一章分子生物学绪论.ppt

单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,Molecular Biology,第一章 绪 论,分子生物学,本章主要内容,一、分子生物学的基本含义,二、分子生物学的主要研究内容,三、分子生物学的发展简史,四、分子生物学在兽医上的应用,Why?,（一）,DNA,重组技术,目的是将不同,DNA,片段（如某个基因或基因的一部分）按照人们的设计定向连接起来，在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达，产生影响,受体细胞的新的,遗传性状,。,以,质,粒,为,载,体,的,DNA,克,隆,过,程,目 录,DNA,重组技术,1,、,可用于定向改造某些生物的基因组结构，,提高其经济价值,；,2,、可被用于大量生产某些在正常细胞代谢中产量很低的多肽,；,3,、可被用来进行基础研究,。,（二）,基因的表达调控,信号转导研究,转录因子,（,transcription factor,）,研究,RAN,剪接,信号转导研究,转录因子研究,真核生物帽子结构的加入在细胞核内完成，而且是在,RNA,链开始合成后即加入。,真核基因结构的不连续性,真核基因结构的不连续性,RNA,剪辑,RNA,剪辑,（三）生物大分子的结构功能研究,生物大分子在发挥生物学功能时，必须具备,两个前提,：,A,它拥有,特定,的,空间结构,（三维结构）,B,在它发挥生物学功能的过程中，必定存在着,结构和构象的变化,。,（四）,基因组、功能基因组与生物信息学研究,基因组,:,一个细胞（或生物体）内所有基因的组合,功能基因组学,：,研究基因组内每个基因的具体功能及其相互关系,蛋白质组计划：,后基因组计划，研究蛋白质的组成、功能,生物信息学：,以计算机为工具对生物信息进行储存、检索和分析,人染色体及其标准带纹,（常染色体和性染色体）,染色体,DNA,氨基酸,三、分子生物学简史,20世纪,70s,以后,20,世纪,50s,至20世纪,70s,1,9,世纪至,20,世纪,50,年代,改造生命的发展阶段,初步认识生命本质,建立和发展阶段,准备和酝酿阶段,（一）准备和酝酿阶段,产生了两点对生命本质的认识上的重大突破：即确定了,蛋白质是生命的主要物质基础和生物遗传的物质是,DNA,。,蛋白质是生命的主要物质基础,1897,年，,Buchner,兄弟用不含细胞的酵母,提取液，实现了发酵，提出酶是生物催化剂。,1902,年,Email Fisher,证明蛋白质结构,是多肽。,1953,年,Sanger,和,Thompson,完成了第一,个多肽分,子,-,胰岛素,A,链和,B,链的氨基酸,全序列分析。,1950,年,Pauling,和,Corey,提出了,-,角,蛋白的,螺旋结构模型。,生物遗传的物质是,基因的分子载体是,DNA,而不是蛋白质，,Bacterial,Strain,Injection,Results,Living S cells,Living R cells,Heat killed S cells,Heat killed S cells mixed with living R cells,Living S cells in blood sample from dead mouse,capsule,1928,Frederick Griffith,&1944 Oswald,Avery,Transformation of,Streptococcus pneumoniae,肺炎双球菌转化因子实验,1952年,Hershey,和,Chase,证实噬菌体,D,NA,侵染细菌,实验,（二）,现代分子生物学的建立和发展阶段,1,中心法则的建立和完善,50年代末至60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。,Jacob and Monod,2,蛋白质结构与功能的深入研究,一个碱基突变,氨基酸变异,蛋白质变异,人类疾病,（镰刀性贫血病：谷氨酸,缬氨酸）,但是，如果没有分离和富集单一,DNA,分子的技术，科学家就无法对这类物质进行直接的生化分析。