：,百日咳杆菌,肺炎支原体,肺炎衣原体,FilmArray,腹泻病原体,检测组套,美国,FDA,认证,一个反应板能能同时检测腹泻相关的,5,种病毒，,6,种细菌，,6,种致泻性大肠杆菌和,4,种寄生虫,仅需,2,分钟,将样本加入反应管中，剩下的病原体核酸提取、PCR,和结果判断均为全自动操作,1,小时,出结果,但,费用高昂,细菌：,弯曲杆菌,艰难梭菌,类志贺邻单胞菌,沙门氏菌,小肠结肠炎耶尔森氏菌,弧菌,病毒：,腺病毒,F40/F41,亚型,星状病毒,诺如病毒,GI/GII,亚型,轮状病毒,札如病毒,致泻性大肠杆菌：,EAEC,EPEC,ETEC,STEC,O157,EIEC,寄生虫：,隐孢子虫,环孢子虫,溶组织内阿米巴,兰氏贾第鞭毛虫,FilmArray,脑炎脑膜炎病原体,检测组套,美国,FDA,认证,一个反应板能能同时检测腹泻相关的,7,种病毒，,6,种细菌，,1,种真菌,仅需,2,分钟,将样本加入反应管中，剩下的病原体核酸提取、PCR,和结果判断均为全自动操作,1,小时,出结果,但,费用高昂,真菌：,隐球菌,/,新型隐球菌,病毒：,巨细胞病毒,肠道病毒,单纯疱疹病毒,1,型,单纯疱疹病毒,2,型,人疱疹病毒,6,型,人细小病毒,水痘带状疱疹病毒,细菌：,大肠杆菌,K1,流感嗜血杆菌,产单核细胞李斯特菌,脑膜炎奈瑟氏菌,无乳链球菌,肺炎链球菌,美国,Luminex,公司,xTAG,多重,PCR,微球探针检测系统,20 mins,1 hr,2.5 hrs,45 mins,美国,Luminex,公司,xTAG,多重,PCR,微球探针检测技术原理,病毒核酸提取,美国,Luminex,公司,xTAG,多重,PCR,微球探针检测技术原理,Multiplex RT-PCR using target-specific TAGged primers&biotinylated primers,GGCTA CCGAT,TAG 1,3,5,B,B,ds biotinylated,TAGged TS-PCR product,CCGAT,GGCTA,3,TAG 1,5,GGCTA,TAG 1,CCGAT,3,TAG 2,5,B,5,TARGET PRESENT,TARGET ABSENT,病毒核酸扩增,TAGged products are captured,by their complementary Anti-TAG sequence,Streptavidin-phycoerythrin reporter(SA-PE)molecule used to detect biotinylated primer,Universal array made up of different bead populations,with SA-PE reporter present,Anti-TAG 2,TAG 2,Anti-TAG 1,B,PE,Region 29,SA,TAG 1,Region 34,美国,Luminex,公司,xTAG,多重,PCR,微球探针检测技术原理,扩增的病毒核酸与固定有特异性探针的纳米微球杂交并检测,美国,Luminex,公司,xTAG,多重,PCR,微球探针检测技术原理,Luminex 100/200,xMAP Technology based on flow cytometry,Red Laser&APDs,:classify anti-TAG coupled beads,Green Laser&PMT,:quantifies reporter,representing specific hybridization events,MAGPIX,xMAP Technology using LEDs and CCD,Red LED&CCD camera,:classify anti-TAG coupled beads,Green LED&CCD camera,:quantifies reporter,representing specific hybridization events,Read on Luminex,200 or