培养基整体性能评估与快速检测技术.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,培养基整体性能的评估与快速检测技术的应用,广东省微生物研究所,广东环凯微生物科技有限公司,Jiwen.y,公司简介,广东省科学院微生物研究所控股的国家级高新技术企业。国家食品卫生标准委员会微生物标准协作组的成员，承担起草食品安全国家标准GB478.28培养基和试剂质量控制方法。,起草GB/T 8538-2008 饮用天然矿泉水检验方法及多项地方微生物检验标准。,中国微生物学会培养基学组成员。,公司生产研发基地总建设面积达12000m,2,，拥有GMP生产车间和6条先进生产线。,拥有华南地区最大的菌种资源保存中心。,主要产品,微生物干燥培养基,标准化微生物干燥培养基,抗干扰微生物培养基,显色微生物培养基,一次性成品培养基,标准菌株,微生物生化鉴定盒,HKM-MID生化鉴定系统,HKM乳胶凝集快速鉴定系统,霉菌、大肠菌群计数卡,系列培养基产品,食品卫生微生物国家标准（GB4789）全系列,天然矿泉水微生物国家标准（GB8537)全系列,生活饮用水微生物检测标准全系列,美国FDA,EP，ISO，USP,SN标准全系列,中国药典全系列,化妆品检验系列,培养基、试剂质量控制-GB4789.28,修订依据：,ISO/TS 11133-1：2009；,ISO/TS 11133-2：2003；,评估培养基整体性能的指标：,理化指标；,微生物学指标。,微生物学评估方法-使用一套合适的质控菌株进行测试,定量法培养基生产厂家或对培养基质量有特殊要求的实验室对培养基质控；,半定量法实验室对培养基的质控；,定性法实验室对培养基的质控。,质控菌株的要求,具典型反应特性的生长良好的阳性菌株；,弱阳性菌株（对培养基中选择剂等试剂敏感性强的菌株）；,不具有该特性的阴性菌株；,部分或完全受抑制的菌株；,固体培养基的生长率测试-定量法,选择合适稀释度的质控菌悬液(目标菌)0.1mL，均匀涂布接种于待测平板和,参比,平板。每一稀释度接种两个平板。并按标准规定的培养条件培养平板。,计算生长率P,R,：,P,R,=N,S,/N0,P,R,：生长率。,N,S,：待测培养基平板上得到的菌落总数。,N,0,：参比培养基平板上获得的菌落总数(该菌落总数应100CFU)。,固体培养基的生长率测试-半定量法,将质控菌株接种到非选择性肉汤培养过夜。,用1ul接种环按图划线接种：,计算生长指数G：,每条有比较稠密菌落生长的划线则,G,为,1,，每个培养皿上,G,最大为,16,。,如果仅一半的线有菌落生长，则,G,为,0.5,。,如果划线上没有菌落生长或生长量少于划线的一半，则,G,为,0,。,记录每个平板的得分总和便得到,G,。,固体培养基的生长率测试-定性法,将质控菌株接种到非选择性肉汤培养过夜。,用1ul接种环取测试菌培养物在测试培养基表面划平行直线（细菌），或用接种针直接挑取斜面培养物点种接种（霉菌）。并按标准规定的培养条件培养平板。,培养后按以下方法对培养基计分：,0 表示无生长；,1 表示微弱生长；,2 表示生长良好。,固体培养基生长率评价标准,非选择性固体培养基和固体,计数,培养基P,R,值应不小于0.7；G值应大于6。,选择性固体培养基P,R,值一般应不小于0.5，最低应为0.1。,选择性,计数,固体培养基上目标菌的生长率一般不小于0.7。,定性法目标菌得分应为2。,固体培养基选择性测试-半定量法,将质控菌株接种到非选择性肉汤培养过夜。,用1l接种环取选择性测试工作菌悬液1环，在待测培养基表面划六条平行直线(如图)，同时接种两个平板，划线时可在培养基下面放一个模板图，按标准规定的培养条件培养平板。