中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)实验室检测.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,中东呼吸综合征冠状病毒实验室检测,参考标准,中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）实验室检测技术指南,WHO:,Laboratory,Testing,for Middle East Respiratory Syndrome,Coronavirus,：,interim,recommendations,(,revised),.(September,2014,）,US CDC,：,Interim,Guidelines for Collecting,Handling,and Testing Clinical Specimens from Patients Under Investigation(PUIs)for Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus(MERS-,CoV,)-,Version,2,3,MERS-CoV,感染标本采集对象,中东,呼吸综合征冠状病毒感染疑似病例、临床诊断病例及需要进一步研究的确诊病例,；,其它,需要,进行,MERS-,CoV,感染,诊断或鉴别诊断者,。,标本采集要求,从事,MERS-,CoV,检测标本采集的技术人员应经过生物安全,培训，培训,合格且具备相应的实验技能。在标本采集过程中，采样人员进行安全防护。,住院病例,的标本由所在医院医护人员在当地疾控机构专业人员指导下采集。,密切接触者,标本由当地疾控机构负责采集。,根据实验室检测工作的需要，结合病程,再次采样,。,5,采集标本种类和要求,呼吸道（上、下呼吸道）和其他样品（血清、尿液,和,粪便）,、,尸检,标本。,每个,病例应尽可能同时采集上、下呼吸道,标本，下,呼吸道,标本最佳，,建议同时,采集粪便和尿液标本。,应尽可能采取发病初期和恢复期双份血清标本,以,确定是否感染,，,双份血清样品间隔,1421,天采集比较理想，第一份血清应在发病第一周内采集。,但,单份样品的检测对于确定疑似病例也,有价值,，,如果,只能采集一份样品，应该在出现症状后至少,14,天采集。,MERS-CoV,感染实验室检测方法,核酸检测：,为目前早期,诊断、早期发现,MERS-,CoV,感染,病例的主要,检测,方法，采用,Real-time PCR,进行病毒核酸检测和诊断，,患者呼吸道样本中扩增,到特异性核酸，可,确诊,MERS-,CoV,感染,。传统,RT-PCR,因易出现污染使用受限，但可以获得病毒基因序列。,抗原抗体检测,:,IgM,捕获法,ELISA,检测,血清特异性,IgM,抗体,间接法,ELISA,或免疫荧光方法检测,IgG,抗体,利用假病毒进行中和抗体检测,MERS-CoV的实验室检测靶标,目前病毒核酸的检测方法主要有：检测,E,蛋白上游基因（,upE,）、ORF1b,、,ORF1a,、,N2,基因,四,种。,这些方法均高度敏感，推荐,upE,检测用于初筛,;,检测,ORF1b,基因的方法不如针对,ORF1a,的方法敏感，但比其更加特异,;N2,基因检测具有较高的灵敏性。,另外，已确定了中东呼吸综合征冠状病毒基因组中位于,RNA,依赖的,RNA,聚合酶（,RdRp,）和衣壳蛋白（,N,）基因的几个适合测序验证的靶序列。,巢式,PCR,普通,PCR,PCR,产物电泳或测序,逆转录，获得,cDNA,核酸提取,标本采集,PCR,检测,荧光定量,PCR,实验方案,待检样品,upE,特异性,RT-PCR,检测,阳性,阴性,ORF1a RT-PCR,检测,阳性,阴性,确 诊,RdRp,测序或,N,测序,阴性,抗原检测,抗体检测,病毒分离,阳性,实验流程,继续采样，如有必要应送样至有,MERS-CoV,检测经验的参比实验室进行检测,入选病例,rRT-PCR upE,基因进行筛查实验,阳性,阴性,rRT-PCR ORF1a,、,ORF1b,或,N,基因区进行确证实验,阴性,，但如果临床和流行病学证据充分，继续采样重复检测,阴性,阳性,RdRp,或,N,区测序实验,阴性,显示为其他序列,显示,MERS-CoV,确诊病例,确诊病例,upE,upE-Fwd 5-GCAACGCGCGATTCAGTT-3,upE-Rev 5,-GCCTCTACACGGGACCCATA-3,upE-Prb 5,FAM-CTCTTCACATAATCGCCCCGAGCTCG-TAMRA 3,ORF1b,ORF1b-Fwd 5,-TTCGATGTTGAGGGTGCTCAT-3,ORF1b-Rev 5,-TCACACCAGTTGAAAATCCTAATTG-3,ORF1b-Prb 5,FAM-CCCGTAATGCATGTGGCACCAATGT-TAMRA 3,ORF1a,ORF1a-Fwd 5,-CCACTACTCCCATTTCGTCAG-3,ORF1a-Rev 5,-CAGTATGTGTAGTGCGCATATAAGCA-3,ORF1a-Prb 5,FAM-TTGCAAATTGGCTTGCCCCCACT-TAMRA 3,N2,N2-Fwd 5,-GGGTGTACCTCTTAATGCCAATTC-3,N2-Rev 5,-TCTGTCCTGTCTCCGCCAAT-3,N2-Prb 5,FAM-ACCCCTGCGCAAAATGCTGGG-BHQ-3,分子检测引物与探针,Y,=-3.56x+39.19,R,2,=0.988,1e6 1e4 1e3 1e2,荧光定量RT-PCR检测结果判断,阴性,:,无,Ct,值或,Ct,为,40,。,阳性：,Ct,值,37,可报告为阳性。,Ct,值在,37-40,之间的样本建议重做,若重做结果,Ct,值,37,，该样本判断为阳性,否则为阴性。