,（三）初步认识生命本质并开始改造生命的深入发展阶段,两大,技术保证：,1.,DNA,的体外切割和连接,1962,年,Arber,发现限制性核酸内切酶，1967,Gellert,发现了,DNA,连接酶,DNA ligase covalently links two DNA strands,Restriction,enzyme,Restriction,enzyme,Ligase,Ligase,3,5,3,5,Herbert Boyer,Stanley Cohen,1972,年获得第一个重组,DNA,分子,Herbert Boyer,重组,DNA,实验中常见的主要工具酶,酶 类,功 能,限制性核酸内切酶,识别并在特定位点切开,DNA,DNA,连接酶,通过磷酸二酯键把两个或多个,DNA,片段连接成一个,DNA,分子,DNA,聚合酶,I,（大肠杆菌）,按,5,到,3,方向加入新的核苷酸，补平,DNA,双链中的缺口,反转录酶,按照,RNA,分子中的碱基序列，根据碱基互补原则合成,DNA,链,多核苷酸激酶,把磷酸基团加到多聚核苷酸链的,5-OH,末端（进行末端标记实验或用来进行,DNA,的连接,末端转移酶,在双链核酸的,3,末端加上多聚单核苷酸,DNA,外切酶,III,从,DNA,链的,3,末端逐个切除单核苷酸,噬菌体,DNA,外切酶,从,DNA,链的,5,末端逐个切除单核苷酸,碱性磷酸酯酶,切除位于,DNA,链,5,或,3,末端的磷酸基团,到目前为止，科学家已经几乎能随心所欲地把任何,DNA,分子切割成一系列不连续的片段，再利用凝胶电泳技术将这些片段按照分子量大小逐一分开，以供下一步研究。,1972-Paul Berg,Produced first recombinant DNA using,Eco,RI,Eco,RI recognition sites,phage DNA,Eco,RI cuts DNA into fragments,Sticky end,SV40 DNA,The two fragments stick together by base pairing,DNA ligase,Recombinant DNA,仅仅能在体外利用限制性核酸内切酶和,DNA,连接酶进行DNA,的切割和重组远不能满足基因研究的需要。,DNA,片段在体外不具备自我复制能力，要想得到足够量和足够纯度的,DNA,，必须将它们连接到具备自主复制能力的,DNA,分子上（载体上），并转入寄主细胞中进行繁殖。,这就是,基因克隆，或分子克隆。,分子克隆的载体,-,具备自主复制能力的,DNA,分子,（,vector,），,如,病毒、噬菌体和质粒等小分子量复制子都,可以作为基因导入的载体,。,从此，大肠杆菌就成了分子克隆中最常用的转化受体。,1970年,Mandel,和,Higa,发现，大肠杆菌细胞经适量氯化钙处理后，能有效地吸收,噬菌体,DNA。,1972,年，,Cohen,等人又报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细胞同样能够摄取质粒,DNA。,1973-Boyer,Cohen&Chang,Transform,E.coli,with recombinant plasmid,Stanley Cohen&Annie Chan,Herbert Boyer,Kanamycin resistance gene,Plasmid pSC101,Tetracycline resistance gene,E.coli,transformed with recombinant plasmid,Transformed cells plated onto medium with kanamycin and tetracycline,Only cells with recombinant plasmid survive to produce colonies,(1),从此，大肠杆菌就成了分子克隆中最常用的转化受体。,（2）像非洲爪蟾这样的高等生物的基因也可以被成功地转移到原核细胞中并实现其功能表达；,（3）质粒,DNA-,大肠杆菌细胞作为一种成功的基因克隆体系，有可能在重组,DNA,或基因工程研究中发挥重要作用。