,固体培养基选择性测试-半定量法,计算G：,每条有比较稠密菌落生长的划线则G为1，每个培养皿上最多为6分。,如果仅一半的线有菌落生长，则G为0.5。,如果划线上没有菌落生长或生长量少于划线的一半，则G为0。,评价标准：,G应小于6。,固体培养基生化特性测试-定性法,分别观察质控菌株(包括目标菌和非目标菌)在培养基上形态、颜色及生化特征。,评价培养基的指示系统是否正常。,GB4789.28规范性附录F-表F.1,培养基,状态,功能分类,质控指标,培养条件,质控菌株,参比培养基,方法,质控评定标准,特征性反应,亚硫酸铋琼脂(BS),固体,选择性分离,生长率,361/,40h48h,伤寒沙门菌CMCC(B)50071,TSA,定量,P,R,0.5,棕色或绿色菌落,鼠伤寒沙门菌ATCC14028,选择性,大肠埃希菌ATCC 25922,_,半定量,G1,_,粪肠球菌ATCC 29212,_,HE琼脂,固体,选择性分离,生长率,361/,18h24h,鼠伤寒沙门菌ATCC14028,TSA,定量,P,R,0.5,绿-蓝色菌落，有黑心,福氏志贺菌CMCC(B)51572,绿-蓝色菌落,选择性,大肠埃希菌ATCC 25922,_,半定量,G6,_,粪肠球菌ATCC 29212,G1,_,来自广东省CDC的评估报告-,目标质控菌株在不同厂家培养基上生长率的比较 2009.112010.10,培养基,生产厂,测试菌株,检测菌株数,生长率P,R,F值,P值,XLD琼脂,HK,鼠伤寒沙门菌,CMCCB)50115,60,0.9640.095,18.52,0.000,X,20,0.8520.117,HK,福氏志贺菌,CMCC(B)51572,60,0.7710.114,-5.486,0.000,X,20,0.4480.199,HE琼脂,HK,鼠伤寒沙门菌,CMCCB)50115,60,0.9270.089,-4.233,0.000,X,20,0.7840.162,HK,福氏志贺菌,CMCC(B)51572,60,0.6830.155,-4.636,0.000,X,20,0.4690.112,沙门显色培养基,HK,鼠伤寒沙门菌,CMCCB)50115,60,0.8760.054,12.067,0.001,X,20,0.8250.066,注：X为国外某品牌培养基生产厂家。,来自广东省CDC的评估报告-,目标质控菌株在不同厂家培养基上生长率的比较,2009.112010.10,培养基,生产厂,测试菌株,检测菌株数,生长率P,R,F值,P值,TCBS琼脂,HK,副溶血性弧菌,ATCC17802,60,0.6190.211,-1.195,0.232,X,20,0.5360.280,HK,霍乱弧菌VbO,60,0.5280.261,-2.874,0.000,X,20,0.2120.193,弧菌,显色培养基,HK,副溶血性弧菌,ATCC17802,60,0.8960.062,6.325,0.000,X,20,0.6280.125,HK,霍乱弧菌VbO,60,1.1820.108,4.860,0.030,X,20,1.1160.137,来自广东省CDC的评估报告-,野生分离目标菌株在不同厂家培养基上生长率的比较,2009.112010.10,培养基,生产厂,测试菌株,检测菌株数,生长率P,R,F值,P值,XLD琼脂,HK,沙门菌野生分离株,10,0.9640.095,6.488,0.020,X,10,0.8520.117,HK,志贺菌野生分离株,10,0.468 