细菌简单染色和革兰氏染色专业知识讲座.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,本文档所提供的信息仅供参考之用，不能作为科学依据，请勿模仿。文档如有不当之处，请联系本人或网站删除。,一、实验目的,1.,学习微生物涂片，染色原理和染色的基本操作技术，从而掌握微生物的一般染色法和革兰氏染色法。,2.,巩固显微镜（油镜）的使用方法和无菌操作技术。,二、染色原理,由于微生物细胞含有大量水分，对光线的吸收和反射与水溶液的差别不大,机体是无色透明的,，与周围背景没有明显的反差,在普通光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色，使经染色后的,菌体与背景形成明显的色差,，从而能更清楚地观察到其形态和结构微生物细胞是由蛋白质、核酸等两性电解质及其他化合物组成。所以，微生物细胞表现出两性电解质的性质。两性电解质兼有碱性基和酸性基，在酸性溶液中离解出碱性基呈碱性带正电。在碱性溶液中离解出酸性基呈酸性带负电。,经测定，细菌等电点,pH,在,2-5,之间，故在中性、碱性或偏酸性溶液中，细菌的等电点均低于上述溶液的,pH,值，所以细菌带负电荷，容易与带正电荷的碱性染料结合，故用碱性染料染色的较多。微生物体内各结构与染料结合力不同，故可用各种染料分别染微生物的各结构以便观察。,三、染色方法,(,一,),简单染色法,简单染色法又叫作普通染色法，只用一种染料使细菌染上颜色，如果仅为了在显微镜下看清细菌的形态，用简单染色即可。,(,二,),复染色法,用两种或多种染料染细菌，目的是为了鉴别不同性质的细菌，所以又叫鉴别染色法。主要的复染色法有,革兰氏染色法和抗酸性染色法。,革兰氏染色法：不仅能观察到细菌的形态，而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为,革兰氏阳性细菌,，用,G,+,表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为,革兰氏阴性细菌,，用,G,-,表示。细菌对革兰氏染色的不同反应，是由于它们,细胞壁的成分和结构,不同而造成的。,四、实验材料,1.,显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、接种环、载玻片、酒精灯等。,2.,石炭酸复红染液、草酸铵结晶紫染液、碘液、,95,乙醇、番红（沙黄染液,3.,菌种：表皮球菌、变形杆菌,五、实验内容与步骤,(,一,),细菌的简单染色步骤,涂片,干燥,固定,染色,水洗,干燥,镜检,1,涂片,取干净的载玻片于实验台上，在载玻片的中央滴一滴无菌蒸馏水，将接种环在火焰上烧红，待冷却后从斜面挑取少量菌种,(,表皮球菌或变形杆菌,),与玻片上的水滴混匀后，在载玻片上涂布成一均匀的薄层，,涂布面不宜过大,。,2,干燥,涂片最好在室温下使其自然干燥，有时为了使之干得更快些，可将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发，但,切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。,3,固定,固定常常利用高温，手持载玻片的一端，标本向上，在酒精灯火焰外层尽快的来回通过,23,次，共约,23,秒钟，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，,不觉过烫为宜（不超过,60,）,放置待冷后，,进行染色。,4,染色,在涂片薄膜上滴加染色液,(,石炭酸复红、草酸铵结晶紫或美蓝任选一种,),一滴，使染色液覆盖涂片，染色约,1min,。,5,水洗,斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至,洗下的水呈无色为止。,6,干燥,用吸水纸吸去涂片边缘的水珠，置于室温下自然干燥。,用吸水纸时,切勿将菌体擦掉。,7,镜检,用显微镜观察，并用铅笔绘出细菌形态图。,(,二,),细菌的革兰氏染色步骤,涂片干燥固定,初染,水洗,媒染,水洗,脱色,水洗,复染,水洗干燥观察,1,取表皮球菌和变形杆菌,(,均以无菌操作,),分别在同一张载玻片上做,涂片、干燥、固定,，方法均与简单染色的相同。