第五章-原核基因的表达与调控.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第五章原核生物基因的表达与调控,Expression and regulation of genes in prokaryotes,本章内容,第一节,原核基因表达调控概论,第二节,乳糖操纵元与负控诱导系统,第三节 色氨酸操纵元与负控阻遏系统,第四节 其它操纵元及其调控机制,第五节 转录水平的其他调控方式,第六节 原核生物的转录后调控,第一节 原核生物基因表达调控概论,一、原核基因表达调控的环节,二、操纵子学说,三、原核基因表达调控的类型与特点,四、弱化子对基因活性的影响,五、降解物对基因活性的调节,六、细菌的应急反应,基因表达 （,Gene expression,）,：,DNA,到蛋白质的过程,基因表达调控（,Regulation of gene expression,）：,对基因表达过程的调节,基因表达的调控系统：,不同生物可使用不同信号和机理来调控基因表达,原核生物,:,营养状况，,nutritional status,环境因素，,environmental factor,真核生物：,激素水平，,hormone level,发育时期，,developmental stage,基因表达方式：,组成型或永久型表达，,constitutive expression,诱导型或适应型表达，,induced or adaptive expression,原核与真核生物转录及翻译调控的比较,细菌,:,转录与翻译过程几乎发生在同一时间间隔内，转录与翻译偶联,真核生物：,转录产物需从核内运转到核外，才能被核糖体翻译成蛋白质,一、原核基因表达调控的环节,基因表,达调控,转录后的调控,(Post-transcriptional regulation),转录水平的调控,(Transcriptional regulation),mRNA,加工水平的调控,(Differential processing of transcripts),翻译水平的调控,(Differential translation of mRNA),基于调控发生的时期,原核生物中的转录和翻译水平的调控均以,操纵子的方式进行,二、操纵子学说（,operon,）,操纵子学说：,原核生物基因结构及其表达调控理论，基因表达调控的基础,法国巴斯德研究所,Jacob,和,Monod 1961,年提出，在,10,年内经许多科学家的补充和修正得以逐步完善,Franois Jacob,1920,年,Jacques Monod,1910,年,1976,年,1,、操纵子的提出,大肠杆菌可以利用葡萄糖、乳糖、麦芽糖、阿拉伯糖等作为碳源而生长繁殖,当培养基中含有葡萄糖和乳糖时，细菌,优先使用葡萄糖,当葡萄糖耗尽，细菌停止生长，经过短时间适应，就能利用乳糖，细菌继续呈指数式繁殖增长,法国的,Jocob,和,Monod,等人做了一系列遗传学和生化学研究实验，于,1961,年提出乳糖操纵子学说,2,、操纵子的定义,操纵子：是基因表达的协调单位，由启动子、操纵基因及其所控制的一组功能上相关的结构基因所组成。,操纵基因受调节基因产物的控制。,一个操纵子,=,编码序列（,2-6,）,+,启动序列,+,操纵序列,+(,其他调节序列,),3,、操纵子（,operon,）的基本组成,启动子,操纵序列,多个结构基因,终止子,5,3,操纵子的基本结构,转录出多顺反子,mRNA,，,翻译后得到多种蛋白质,介导转录终止,编码功能相关的蛋白质,调控区,结合,RNA,聚合,酶和调节蛋白,（,1,）启动子（,promoter,P,）,能被,RNA,聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段,DNA,序列,操纵子至少有一个启动子，一般在第一个结构基因,5,上游，控制整个结构基因群的转录,不同的启动子序列有所不同，但存在共有性序列,(consensus