0.279,1.173,0.293,X,10,0.3090.371,HE琼脂,HK,沙门菌野生分离株,10,1.0020.076,4.473,0.049,X,10,0.9270.089,HK,志贺菌野生分离株,10,0.3860.265,1.042,0.321,X,10,0.2710.238,沙门菌显色培养基,HK,沙门菌野生分离株,10,0.8840.096,6.205,0.023,X,10,0.7260.176,来自广东省CDC的评估报告-,野生分离目标菌株在不同厂家培养基上生长率的比较,2009.112010.10培养基,生产厂,测试菌株,检测菌株数,生长率P,R,F值,P值,TCBS琼脂,HK,副溶血性弧菌野生分离株,10,0.6430.234,12.211,0.003,X,10,0.3290.161,HK,霍乱弧菌野生分离株,10,0.5000.167,48.998,0.000,X,10,0.0920.079,弧菌显色,培养基,HK,副溶血性弧菌野生分离株,10,0.9300.064,0.14,0.908,X,10,0.9330.049,HK,霍乱弧菌野生分离株,10,1.1980.134,4.339,0.052,X,10,1.0820.115,来自广东省CDC的评估报告-,不同生产厂家培养基对非目标质控菌株的选择性比较 2009.112010.10,培养基,生产厂,测试菌株,检测份数,生长情况(份),F值,P值,0,1,XLD琼脂,HK,粪肠球菌 ATCC29212,60,57,3,0.000,0.995,X,20,19,1,HE琼脂,HK,粪肠球菌 ATCC29212,60,60,0,X,20,20,0,沙门显色培养基,HK,粪肠球菌 ATCC29212,60,60,0,X,20,20,0,TCBS琼脂,HK,大肠埃希菌 ATCC25922,60,60,0,X,20,20,0,弧菌显色培养基,HK,大肠埃希菌 ATCC25922,60,60,0,X,20,20,0,来自广东省CDC的评估报告-,不同生产厂家培养基对非目标质控菌株的选择性比较 2009.112010.7,培养基,测试菌株,生产厂,检测份数,菌落生理、生化特征,XLD琼脂,鼠伤寒沙门菌CMCC(B)50115,HK,60,黑心、无色、半透明菌落,X,20,黑心、无色、半透明菌落,福氏志贺菌CMCC(B)51572,HK,60,无色、半透明菌落,X,20,无色、半透明菌落,HE琼脂,鼠伤寒沙门菌CMCC(B)50115,HK,60,黑心、无色、半透明菌落,X,20,黑心、无色、半透明菌落,福氏志贺菌CMCC(B)51572,HK,60,无色、半透明菌落,X,20,无色、半透明菌落,沙门菌显色培养基,鼠伤寒沙门菌CMCC(B)50115,HK,60,紫红、中等大小菌落,X,20,紫红、中等大小菌落,来自广东省CDC的评估报告-,不同生产厂家培养基对非目标质控菌株的选择性比较 2009.112010.7,培养基,测试菌株,生产厂,检测份数,菌落生理、生化特征,TCBS,琼脂,副溶血性弧菌,ATCC17802,HK,60,绿色、中等大小菌落,X,20,绿色、中等大小菌落,霍乱弧菌VbO,HK,60,黄色、中等大小菌落,X,20,黄色、中等大小菌落,弧菌显色培养基,副溶血性弧菌,ATCC17802,HK,60,紫红、中等大小菌落,X,20,紫红、中等大小菌落,霍乱弧菌VbO,HK,60,蓝绿色、中等大小菌落,X,20,蓝绿色、中等大小菌落,来自广东省CDC的评估报告-,不同批间培养基的稳定性测试2009.112010.10,培养基,厂家与批次,测试菌株,检测,份数,生长率P,R,F值,P值,HE琼脂,HK 09110104Y,鼠伤寒沙门菌CMCC(B)50115,20,0.9290.097,0.012,0.989,HK 09110204Y,20,0.9260.094,HK 09110304Y,20,0.9250.080,HK 09110104Y,福氏志贺菌CMCC(B)51572,20,0.6780.152,0.069,0.934,HK 