MAGPIX,信号数据获取并分析,美国,FDA,认证,一个反应板能能同时检测呼吸道相关的,19,种病毒，,3,种细菌,需要进行病原体核酸提取、,PCR,、杂交和结果判断,需要手工加样、扩增产物的人工转移,5,小时出结果,费用相对,Flimarray,较为经济,细菌：,肺炎衣原体,肺炎衣原体,军团菌,病毒：,腺病毒,冠状病毒,229E,冠状病毒,HKU1,冠状病毒,OC43,冠状病毒,NL63,人博卡病毒,人偏肺病毒,人鼻病毒,/,肠道病毒,甲型流感病毒,甲型流感病毒,H1,亚型,甲型流感病毒,H1-2009,亚型,甲型流感病毒,H3,亚型,乙型流感病毒,副流感病毒,1,型,副流感病毒,2,型,副流感病毒,3,型,副流感病毒,4,型,呼吸道合胞病,毒,A,型,呼吸道合胞病,毒,B,型,xTAG,呼吸道病原体,检测组套,美国,FDA,认证,一个反应板能能同时检测腹泻相关的,3,种病毒，,6,种细菌，,3,种致泻性大肠杆菌和,3,种寄生虫,需要进行病原体核酸提取、,PCR,、杂交和结果判断,需要手工加样、扩增产物的人工转移,5,小时,出结果,费用相对,Flimarray,较为经济,细菌：,弯曲杆菌,艰难梭菌,志贺菌,沙门氏菌,小肠结肠炎耶尔森氏菌,霍乱弧菌,病毒：,腺病毒,F40/F41,亚型,诺如病毒,GI/GII,亚型,轮状病毒,A,型,致泻性大肠杆菌：,ETEC,O157,EIEC,寄生虫：,隐孢子虫,溶组织内阿米巴,兰氏贾第鞭毛虫,xTAG,腹泻病原体,检测组套,美国赛沛公司的,Xpert,病原体全自动,real-time,检测系统,1,混合,2,加入,3,插入,4,检测,美国赛沛公司的,Xpert,病原体全自动,real-time,检测技术原理,高度集成化、自动化,在一个反应杯里实现了标本病原体核酸的提取、,PCR,、检测和数据分析,Xpert,病原体检测项目,美国,FDA,认证,一个反应管仅能检测,1-2,种病原体,仅需,2,分钟,将样本加入反应管中，剩下的病原体核酸提取、PCR,和结果判断均为全自动操作,1-2小时,出结果,可检测的病毒：,甲型流感病毒,乙型流感病毒,呼吸道合胞病毒,肠道病,毒,HIV-1,病毒载量定量,HCV,病,毒载量定,量,诺如病,毒,人乳头瘤病毒,埃博拉病毒,可检测的细菌：,艰难梭菌,MRSA,CRE,美国,GeneMark,公司,eSensor,探针,-传感器分子检测系统,多重,RT-PCR,之后用探针杂交,再用伏安法电子传感器检测探针并分析信号,eSensor,呼吸道病毒检测组套,美国,FDA,认证,能同时检测,8,种呼吸道病毒,腺病毒：,B,C,和,E,组,冠状病毒,：,229E,HKU1,OC43,和,NL63,型,甲型流感病毒,：检测并分型,乙型流感病毒,人偏肺病毒,副流感病毒：,1,2,3,和,4,型,呼吸道合胞病毒,：,A,和,B,组,人鼻病毒,需要进行病原体核酸提取、PCR,、杂交和结果判断,需要手工或机器提取核酸、扩增产物的人工转移,4-5,小时,出结果,美国雅培公司,Plex-id,PCR-质谱串联分子检测系统,多重,RTPCR,利用电喷雾电离质谱分析产物,美国,FDA,认证,同时检测,influenza A,和,B,virus,需要进行病原体核酸提取、多重,PCR,、质谱分析,6-8,小时出结果,Plex-id,流感病毒检测试剂盒,传染病,长效防控能力的提升和网络实验室持续竞争力的增强,十一五,十二五,十三五,在“十一五”、“十二五”基础上，进一步完善,监测技术体系,，大幅推动,监测技术普及下沉,，全面提升,病原发现鉴定,能力和新,发传染病的识别能力。最终,提高对,传染病暴发疫情监测预警的,敏感度和有效,应对国内外重大传染病,疫情的处置能力。,较为完善,的监测技术体系和质控管理,体系,较为丰富的重大疫情监测实战经验,较为高效的检测技术平台运转和团队协作机制,国家,科技,重大,专项,牵头,建设,单位,常规监测从,30,种扩大为,98,种全覆盖覆盖样本数,15000,份,症候群,检测病原体,病毒,细菌,寄生虫,发热,呼吸道,（,23,种）,11,种,12,种,流感病毒、呼吸道合胞病毒、呼吸道腺病毒、副流感病毒、偏肺病毒、冠状病毒、博卡病毒、鼻病毒、,MERS,、,H7N9,、,H5N1,金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、,A,组乙型链球菌、铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、军团菌、结核分枝杆菌、卡他莫拉汉菌、鲍曼不动杆菌、肺炎支原体、肺炎衣原体,腹泻,（,22,种）,5,种,13,种,3,种,轮状病毒、肠道腺病毒、诺如病毒、札如病毒、星状病毒,致泻性大肠埃希菌（内含,5,个种）、非伤寒沙门菌、志贺菌、空