,DNA,的核苷酸序列分析技术,DNA,核苷酸序列分析法是在核酸的酶学和生物化学的基础上创立并发站起来的一门重要的,DNA,技术学，这门技术，,对于从分子水平上研究基因的结构与功能的关系，以及克隆,DNA,片断的操作方面，,都有着十分广泛的使用价值。,四,、,分子生物学的应用,品种改良,转基因牛,作为生物反应器,改善牛奶的品,质，提高酪蛋白,含量,转入生长激素基,因，提高产奶量,转基因羊,获得人的凝血酶原激活剂、凝血因子、尿激酶等。,改变羊毛的颜色。,转基因猪,生长激素基因,人的血红蛋白基因,提高畜牧业的生产力发展水平,分子生物学在兽医中的应用,中兽医,分子生物学在中兽医中的应用,分子生物学软件,分子生物学软件在动物医学研究中的应用,分子生物学技术,分子生物学技术在传染病中的应用,分子生物学技术在中兽医基础理论中的应,用,阴阳学说与分子生物学技术,阴阳学说贯穿于中兽医学理论体系的各个方面。对分子生物学的主要研究对象核酸和蛋白质及与其密切相关的细胞核和细胞质进行了阴阳属性的划分。核酸属阴，蛋白质属阳；胞核属阴，胞质属阳。,近几年来，我国对,cAMP,、,cGMP,与中兽医阴阳学说进行了研究。李芳生,报道，阳虚者,cAMP,水平升高；阴虚者,cGMP,水平升高。进一步分析,cAMP,、,cGMP,与阴虚和阳虚的关系可知，阳虚者表现副交感神经系统活动加强；阴虚者主要表现交感神经系统活动加强。这些研究都为推动中医理论向现代化迈进有重要意义。,素问,至真要大论,中说“谨察阴阳所在而调之，以平为期”，是中医临床诊断和治疗的基本原则。与此理论相一致，分子生物学技术研究发现，正常细胞染色体上存在非活化状态的原癌基因，同时还存在抑癌基因。如前者激活，基因异常表达；或后者缺失而不能发挥正常细胞生长调节和终止分化作用，就可导致肿瘤发生，这说明原癌基因与抑癌基因两者平衡失调对肿瘤发生起着重要作用。,脏腑学说与分子生物学技术,脏腑学说是研究动物机体各脏腑器官的生理活动、病理变化及其相互关系的学说。,肾藏精，主命门之火，是机体的先天之本。杨金蓉运用“恐伤肾”原理恐吓母鼠，造成子鼠先天肾气亏虚的动物模型，然后检验子鼠胸腺核酸含量，发现恐吓各组,DNA,、,RNA,含量及,RNA,DNA,值均有所降低，且恐吓程度越重，降低越明显。王米渠报道受惊吓母鼠所产子鼠大脑皮层厚度变薄，尤以分子层明显变薄，说明围产期紧张情绪直接影响到下一代子鼠的生长发育。用,RTPCR,技术发现肾阳虚证和下丘脑室旁核促肾上腺皮质激素的,mRNA,表达受抑，将肾阳虚证定位在下丘脑。脾统血，主运化，是机体的后天之本。王晓明等通过脾气虚证大白鼠模型及其相关抗氧化酶变化研究，提示中医认为“脾为后天之本”在生理上同分子生物学水平的抗氧化酶活性和,(,含量,),的正常，对中医“脾”的本质的现代化科学解释有一定的学术意义。这一切都说明中医脏象学说是有分子生物学基础的。,中兽医证的研究与分子生物学技术,中兽医中的同病异治、异病同治在分子生物学上的体现就是将同一疾病不同证候和同一证候不同疾病的动物进行基因图谱表达，观察分析其基因突变、异常表达同疾病的关系。从中西医结合的角度，中医证本质的含义是指引起证发生发展的物质基础，这些物质决定着证的动态变化过程。,分子生物学对于蛋白质研究的突破将为证候与蛋白质的结合研究奠定基础，在这一方面，有关蛋白质芯片的深入研究和纳米技术的使用将为蛋白质的研究与中医证候的研究提供发展的契机。而证候一基因组学也是中医现阶段研究的一个重要课题，将宏观的中医证候与微观的基因功能相联系。为中医证候的现代化研究提供了新的探索路径。,发现“阳虚”动物骨髓细胞,DNA,合成率下降，认为中医肾主骨生髓藏精理论与促进核酸蛋白质代谢有关。,通过对中药抗衰老作用机制的研究发现端粒长度缩短与衰老有关。端粒是线形染色体末端的特殊结构，含有,DNA,高度重复序列，随着细胞的衰老，血液及结肠黏膜细胞中端粒的平均长度在不断减少，抗衰老中药的作用可能表现在对端粒,DNA,重复序列有保护作用。而中药通过提高,DNA,的修复能力、清除自由基、增强神经生长因子,(NCF),受体等作用来达到抗衰老之目的。,分子生物学技术在中药研究中的应用,1994,年，,Wilkins,和,Williams,首先提出了蛋白质组。化学蛋白质组学是利用化学小分子直接从功能角度切入蛋白质组的研究，通过化学小分子处理前后的差异蛋白质组展示，研究蛋白质的翻译后修饰过程。