09110204Y,20,0.6940.168,HK 09110304Y,20,0.6780.152,XLD琼脂,HK 09102301Y,鼠伤寒沙门菌CMCC(B)50115,20,0.9670.901,0.159,0.853,HK 09102401Y,20,0.9730.102,HK 09102501Y,20,0.9620.089,HK 09102301Y,福氏志贺菌CMCC(B)51572,20,0.7810.122,0.141,0.868,HK 09102401Y,20,0.7710.097,HK 09102501Y,20,0.7610.126,来自广东省CDC的评估报告-,不同批间培养基的稳定性测试2009.112010.10,培养基,厂家与批次,测试菌株,检测,份数,生长率P,R,F值,P值,沙门显色培养基,HK 09110104Y,鼠伤寒沙门菌CMCC(B)50115,20,O.8790.040,0.709,0.496,HK 09110204Y,20,O.8760.055,HK 09110304Y,20,0.8750.067,弧菌显色培养基,HK 10072101Y,副溶血性弧菌 ATCC17802,20,0.8970.066,0.018,0.982,HK 10072304Y,20,0.8940.051,HK10072401Y,20,0.8970.070,HK 10072101Y,霍乱弧菌VbO,20,1.1850.1030.23,0.795,HK 10072304Y,20,1.1690.105,HK10072401Y,20,1.1920.120,小结,目标菌(目标质控菌和野生分离株)在受试培养基上的生长率(P,R,均0.5)高于对照的培养基，经统计学分析，差异有显著性(P0.05)。,质控菌株在受试培养基上呈现正常的特征性反应，与对照培养基完全。,不同批次培养基之间的整体性能差异无显著性(P0.05)。,结论,依据ISO/TS11133.2-2003培养基的性能评价标准判断，受试培养基符合标准要求，整体性能稳定、一致。,GB4789中快速检测技术的应用,显色培养基,沙门菌；,志贺菌；,副溶血性弧菌；,O157：H7大肠埃希菌；,单增李斯特菌；,阪崎肠杆菌；,大肠杆菌计数。,商品化的微生物生化鉴定系统,全自动微生物生化分析系统；,数值编码的微生物生化鉴定条。,显色培养基,显色培养检测基本原理：利用不同种属细菌代谢所产生的酶的特异性，在培养基中加入相应的特异性酶底物和抑制剂，当具有某特异酶的细菌与酶底物作用时，使显色基团游离出来附着于菌落上，形成颜色独特的菌落。根据菌落的颜色直接对菌属(种)作出鉴定。,显色培养基的优势,快速、简便、节省时间-大多数显色培养基只需在样品增菌后，分离培养1824h，即可根据菌落的颜色作出初步的鉴定。(阴性-弃去；阳性-进一步鉴定)。,结果直观，一目了然(根据颜色判定结果)。,灵敏度高、特异性强，大大减少了后续的鉴定步骤(确证试验)。,显色培养的缺陷,假阳性：,97%的大肠埃希氏菌含有-葡萄糖苷酶，约10%的沙门氏菌属中也含有此酶。,假阴性：,O157：H7大肠埃希氏菌不产生-葡萄糖苷酶。另外，不是所有具有特征性酶的微生物均在含底物的培养基中阳性反应。,与普通选择性培养基比较，显色培养基的假阳性、假阴性的机率相对要低得多。