,MERS-CoV核酸检测结果报告,在实验室要确认一个样本为阳性，需要满足以下两个条件的其中一个：,至少两种,MERS-,CoV,特异性,PCR,结果阳性；,一种,PCR,结果为阳性，另外一种,PCR,产物序列测序，与,MERS-,CoV,序列相符。,当针对,MERS-,CoV,的两种不同的检测方法结果不一致的时候，应当采用反转录,PCR,扩增，对扩增产物进行测序以确认检测结果。,检测结果判读,阴性结果也不能排除临床病人的感染，一些因素可能产生假阴性，包括：,样本质量差，比如口咽等部位的呼吸道样本；,样本收集的过早或过晚；,没有正确的保存、运输和处理样本；,技术本身存在的原因，如病毒变异PCR,抑制等。,当,PCR,检测结果为阴性，但临床表现和流行病学特点提示是,MERS-,CoV,感染时，可采用血清学方法进行检测。双份血清标本能够满足血清学检测的要求。,我国首例输入性中东呼吸综合征病例的实验室快速确诊,2015,年,5,月,27,日晚,10,时世界卫生组织向中国卫生计生委通报，韩国,1,例确诊中东呼吸综合征（,MERS,）病例的密切接触者经香港入境广东省惠州市。,5,月,28,日下午，经广东省疾控中心对病例标本进行核酸检测，初筛结果为阳性。,样本接收时间：,2015.5.29,日凌晨,1,点,40,分（中国疾控中心病毒病所）,实验室确诊结果上报：,2015.5.29,日凌晨,5,点,40,分,疑似,MERS-CoV,感染的实验室快速确诊,样本来源：,KIM MYEONGSHIK(,韩国）广东省惠州市,样本类型：鼻咽拭子,(3,份）血清,(1,份）,采样日期：,2015.5.28,实验室复核检测流程：,BSL-3,实验室：分装灭活,BSL-2,实验室：核酸提取,荧光定量,RT-PCR(,三个靶标,UpE,、,ORF1b,和,N2),结果判定与报告,广东省,CDC,疑似,MERS-CoV,感染的复核检测,UpE,检测扩增曲线,ORF1b,检测扩增曲线,N2,检测扩增曲线,疑似,MERS-CoV,感染的送检样本复核检测,荧光定量,RT-PCR,检测结果（,Ct,值结论,采用,upE,/ORF1b/N2,三个靶标，进行三种荧光定量,RT-PCR,扩增，在对照成立的基础上，三管咽拭子样本检测结果皆为阳性。,基于,N2,靶标的荧光定量,RT-PCR,扩增，血清标本呈弱阳性。,结论：广东疑似,MERS-,CoV,病人实验室检测确定为,MERS-,CoV,感染阳性。,上海辉瑞合作研发试剂盒（单管双靶标）应用验证,MERS-CoV,RNA,双色检测试剂盒,ORF1b/upE,（,FAM/VIC,）,1 3,4 2,基于浊度仪和羟基萘酚蓝颜色变化的简单快速和灵敏的环介导逆转录等温扩增技术,RT-LAMP,检测方法的特异性浊度图和显色图,特异性高，检测下限分别为每管反应,500,与,1000,拷贝，有望应用于,MERS-CoV,感染的快速筛选，具有在基层医疗卫生机构和现场推广和应用的潜力,RT-PCR扩增RdRp或N基因后测序检测MERS-CoV,RdRpSeq assay:,EMC-SeqRdRP-Rev:GCA TWG CNC WGT CAC ACT TAG G,EMC-SeqRdRP-Fwd:TGC TAT WAG TGC TAA GAA TAG RGC,EMC-SeqRdRP-Rnest:CAC TTA GGR TAR TCC CAW CCC A,W=A/T,N=A/C/T/G,R=A/G,Fragment size:first round:242bp(including primers),second round 228 bp(including primers),Nseq assay:,EMC-SeqN-Fwd:CCT TCG GTA CAG TGG AGC CA,EMC-SeqN-Rev:GAT GGG GTT GCC AAA CAC AAA C,EMC-SeqN-Fnest:TGA CCC AAA GAA TCC CAA CTA C,Fragment size:first round:306-312 bp(including primers),second round 279-285 bp(including primers),Reference:,Corman/Mller et al.;Eurosurveillance,Volume 17,Issue 49,06 December 2012,通用引物检测冠状病毒,冠状病毒通用引物,RT-PCR,扩增产物电泳,One-step RT-PCR assays(OneStep RT-PCR kit,；,QIAGEN),反应条件：,1.,反转录,:50,for 30min,2.PCR,扩增,:95,for 15 min(,激活,),，,50 cycles(30 sec at 94,；,30 sec at 48,；,1min at 72,),，最后延伸,72,for 10min,。,引物对序列：,Cor-FW(5-ACWCARHTVAAYYTNAARTAYGC-3)Cor-RV(5-TCRCAYTTDGGRTARTCCCA-3),28,IFA抗原片检测MERS-CoV特异抗体,29,中和抗体检测,利用,MERS-CoV,假病毒体系进行中和抗体检测，实验操作简单而不受,BSL-3,实验室的限制（,Virology Journal.2013;10(1):266),。,中国CDC目前实验室检测相关技术储备与培训,已引进,MERS-,CoV,病毒毒株；,建立分子检测,技术，形成,SOP,，成功完成了广东,MERS-,CoV,疑似病例的实验室复核工作，完成病毒全基因组的测序；,建立,MERS-,CoV,假病毒检测中和,抗体的技术；,撰写并,颁布,中东呼吸综合征冠状病毒（,MERS-,CoV,）实验室检测技术指南,；,组织,召开,2,期全国,中东呼吸综合征冠状病毒（,MERS-,CoV,）实验室检测技术,培训班，参与,培训人员来自中国疾控中心与各省市疾控中心及不明原因肺炎网络实验室管理与,技术人员，并,发放检测,试剂盒数千,人份。,谢谢,