第二章-第九节-质量控制.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,第九节 基因工程药物的质量控制,第九节 基因工程药物的质量控制,与传统意义上的药物生产不同，基因工程药物所获得的蛋白质，其相对分子量较大，并且多数是参与人体生理功能调节作用的蛋白质，极微量就可以产生显著反应，如白介素,-12,的作用剂量为,0.1ug,、干扰素的作用剂量也只须,20-30ug,。,基因工程药物在药性、药剂上的任何偏差，都有会带来严重的人体损伤和危害，因此，必须对于进行十分严格的质量控制和检测。,具体有以下,5,项内容：,（一）原材料的质量控制,（二）培养过程的质量控制标准,（三）纯化过程中的质量控制,（四）目的产品的质量控制,（五）产品的保存要求,（一）原材料的质量控制,1,、重组,DNA,序列的正确性。,2,、进行重组的基因工程菌必须来自单一克隆株。,3,、所使用的载体、质粒必须纯正、而且稳定。,4,、应明确以下各事项：（,1,）目的基因的来源（,2,）限制性内切酶的种类（,3,）载体的名称和遗传特性（,4,）基因重组的位点图谱（,5,）抗生素标记物（,6,）宿主细胞的名称和来源、传代历史（,7,）重组染色体的生物特性、拷贝数、遗传性（,8,）基因表达所导读的核苷酸序列（,9,）启动克隆基因在工程细菌中的表达水平,（二）培养过程的质量控制标准,1,、工程菌菌种纯正、稳定。,2,、每一批次的菌种不含致癌基因，无杂菌、病毒、真菌和支原体的污染。,3,、发酵生产过程中，工程菌表达稳定。,4,、生产过程控制微生物污染。,5,、生产过程保证产量恒定。保证工程菌的稳定性，确定细胞的最高传种代数。,6,、定期检测工程菌的载体系统、质粒拷贝数、载体在工程细胞内是否丢失。,（三）纯化过程中的质量控制,1,、每一批次生产产物的一致性检验。,2,、外源蛋白质含量限度检验,3,、,DNA,限度检验,4,、热原限度检验：,（,1,）血清学检验,（,2,）鲎试剂,（,3,）兔子热敏试验,（四）目的产品的质量控制,基因工程产品的质量控制包括,7,项指标。,1,、产品鉴别的定性分析,2,、纯度分析,3,、杂质检测,4,、生物活性测定,5,、稳定性考察,6,、产品一致性保证,7,、产品的安全性,1,、产品鉴别的定性分析,重组蛋白质药物常用的鉴定方法（,8,项检测）,（,1,）电泳方法,-,聚丙烯酰安凝胶电泳（,SDS-PAEG,）、等电点电泳、免疫电泳。（,2,）免疫学分析方法,-,放射性免疫测定法（,RIA,）、放射性免疫扩散法（,RID,）、酶联免疫吸附法（,ELISA,），免疫印渍方法（,immunoblotting,）。（,3,）受体结合试验。（,4,）各种高效液相分析法（,HPLC,）。（,5,）肽图分析法。（,6,）氨基酸,Edman N,末端序列分析法（,7,）园二色谱方法（,CD,）（,8,）核磁共振（,NMR,）,下面选择其中重要的方法作讲解,-5,种,（,1,）肽图分析,是通过酶解法、或者化学降解法的手段，对构成目的蛋白质的每一段肽链进行结构和成份分析的方法。,肽图分析法是检测蛋白质一级结构中细微变化最为有效的方法。可以作为基因工程产品与天然产品之间进行精密比较的鉴别手段。,方法上可采用：（,1,）各种高效液相分析法（,HPLC,）（,2,）毛细管电泳（,CE,）,（,2,）氨基酸成份分析,这是一种对构成蛋白质的氨基酸单体进行测定的方法。,缺点和局限性：,（,1,）对,50,个氨基酸组成的蛋白质，其测定精度较好，（,2,）当氨基酸数量超过,100,个时就会出现较大的偏差。（,3,）相对分子量越大，其偏差就越严重。这是因为构成蛋白质的肽链在水解过程中，有的水解并不完全，而有的则已经被破坏。,（,3,）部份氨基酸序列分析,氨基酸,Edman N,末端序列分析法，可以作为蛋白质和肽链和重要测定指标。