,目标菌在显色培养基上生长率的比较,显色培养基,厂家,目标菌,生长率P,R,沙门菌显色培养基,HK,鼠伤寒沙门菌 ATCC14028,0.92,进口,0.62,阪崎肠杆菌显色培养基,HK,阪崎肠杆菌ATCC29544,0.92,进口,0.86O157大肠杆菌显色,培养基,HK,大肠埃希氏菌,O157,：,H7 NCTC12900,0.78,进口,0.53,弧菌显色培养基,HK,副溶血性弧菌ACC17802,0.93,进口,0.54,MUG-VRB,HK,大肠埃希菌ATCC25922,1.08,进口,0.7,显色培养基对非目标菌的选择性比较,显色培养基,厂家,非目标菌,生长情况,沙门菌显色培养基,HK,大肠埃希菌ATCC25922,不生长,进口,不生长,阪崎肠杆菌显色培养基,HK,粪肠球菌ATCC29212,不生长,进口,不生长,O157大肠杆菌显色培养基,HK,大肠埃希氏菌,ATCC29522、,粪肠球菌ATCC29212,不生长,进口,不生长,弧菌显色培养基,HK,大肠埃希菌ATCC25922,不生长,进口,不生长,MUG-VRB,HK,粪肠球菌ATCC29212,不生长,进口,不生长,非目标菌在显色培养基上的特征性反应比较,显色培养基,厂家,非目标菌,菌落颜色,沙门菌显色培养基,HK,奇异变形杆菌CMCC(B)49005,大肠埃希菌ATCC25922,奇异变形杆菌CMCC(B)49005,大肠埃希菌ATCC25922,无色,进口,蓝绿色,无色,蓝绿色,阪崎肠杆菌显色培养基,HK,普通变形杆菌CMCC(B)49027,大肠埃希菌ATCC25922,普通变形杆菌CMCC(B)49027,大肠埃希菌ATCC25922,无色,进口,无色,无色,无色,O157大肠杆菌显色培养基,HK,大肠埃希氏菌,ATCC29522,蓝绿色,进口,蓝绿色,弧菌显色培养基,HK,霍乱弧菌VbO,蓝绿色,进口,蓝绿色,MUG-VRB,HK,弗氏柠檬酸杆菌ATCC43864,无荧光,进口,无荧光,来自河南CDC的验证-,二种沙门菌显色培养基实际应用效果比对研究,样品,n,CHROMagar,HKM,有可疑菌落样品数,确认阳性样品数,阳性分离率(%),有可疑菌落样品数,确认阳性样品数,阳性分离率(%),生鸡肉,86,47,47,54.65,56,56,65.12,生猪肉,76,8,8,10.53,10,8,10.53,鸡肛拭子,48,8,8,16.67,10,8,16.67,合计,210,63,63,30.00,76,72,34.29,结果,沙门氏菌在HKM沙门菌显色培养基上较CHROMagar沙门菌显色培养基菌落大，色泽浓，数量相似；,对162份生肉食品检测，HKM沙门菌显色培养基阳性分离率为39.51，CHROMagar沙门菌显色培养基阳性了率为33.95，二者无显著性差异；,48份鸡肛拭子样品，二者检出率相同，无差异；,HKM沙门菌显色培养基的假阴性率低于CHROMagar沙门菌显色培养基（2.38和6.67），但二者无显著性差异。,微生物生化鉴定系统,生化鉴定条：,操作简便，不需仪器完成实验；,提供庞大的鉴定数据库进行数值分类鉴定；,良好的鉴定效果；,快速报告。,HKM-MID细菌生化鉴定条,MID革兰阴性杆菌生化鉴定条(,MID-GNA、MID-GNB,),GN A+B主要用来鉴定非苛养革兰氏阴性杆菌（包括氧化酶阴性和阳性菌），共包括28个属。,GNA主要用来鉴定非苛养革兰氏阴性杆菌(氧化酶阴性)，共9个属(不动杆菌属、肠杆菌属、埃希菌属、克雷伯菌属、沙雷菌属、变形杆菌属、志贺菌属、沙门菌属、小肠结肠炎耶尔森菌等)。,免费提供数据库软件。,检测原理,GN A和GN B鉴定条均分别由12个含干燥培养基的小管组成；,将需鉴定的菌悬液接种于小管中。培养一定时间后，通过代谢作用(或是加入配套试剂后)所产生的颜色变化，进行数值编码；,根据数据库提供的资料，判定结果。,HKM-MID细菌生化鉴定条操作程序,第一步：,挑取可疑菌落纯培养物(或单个菌落)于35mL灭菌生理盐水中制备成菌悬液。并按说明书要求作氧化酶试验，根据结果选用鉴定条。