sequences),不同的启动子序列不同，与,RNA,聚合酶的亲和力不同、启动转录的频率高低不同,不同的启动子启动基因转录的强弱不同,例如：,PL,、,PR,、,PT7,属强启动子，而,Plac,则是较弱的启动子,（,2,）终止子（,terminator,，,T,）,给予,RNA,聚合酶转录终止信号的,DNA,序列,在一个操纵子中至少在结构基因群最后一个基因的后面有一个终止子,强终止子和弱终止子,一串结构基因群中间有弱终止子的存在，则前后转录产物的量会有所不同，这也是终止子调节基因群中不同基因表达产物比例的一种方式,抗终止作用：有的蛋白因子能作用于终止序列，减弱或取消终止子的作用，称为抗终止作用（,anti-termination,），这种蛋白因子就称为抗终止因子（,anti-terminator,）,（,3,）结构基因,操纵子中被编码蛋白质和,RNA,的基因,含有,2,个以上的结构基因，多的可达十几个,每个结构基因是一个连续的开放读框,5,端有翻译起始码，,3,端有翻译终止码,各结构基因头尾衔接、串连排列，组成结构基因群,至少在第一个结构基因,5,侧具有,SD,序列，当被转录成多顺反子,mRNA,，就能被核糖体所识别结合、并起始翻译,核糖体沿,mRNA,移动，在合成完第一个编码的多肽后，不脱离,mRNA,而继续翻译合成下一个多肽，直至合成完这条多顺反子,mRNA,所编码的全部多肽,（,4,）操纵基因,能被调控蛋白特异性结合的一段,DNA,序列，常与启动子邻近或与启动子序列重叠，当调控蛋白结合在操纵序列上，会影响其下游基因转录的强弱,并不编码蛋白质,，起着调控基因表达强弱的作用,乳糖操纵子中的操纵基因为例,操纵基因（,o,）序列位于启动子（,p,）与被调控的基因之间，部分序列与启动子序列重叠,具有回文（,palindrome,）样的对称性一级结构，能形成十字形的茎环（,stem loop,）构造,不少操纵子都具有类似的对称性序列，可能与特定蛋白质的结合相关,（,5,）调节基因（,regulatory gene,）,编码能与操纵序列结合的调控蛋白的基因,与操纵序列结合后能减弱或阻止基因转录的调控蛋白称为,阻遏蛋白（,repressive protein,），,其介导的调控方式称为,负调控,（,negative regulation,）,与操纵序列结合后能增强或起动基因转录的调控蛋白称为,激活蛋白（,activating protein,），,所介导的调控方式称为,正调控,（,positive regulation,）,调节基因,lac I,位于,Plac,邻近，有其自身的启动子和终止子，转录方向和结构基因群的转录方向一致，编码产生由,347,个氨基酸组成的调控蛋白,R,在环境没有乳糖存在的情况下，,R,形成活性四聚体，能特异性与操纵子,紧密结合，从而阻止利用乳糖的酶类基因的转录,R,当环境中有足够的乳糖时，乳糖受,-,半乳糖苷酶作用转变为别乳糖与,R,结合，使,R,的空间构像变化，四聚体解聚成单体，失去与操纵子特异性紧密结合的能力，从而解除了阻遏蛋白的作用，使其后的基因得以转录合成利用乳糖的酶类,乳糖（别乳糖）是诱导物，与,R,结合起到去阻遏作用，诱导了利用乳糖的酶类基因转录开放,许多调控蛋白都是变构蛋白（,allosteric protein,），通过与上述类似的方式与效应物结合改变空间构像，从而改变活性，起到调节基因转录表达的作用,效应物（,effector,）：,某些特定的物质能与调控蛋白结合，使调控蛋白的空间构像发生变化，从而改变其对基因转录的影响,诱导物（,inducer,）：,能诱导操纵子开启的效应物,辅阻遏,物,（,corepressor,）：,能导致操纵子关闭，阻遏转录过程的效应物,（,6,）顺式作用和反式作用,顺式作用（,cis-action,）：启动子、操纵子,位于紧邻结构基因群的上游，终止子在结构基因群之后，它们都在结构基因的附近，只能对同一条,DNA,链上的基因表达起调控作用,顺式作用元件（,cis-acting element,）：启动子、操纵子和终止子,反式作用（,trans-action,）：调节基因,可以在结构基因群附近、也可以远离结构基因，它通过其基因产物调控蛋白来发挥作用,调节基因不仅能对同一条,DNA,链上的结构基因起表达调控作用，而且能对不在一条,DNA,链上的结构基因起作用,反式作用元件（,trans-acting element,）：调节基因,反式调节因子（,trans-acting factor,）：其编码产生的调控蛋白,三、原核基因调控机制的类型与特点,基因表达调控,正转录调控,(Positive trans cription regulation),负转录调控,(Negative trans cription regulation),正控诱导,正控阻遏,负控诱导,负控阻遏,基于调控机制,基于作用特征,基于作用特征,激活,(,阻遏）蛋白是否结合,DNA,正调节,负调节,是,开启,关闭,否,关闭,开启,1,、根据操纵子对调节蛋白（阻遏蛋白或激活蛋白）的应答，可分为：,正,转录调控,负,转录调控,可诱导调节,：某些物质的诱导下使基因活化,操纵子常常是关闭的，主要是一些编码糖和氨基酸分解代谢酶的基因，这些糖和氨基酸平时含量少，一旦生存条件发生变化，可以,开启基因的表达,例：,大肠杆菌的乳糖操纵子2,、根据操纵子对某些能调节它们的小分子的应答，可分为可诱导调节和可阻遏调节两大类：,分解代谢酶合成的诱导操纵子模型,诱导物：与阻遏蛋白结合，改变其构型,能够促使细菌产生酶来分解它，这种物质就是,诱导物,。