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、小肠结肠炎耶尔森菌、假结核耶尔森菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌、嗜水气邻单胞菌、类志贺邻单胞菌、拟态弧菌、河弧菌,阿米巴、蓝氏贾第鞭毛虫、隐孢子虫病,发热伴出,疹,（,15,种）,9,种,6,种,肠道病毒（,EV71,，,CA16,，,CA10,，,CA6,）、麻疹病毒、风疹病毒、水痘,-,带状疱疹病毒、登革病毒、人类小,DNA,病毒,B19,、,EB,病毒、人类疱疹病毒,6,型、埃博拉病毒,伤寒沙门菌、副伤寒沙门菌、,A,组链球菌、炭疽、伯氏疏螺旋体、立克次体（内含多个种）,发热伴,出血,（,11,种）,5,种,6,种,汉坦病毒、登革病毒、新疆出血热病毒、新布尼亚病毒、埃博拉病毒,鼠疫耶尔森菌、猪链球菌、钩端螺旋体、立克次体（内含多个种）、无形体（内含多个种）、埃立克体（内含多个种）,脑炎,脑膜炎,（,27,种）,10,种,8,种,9,种,寨卡、乙脑、腮腺炎、肠道病毒、单纯疱疹、脊髓灰质炎、麻疹、呼吸道合胞病毒、西尼罗病毒、蜱传脑炎病毒,脑膜炎奈瑟菌、,b,型流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、猪链球菌、大肠杆菌、,B,族链球菌、单增李斯特菌,恶性疟原虫、弓形虫、带绦虫、新型隐球菌、肺吸虫、并殖吸虫、旋毛虫、广州管圆线虫、裂头蚴,扩大病原体监测范围,五大症候群扩大监测范围病原体,病原体名称,导致疾病,EVD68,发热呼吸系统疾病,双埃可病毒,发热呼吸系统疾病、腹泻、脑炎脑膜炎,淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒病,脑炎脑膜炎,H10N8,发热呼吸系统疾病,基孔肯亚病毒,发热伴出疹疾病,尼帕病毒,发热呼吸系统疾病、脑炎脑膜炎,墨累谷脑炎病毒,脑炎脑膜炎,病原体变异变迁研究,综合利用三个五年计划的数据，深度解析中部地区重要病原进化变异与疫情暴发和临床重症发病之间的关系,生物信息学分析方法,体内体外评估技术,环境因子分析,对,30,种以上五大症候群传染病重要病原的变异变迁特征进行深入研究,分子,时钟,进化,基因,重组重,配,核苷酸,变异,速率,阴阳,性选择,突变,多肽,极性,分析,蛋白,结构,模拟,毒力,抗原性,组织细胞,嗜,性,耐药性,地域,传播,路径,宿主,传播,链,易,感人,群,病原体变异变迁研究,对重要病原的重组株和变异株的流行特征、抗原性、复制力和环境抵抗力等特性进行密切跟踪，及时预警散发尤其是暴发疫情,全基因水平扫描重要病原基因重组片断和重组断裂点,重组变异的病毒,蛋白预测,分析,优化重要病原的常见型别与未知型别的分步筛查流程,MEGA,Simplot,GARD,ProtScal,Predict,Protein,Swiss-Mode Workspace,筛查未知病原体,聚焦,可疑的病原体后再通过核酸检测、血清学检测和基因序列分析等方式,进一步,确认,优势技术,策略方案,最终目标,对常规筛查为“阴性”的新发传染病标本中的所有微生物核酸进行深度测序,MLST,技术,PFGE,技术,质,谱,技术,二、三、四,代,测序技术,“渐进互证式”测序策略,确认,真正的致病原,尝试分离,这类病原,武汉国家生物安全实验室,口岸,-P4,实验室,-,烈性传染病病原监测,病原体名称,导致疾病,东方马脑炎病毒,脑炎脑膜炎,裂谷热病毒,出血热、脑炎脑膜炎,黄热病毒,出血热、病毒学症、脑炎脑膜炎,西尼罗病毒,发热、脑炎脑膜炎,克里米亚,-,刚果出血热病毒,出血热、脑炎脑膜炎,拉萨热病毒,发热呼吸系统疾病、出血热、脑炎,埃博拉病毒,埃博拉出血热,马尔堡病毒,马尔堡出血热,猿疱疹病毒,发热出疹、脑炎脑膜炎,马球波病毒,出血热,猴痘病毒,发热伴出疹,现有研究工作基础及条件,国家重点实验室,1,病毒学国家重点实验室,2,医学遗传学国家重点实验室,生物安全,3,级实验室,1,中国科学院武汉病毒所,BSL-3,实验室,2,湖北省疾病预防控制中心,BSL-3,实验室,3,武汉大学,ABSL-3,实验室,生物,安全,4,级,实验室,武汉国家生物安全实验室（,配套有,BSL-3,等团簇平台）,国家地方联合工程研究中心,病毒病防治药物技术国家地方联合工程研究中心,中国典型培养物保藏中心,世界知识产权组织认定的国际保藏机构之一,谢谢,！,