,1,2,第二步：,小心的打开鉴定条的粘性封口膜，用无菌滴管加3-4滴（约100微升）菌悬液至每个小管，按说明书在需滴加矿物油的小管加入矿物油。,3,4,第三步：,用粘性封口膜封住管口，放至35-37的培养箱中培养1824h。,5,第四步：,结果判读：参考说明表及反应结果对照卡读GN A和GN B的反应结果。,6,第五步：,将每三个反应分为一组，每组中反应底物下面均标有1、2、4数值，将每组中阳性反应对应的数值加起来，将得到一个四位数（GN A）、或者八位数（氧化酶阴性GN A+B）或者九位数（氧化酶阳性GN A+B），将这个数值输入选择的GN A或GN A+B电脑鉴定软件系统，将得到鉴定结果；鉴定结果将显示五个最有可能的结果，以及每个结果的可能性几率以及相似性。并且对鉴定结果给予总的评价。,7,第六步：软件检索,将结果编码输入电脑,样品信息区,可选的数值输入,自动提示,可疑测试,可能的,错误测试提示,广泛的结果分析,概率,百分比概率,可能性,可疑测试,第七步：报告结果,HKM-MID常用生化鉴定条,HKM-MID产品：,革兰阴性杆菌鉴定系统；,葡萄球菌鉴定系统；,李斯特菌鉴定系统(经AOAC验证)；,芽胞杆菌鉴定系统；,链球菌鉴定条系统。,常用的MID鉴定条鉴定结果,副溶血性弧菌,沙门菌,阪崎肠杆菌,单核细胞增生李斯特菌,菌株,测试菌数,API,MID GN A,E.coli,大肠埃希氏菌,43,43,43,Shigella spp,.志贺菌属,4,4,4,S.sonnei,宋内志贺氏菌,3,3,3,K.pneumoniae,肺炎克雷伯氏菌,13,13,13,K.oxytoca,产酸克雷伯菌,11,11,11,E.cloacae,阴沟肠杆菌,8,8,7,E.aerogenes,产气肠杆菌,3,3,3,S.marcescen,粘质沙雷菌,2,22,C.freundii,弗氏柠檬酸杆菌,9,9,9,C diversus,差异柠檬酸杆菌,2,2,2,H.alvei,蜂房哈夫尼菌,1,1,1,P.mirabilis,奇异变形杆菌,11,11,11,P.vulgaris,普通变形杆菌,2,2,2,P.stuartii,斯氏普罗威登斯菌,2,2,2,Salmonella spp,.沙门氏菌,83,83,83,总共,197,197,196,HKM-MID GNA 与API20E鉴定结果比较,HKM乳胶凝集快速鉴定系统,原理：,乳胶凝集试验是以乳胶微粒为载体的间接凝集试验；,用人工方法将抗体包被于与免疫无关的大分子乳胶颗粒上；,利用抗原抗体特异性结合的特性，当致敏的乳胶颗粒与待检细菌的菌悬液混合后，迅速形成肉眼可见的凝集团块，用于筛选鉴定可疑菌。,乳胶凝集试验的优势,特异、敏感；,操作简便、快速；,结果易判读。,常用的,HKM乳胶凝集快速鉴定系统,李斯特菌（listeria）,沙门氏菌（salmonella）,弯曲杆菌（camylobacter）,大肠杆菌O157（E.coli O157）,军团菌（legionella）,葡萄球菌（staph）,HKM 金黄色葡萄球菌乳胶凝集试剂盒操作步骤,将可疑菌落涂布于检测板的反应环内。,HKM 金黄色葡萄球菌乳胶凝集试剂盒,滴加1滴乳胶测试试剂。,HKM 金黄色葡萄球菌乳胶凝集试剂盒,用搅拌棒混匀5-10秒钟,HKM 金黄色葡萄球菌乳胶凝集试剂盒,轻轻摇动检测板，2分钟。,HKM 金黄色葡萄球菌乳胶凝集试剂盒,观察凝集结果。,产生凝集反应(阳性),阴性反应,阳性对照,阴性对照,快速检测技术应用案例分析,基本情况：,2003.9.23上午8时，当地CDC接报22日晚10时左右某市第4中学有29名学生因发热、恶心、呕吐、腹痛、腹泻到医院就诊。到23日上午10时已有96人患病。,23日下午14时，该市与第4中学邻近的一个镇，出现相同症状的病人，病人主要是当地居住的村民。