,EADAM,降解法,Eadam,降解法是一种化学法对蛋白质进行测序的方法，是从多肽链游离的,N,末端测定氨基酸残基的序列的过程。,N,末端氨基酸残基被苯异硫氰酸酯修饰，然后从多肽链上切下修饰的残基，再经层析鉴定，余下的多肽链（少了一个残基）被回收再进行下一轮降解循环。,P.Edman,降解测序主要涉及耦联、水解、萃取和转换等,4,个过程。首先使用苯异硫氰酸酯（,PITC,）在,pH9.0,的碱性条件下对蛋白质或多肽进行处理，,PITC,与肽链的,N-,端的氨基酸残基反应，形成苯氨基硫甲酰（,PTC,）衍生物，即,PTC-,肽。然后,PTC-,肽用三氟乙酸处理，,N-,端氨基酸残基肽键被有选择地切断，释放出该氨基酸残基的噻唑啉酮苯胺衍生物。接下来将该衍生物用有机溶剂（例如氯丁烷）从反应液中萃取出来，而去掉了一个,N-,端氨基酸残基的肽仍留在溶液中。萃取出来的噻唑啉酮苯胺衍生物不稳定，经酸作用，再进一步环化，形成一个稳定的苯乙内酰硫脲（,PTH,）衍生物，即,PTH-,氨基酸（下图）。,留在溶液中的减少了一个氨基酸残基的肽再重复进行上述反应过程，整个测序过程现在都是通过测序仪自动进行。每一循环都获得一个,PTH-,氨基酸，经,HPLC,可以鉴定出是那一种氨基酸。,Edman,降解的最大优越性是在水解除去末端标记的氨基酸残基时，不会破坏余下的多肽链。,当蛋白质中含有一个或多个半胱氨酸残基时，有时一对半胱氨酸残基会通过二硫键交联。在这种情况下测序，首先要经过处理（如用过甲酸处理）切断二硫键，然后再进行,Edman,降解测序。,（,4,）重组蛋白质浓度、相对分子量测定,重组蛋白质的浓度测定方法有：（,1,）凯氏定氮法，（,2,）双缩脲法，（,3,）染料结合比色法，（,4,）福林,-,酚法，（,5,）紫外分光光谱法。,重组蛋白质的相对分子量测定方法有：（,1,）凝胶过滤法，（,2,）聚丙烯酰胺聚胶电泳法。,Folin,酚法,实验原理,：,Folin,甲试剂：碳酸钠，氢氧化钠，酒石酸钠，硫酸铜,Folin,乙试剂：磷钼酸,-,磷钨酸试剂,蛋白质在碱性溶液中与铜形成复合物，然后这种复合物以及蛋白质中的,Tyr,酪氨酸，,Thy,色氨酸残基还原磷钼酸,-,磷钨酸试剂，发生蓝色反应。蓝色的深浅与蛋白质的含量成正比。,实验操作,：具体步骤参见讲义,实验结果,：根据标准曲线判断待测样品的浓度,注意事项,：,Folin,乙试剂仅在酸性条件下稳定，而还原反应需在碱性条件下发生，所以在加入,Folin,乙试剂后需立即摇匀（,加一管摇一管,），确保还原反应的发生。,紫外线吸收法,实验原理,：,蛋白质中的,Tyr,，,Thy,残基的苯环含有共轭双键，因此在,280nm,处有一个紫外吸收高峰。在一定的浓度范围内（,0.11.0g/L),，蛋白质溶液的,A,280,与其浓度成正比，可用作定量测定。,实验操作,：具体步骤参见讲义,实验结果,：根据标准曲线判断待测样品的浓度,（,5,）蛋白质二硫键分析,二硫键的巯基与蛋白质的生物活性有着密切的关系。基因工程产物中的,-S-S-,键是否正确配对是一个重要的问题。,测定方法有：（,1,）对氯汞苯甲酸法（,PCMB,），（,2,）,5,、,5-,二巯基,-,双,-2-,硝基苯甲酸法（,DTNB,）,2,、纯度分析,目的蛋白质含量测定,-,通常根据目的蛋白质的理化性质、生物学特性来进行测定。,采用的方法有,4,项检测：（,1,）聚丙烯酰胺凝胶电泳（,SDS-PAEG,）、（,2,）等电点电泳、（,3,）各种高效液相分析法（,HPLC,）、（,4,）毛细管电泳（,CE,）。,3,、杂质检测,杂质分为,2,种类型：蛋白质杂质、非蛋白质杂质。,（,1,）蛋白质杂质的主要来源,（,2,）非蛋白质杂质主要类别,（,3,）常见的杂质和污染物、以及检测方法,（,1,）蛋白质杂质的主要来源,（,A,）残余的宿主细胞蛋白质，,（,B,）目的蛋白质自身变性、由于蛋白酶引起的降解、由于冷冻脱盐导致的沉淀、由于冻干引起的聚合。,（,2,）非蛋白质杂质主要类别,（,A,）杂菌污染，可通过微生物学方法来测定。