这种研究模式为中药对机体的作用机制提供了研究平台。,分子生物学技术应用于中药药理的研究开始于中药单体的研究，集中于人参三醇皂苷、云芝多糖等中药单体对细胞内相关因子及受体,mRNA,转录、基因表达上有调控作用。对于中药复方的研究尚处于起步阶段。我国学者曾对人参、黄芪、青蒿、淫羊藿、银耳、灵芝等药物对体内重要的细胞因子,(ILl,、,IL,一,2,、,IL,一,3,、,IL,一,6,、,TNF,等,),的基因表达调控机体的免疫反应做了探讨。曹颖英等应用斑点杂交法研究表明，淫羊藿苷,(ICA),可促进刀豆蛋白,(ConA),诱导的淋巴细胞,IL,一,3 mRNA,、,IL,一,6 mRNA,的表达初步阐明了,ICA,促进某些细胞因子产生的分子机制。,2,分子生物学软件在动物医学研究中的应用,分子生物学作为基础学科，在动物医学研究领域（动物疾病发生机理、诊断与预防）中的应用不断拓展，其相关应用软件已成为广大研究人员必不可少的辅助工具，熟练掌握一套相关生物学软件的使用，可以为科研工作者节省大量宝贵的时间，并起到事半功倍的效果。,参考文献收集整理,书目资料库管理系统,v 11.0(Reference Manager v 11.0),。,Reference Manager,是一个专门设计来管理书目参考文献的资料库程序。收集参考文献和制作书目都可以使用,Reference Manager,轻易地管理资料。,目前提供新资料库可以将您收集完成的,Reference Manager,资料库放在网络环境中，可以通过网络进入您的,Web Publisher,网站检索并建立参考文献清单或输出参考文献。,实验设计与实施,本阶段包括限制酶分析、引物设计、同源序列比较、质粒作图、结构域,(motif),查找、,RNA,二级结构预测、蛋白二级结构分析、克隆策略图谱、三维结构显示、电泳条带定量分析、数据统计分析作图等方面的内容,3,分子生物学技术在传染病领域中的应用,（,1,）基因工程疫苗,重组亚单位疫苗,重组活载体疫苗,基因缺失疫苗,基因疫苗,多肽疫苗,转基因植物疫苗,应用基因工程首先研制出了伪狂犬病病,毒,(PRV),基因工程苗。最初，从胸苷激酶,TK,基因编码缺失,148,个核苷酸的病毒而,减毒，,TK,催化胸苷嘧啶脱氧核苷转化为单,磷酸形式作为核苷合成补救途径的部分物质，,认为这对病毒在细胞上增殖是极其重要的，当,在体外细胞培养系统上培养时，完全不要,TK,，,且缺失不影响病毒的生长。,然而，当在体内检测时，发现,TK,阴性病毒严重地减毒，建议这作为理想的疫苗候选株，对这株,TK,阴性突变株来说，减毒的基础是规定的和稳定的，由于减毒牵涉到基因基本组分的转移，因而转变成致病力株是不可能的，相比之下，突变株常有常规的减毒疫苗，随后，使,TK,阴性,PRV,进一步衍化，这涉及到非必需糖蛋白基因编码组分缺失，病毒糖蛋白是含有蛋白的糖，它位于许多病毒,(,或病毒感染细胞,),的表面。对抗宿主的免疫反应，在一种改进的翻译中，从,g,基因中移去,l100,个核苷酸片断。其它研究人员研制的,PRV,疫苗，缺失,TK,和,gx,基因随后建立了几个其它缺失突变株。,（,2,）兽医细菌学研究中的应用,PCR,在细菌病诊断中的应用,PCR,尤其适用于那些培养困难的细菌检测以及那些抗原,性复杂的细菌鉴定。如通过检测毒素来监测产毒素菌株,如巴氏杆菌、肉毒梭菌等。,细菌,DNA,中,G+C mo l%,含量的测定,细菌,DNA,中,G+C mo l%,含量是细菌分类鉴定的,一个重要指征,可作为细菌分类的依据和判定细菌科属,间亲缘关系的标准,同时也是新发现细菌的鉴定依据之,一。,基因探针技术,实验室中制备了多种临床应用的,DNA,探针,与,rRNA,杂交,具有高度的特异性,可检测所有,细菌纲内的细菌、一个细菌科内细菌、一个细,菌属内细菌或仅对某一个种内细菌。,Virus destroys the cell as a result of budding,基因诊断与基因治疗,标记基因 启动子 外源目的基因 终止序列,DNA-mRNA-,蛋白质性状,口蹄疫暴发后,用于医药生产的基因工程,猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测试剂盒,THE END,