,23日晚上22时左右，两地共有,236,人就诊。,主要症状：,发热：39以上5%，39以下75%；,腹泻91.7%，腹痛82.9%；,恶心44.8%，呕吐41.7%，头痛9.4%。,流行病学调查报告：,第4中学22日7时30分左右，早餐供应,凉拌河粉,，午餐除继续供应,河粉,外，还有米饭、猪肉炒菜、豆腐、咸萝卜。,发病村民均在22日或23日进食过,河粉,。,河粉由某镇生产点生产，9.21晚生产了800斤。22日早上6时30份供应第四中学450斤，其余由4名小贩在附近销售。,该生产点卫生状况差，盛粉的容器及生产用具4天清洗一次，盛粉的容器旁放着猪饲料桶，生产点与猪圈相连。,首例发病潜伏期：15h。,实验室接收第一批样本的时间：,23日下午17时30分。,样本种类：,呕吐物2份；,病人肛拭子37份；,剩菜、豆腐各1份；,家庭用井水、自来水各1份；,食用油、生产河粉的工具拭子等4份；,共46份样品。,23日下午17时30分：,通过对流行病学调查报告分析：,确定重点关注的样本：河粉生产工具拭子、呕吐物、肛拭子。,确定检测的方向：由患者的临床症状和发病潜伏期,提示感染性腹泻可能性较大,。,将肠道致病菌列为重点检测方向。,根据对生产现场卫生状况的分析，,将沙门氏菌列为重点中的重点,。,实验室检验-,23日下午17时30分,直接分离：取呕吐物、肛拭子、用具拭子直接划线分离于DHL、HE、沙门菌显色培养基、弧菌显色培养基、大肠杆菌O157显色培养基、血平板和普通营养琼脂平板。,增菌培养：SC、肠增、GN、7.5%NaCl肉汤、1%葡萄糖肉汤、LB1、3.5%NaCl结晶紫。,按标准要求温度培养。,初步结果观察-,24日上午8时30分,直接分离的平板,DHL：绝大部分菌落为粉红色，菌落细小、数量少，但仍可见半透明、不发酵乳糖的小菌落。未见明显产H,2,S的菌落。,HE：绝大部分菌落为橙红色，菌落生长良好，可见少量半透明、绿色的菌落，个别菌落产H,2,S。,沙门显色培养基：可见紫红色可疑沙门菌菌落。,血平板：菌落生长杂乱，可见少量表面干燥、溶血的菌落。,普通营养琼脂：未见典型的蜡样芽胞杆菌可疑菌落。,O157、弧菌、李斯特显色培养基：未见可疑菌落。,增菌液：,SC、肠增、GN肉汤、1%葡萄糖肉汤生长良好；7.5%NaCl肉汤稍混浊；,LB1、3.5%NaCl结晶紫未见混浊。,实验继续-,24日上午9时：,挑取DHL、HE、沙门菌显色培养基上的可疑菌落分别接种TSI、普斜。每个平板至少挑取2个可疑菌落，每份样品至少有6个可疑菌落，以防漏检。同时确保TSI和普斜是,纯,培养物。置标准要求温度培养。,将上述生长混浊的增菌液划线分离于相应的培养基。置标准要求温度培养。,根据沙门菌显色培养基上可疑菌落的提示，取肛拭子的SC增菌液上mini VIDAS，选用SLM试条分析。,24日上午10时30分：,mini VIDAS分析结果提示：,沙门菌阳性,。,24日下午16时：,取TSI斜面培养物作A-F多价血清凝集。,取普通斜面培养物上VITEK，选用GNI,+,进行生化分析。,24日下午5时：,A-F多价血清凝集试验结果：+。单因子血清凝集试验结果：O：9，12 H：g，m。,24日晚10时：,VITEK分析结果显示99%的概率符合沙门菌，实验结束。,实验室诊断结论：,22份扛拭子、河粉的工具拭子4份沙门菌阳性；经鉴定为,肠炎沙门菌。,实验过程费时约30h。,小结：优化的食品微生物快速检验程序 (仅供参考),样品,直接分离显色培养基,增菌培养,有可疑菌落,无可疑菌落,仪器筛选(PCR、VIDAS等),分离显色培养基,弃去,无可疑菌落,弃去,有可疑菌落,阴性,阳性,分离培养,有可疑菌落,MID鉴定,、乳胶凝集鉴定、,或仪器分析,血清学鉴定,报告,谢谢!,