,2,用,草酸铵结晶紫,染色,1min,后水洗。,3,加,碘液,媒染,1min,后水洗。,4,斜置载玻片，滴加,95,乙醇,脱色，至流出的乙醇不现紫色 为止，大约需时,2030s,，随即水洗,。,5,用,沙黄,染液复染,1min,，水洗。,6,用吸水纸吸掉水滴，待标本片干后置显微镜下，用低倍镜观察，发现目的物后用油镜观察，注意细菌细胞的颜色。绘出细菌的形态图并说明,革兰氏染色的结果,。,六、注意事项,1,革兰氏染色成败的,关键是脱色时间,，如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而被误认,为革兰,氏阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被误认为是革兰氏阳性菌。因此必须,严格,把握脱色时间。,2,选用培养,18,-,24,小时菌龄,的细菌为宜，若细菌太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰,氏阳性菌,转呈阴性反应。,思考题,1,作革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？其染色成败的关键一步是什么,？,2,通过,革兰氏染色，你认为它在微生物学中有何实践意义？,七、实验结果,简单染色：表皮球菌和变形杆菌染成（）色。,革兰氏染色（,变形杆菌,与表皮球菌）；将结果填于下表中,实 验,细菌的芽孢染色法和鞭毛染色法,一、实验目的,学习并掌握芽孢染色方法。,初步了解芽孢杆菌的形态特征。,学习并初步掌握鞭毛染色法，观察细菌鞭毛的形态特征。,二、实验原理,1.,芽孢染色法原理,芽孢染色法是利用细菌的芽孢和菌体对染料的亲合力不同的原理，用不同染料进行着色，使芽孢和菌体呈不同的颜色而便于区别。芽孢壁厚、透性低，着色、脱色均较困难，因此，当先用一弱碱性染料，如孔雀绿（,malachite green,）或碱性品红（,basicfuchsin,）在加热条件下进行染色时，此染料不仅可以进入菌体，而且也可以进入芽孢，进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽孢的染料则难以透出，若再用复染液（如番红液）或衬托溶液（如黑色素溶液）处理，则菌体和芽孢易于区分,。,2.,鞭毛染色法的原理,鞭毛是细菌的运动“器官”，一般细菌的鞭毛都非常纤细，其直径为,0.01-0.02m,，在普通光学显微镜的分辨力限度以外，故需要用特殊的鞭毛染色法，才能看到。,鞭毛染色是借媒染剂和染色剂的沉淀作用，使染料堆积在鞭毛上，以加粗鞭毛的直径，同时使鞭毛着色，在普通光学显微镜下能够看到。鞭毛染色方法很多，本实验主要介绍硝酸银染色法。,（见实验课本,35,页）,三、实验器材,1.,仪器：,显微镜、香柏油、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、接种环、载玻片、酒精灯等。,2.,染色液：,芽孢染色液：孔雀绿水溶液，沙黄水溶液,鞭毛染色液：硝酸银鞭毛染色液,A,液，,B,液,3.,菌种：,枯草芽孢杆菌、变形杆菌,四、实验内容与步骤,1,、细菌芽孢染色,（,1,）将培养,24,小时左右的枯草芽孢杆菌或其他芽孢杆菌，作涂片、干燥、固定。,（,2,）滴加,3-5,滴孔雀绿染液于已固定的涂片上。,（,3,）用木夹夹住载玻片在火焰上加热，使染液冒蒸汽但勿沸腾，切忌使染液蒸干，必要时可添加少许染液。加热时间从染液冒蒸汽时开始计算约,4-5,分钟。这一步也可不加热，改用饱和的孔雀绿水溶液（约,7.6,）染,10,分钟。,（,4,）倾去染液，待玻片冷却后水洗至孔雀绿不再褪色为止。,（,5,）用沙黄水溶液复染,2-3,分钟，水洗。,（,6,）待干燥后，置油镜观察，芽孢呈绿色，菌体呈红色。,2,、鞭毛染色,（,1,）菌种的准备,要求用活跃生长期菌种作为鞭毛染色的观察。,（,2,）载玻片的准备,将载玻片在含适量洗义粉的水中煮沸约,20min,取出用清水充分洗净，沥干水后备用，（也可置,95%,乙醇中，用时取出在火焰上烧去酒精及可能残留的油迹。,（,3,）,制片,在载玻片的一端滴一滴蒸馏水，用接种环挑取少许备用的菌苔，最好从菌落的边缘取菌苔，注意不要挑上培养基，在载玻片的水滴中轻沾几下。将载玻片稍倾斜，使菌液随水滴缓慢流到另一端，然后平放在空气中干燥,