,（,B,）热原质和内毒素，检测可用鲎试剂。,（,C,）宿主细胞所残余的,DNA,，一般认为,DNA,残余含量小于,100pg/,剂量，是安全的。基测定方法可采用核酸杂交法。,（,3,）常见的杂质和污染物、以及检测方法,杂质和污染物 常用检测方法,-1,：内毒素鲎试剂、家兔热原法,2,：宿主细胞蛋白质免疫分析、,SDS-PAGE,、,CE3,：其它蛋白质杂质（如培养基）免疫分析、,SDS-PAGE,、,HPLC,、,CE4,：残余,DNA NA,杂交、紫外光谱、蛋白结合,5,：蛋白变异肽谱、等电点聚焦IEF,）、,HPLC,、,CE6,：甲酰基甲硫氨酸肽谱、,IEF,、,HPLC,、,CE7,：甲硫氨酸氧化 肽谱、氨基酸分析、质谱、,Edman,分析,8,：产物变性、聚合、脱氨基凝胶分子筛、,SDS-PAGE,、,HPLC,、,CE9,：单克隆抗体亲和配基脱落免疫分析、,SDS-PAGE10,：氨基酸取代 肽谱、氨基酸分析、质谱、,Edman,分析,11,：微生物污染物微生物学检查,12,：支原体污染物微生物学检查,13,：病毒污染物 微生物学检查,4,、生物活性测定,（,1,）免疫测定法,-,重组蛋白质是一种抗原，均有相应的抗体、或者单克隆抗体，可采用放射免疫分析法、酶标免疫法测定基免疫学活性。,（,2,）实验动物体内试验法,-,根据目的蛋白质的生物学、药理学特性，建立活的动物模型，进行各种指标的测定。,（,3,）细胞培养体外效价评定法：,（,A,）细胞培养计数法,（,B,）,3H-TaR,掺入法,（,C,）酶法细胞计数。,对照国家认定的标准、或者参考品进行评价。,5,、稳定性考察,这是评价药物有效性、安全性的重要手段。也是药品贮存条件、使用期限的主要依据。,由于基因工程所生产出一蛋白质都是生物活性物质，它们对于温度、氧化、光照、离子浓度、机械剪切等环境因素均十分敏感。常常会在贮存过程中发生脱氨、氧化、磺酰化、聚合、降解等反应。,稳定性试验必须与一致性试验、纯度测定、生物学效价试验等结合起来，进行多方面的综合评判。才能保证结果的客观性。,6,、产品一致性保证,是用来保证每一批生产出的最终产品在安全性、有效、含量、杂质限度、稳定性等等方面都是一致的。,因为通过基因工程生产药物是一个十分复杂的过程。作用因素和影响因子错综复杂。,只有从原料开始、到生产、到产品形成的每一步骤翥进行严格的工艺要求、并结合严格的质量检测手段，才能保证产品的一致性恒定。,7,、产品的安全性,三致试验：,（,1,）致畸,（,2,）致敏,（,3,）致癌,（五）：产品的保存要求,1,、液态保存,2,、固态保存,1,、液态保存,（,1,）低温保存,-,在,-10,到,-20,以下的低温环境，可以保存蛋白质制剂。,（,2,）在稳定的,PH,条件下保存,-,蛋白质只有在很窄的,PH,范围内才能维持稳定，即当,PH=pI,（等电点）时，因此应该小心调整保存蛋白质的,PH,范围。,（,3,）高浓度保存,-,蛋白质在高浓度溶液中比较稳定，而在低浓度溶液内，常常发生亚基解离、表面变性。,（,4,）真空保存,-,蛋白质在真空状态、或者在惰性气体中密闭保存，能抵抗氧化作用。,（,5,）保护剂保存：,（,A,）某些蛋白质在疏水环境中能够长期保存，这类稳定剂有糖类、脂肪、蛋白质类、多元醇、有机溶剂。,（,B,）某些蛋白质在高离子强度的极性环境中能够长期保存，这类稳定剂有中性盐类。,（,C,）某些蛋白质由于含有半胱氨酸的巯基，容易被氧化，形成次磺酸、和二硫化物，这类稳定剂有,2-,巯基乙醇、二硫苏糖醇。,2,、固态保存,-,冻干粉保存、结晶保存,蛋白质含水时超过,10%,时就容易失去活性。含水量下降到,5%,时，在室温、或者冰箱中保存较为稳定。但是在,37,时，活性显著下降。,固态蛋白质则较稳定。,最好的方法是将蛋白质制成冻干粉、或者结晶。它们具有很强的抗热性和稳定性，干燥器中在,4,以下，蛋白质可保存相当长的时间。,