,可阻遏调节：,基因常常是开启的，主要是一些合成各种细胞代谢过程中所必须的小分子物质的基因，由于这类物质在生命活动中的重要地位，操纵子呈开启状态；,由于一些特殊代谢物或化合物的积累而将其关闭，,阻遏了基因的表达,例：色氨酸操纵子,合成代谢蛋白的基因,酶合成的阻遏操纵子模型,辅阻遏物,由于某物质的结合使无活性的阻遏物激活，便阻止细菌蛋白的合成，这种物质为辅阻遏物。,3.,在负转录调控系统中，调节基因的产物是阻遏蛋白（,repressor,），阻止结构基因的转录,分为负控诱导和负控阻遏,负控诱导系统中，阻遏蛋白与诱导物结合，使结构基因转录；,负控阻遏系统中，阻遏蛋白与辅阻遏物结合时，阻止结构基因的转录,4.,在正转录调控系统中，调节基因的产物是激活蛋白（,activator,）,正控诱导和正控阻遏,正控诱导系统中，诱导物的存在使激活蛋白活化；,正控阻遏系中，辅,阻遏物,的存在抑制激活蛋白的活性,负控诱导系统,负控阻遏系统,正控诱导系统,正控阻遏系统,对,比,四、弱化子对基因活性的影响,弱化子,（,attenuation,）：当操纵子被阻遏、,RNA,合成终止时，,起终止转录信号作用的的一段核苷酸,调节方式：核糖体在转录本上的位置,决定了,RNA,形成的二级结构,从而决定基因能否继续转录,调节信号分子,:,细胞中某一氨基酸、嘧啶或氨酰,-tRNA,的浓度,五、降解物对基因活性的调节,降解物抑制作用（葡萄糖效应）：,在葡萄糖存在时，细菌不利用乳糖、半乳糖、阿拉伯糖或麦芽糖等，与其相对应的操纵元也不启动，不产生相应的酶，此为葡萄糖效应或降解物抑制作用,六、细菌的应急反应,应急反应：,当细菌氨基酸全面匮乏时，会产生一个应急反应，如停止合成,RNA,、糖、脂肪和蛋白质相关的生物化学反应,应急反应实施信号：,鸟苷四磷酸（,ppGpp,）和鸟苷五磷酸（,pppGpp,），一种超级调控因子,诱导物：,空载,tRNA,第二节,乳糖操纵元与负控诱导系统,lactose operon,negative induction,一、乳糖操纵元的结构及本底表达,二、乳糖操纵元的调控位点,二、乳糖操纵元的负控诱导系统,四、乳糖操纵元的正调控,五、操纵元的突变,-,遗传分析验证操纵元功能,六、,lac,操纵元中的其它特点,一、乳糖操纵子的结构及本底表达,p,DNA,mRNA,lac,I,1 040,PO,82,lac,Z,3 510,lac,Y,780,lac,A,825,多 肽,3.810,4,1.2510,5,3.010,4,3.010,4,蛋白质,四聚体,四聚体,膜蛋白,二聚体,功 能阻遏子,半乳糖苷酶,透过酶,乙酰基转移酶,大肠杆菌乳糖操纵子包括,3,个结构基因：,Z,、,Y,和,A,，以及启动子、操纵子和阻遏子等,转录时，,RNA,聚合酶首先与启动区（,Promoter,P,）结合，通过操纵子（,Operator,O,）向右转录,半乳糖苷酶：,半乳糖苷键的专 一 性酶，可将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖外，也水解其他,半乳糖苷（如苯基半乳糖苷）,透过酶：,使外界的,半乳糖苷（如乳糖）透过大肠杆菌细胞壁和原生质进入细胞内,用,乳糖,为大肠杆菌生长的惟 一 碳源和能源时，这两种酶是必需的,lac,操纵元的本底表达及特点,诱导物穿越细胞膜需要透过酶，一些透过酶可以在没有诱导物的情况下合成,真正的诱导物是乳糖的异构体,异构乳糖，别乳糖是在,半乳糖苷酶的催化下由乳糖产生的，需要,半乳糖苷酶的预先存在,本底水平的组成型合成（,background level,，,constitutive synthesis,）：在非诱导状态下有少量的,lac,mRNA,合成,二、乳糖操纵元的调控位点,Operator,操纵基因 阻遏蛋白结合区,O,区：,阻遏物结合区，位于,P,区后半部分和转录起始区（,-7,+28,），该区序列有对称性，其对称中心点在,+11,位，,对称序列，,6bp,2.,启动启动子区,RNA,聚合酶结合位点,从,I,基因结束到,mRNA,转录起始位点下游,5-10bp含,cAMP-CAP,结合区：,cAMP,结合位点（,-67,-52,），有对称性，其对称位点在,-60,-59,之间,几个,操纵元,DNA,的调控区域,P,、,O,区,阻遏物与,o,区的结合影响了,RNA,聚合酶与启动子区结合形成转录起始复合物的效率,三、乳糖操纵元的负控诱导系统,1.,阻遏物,lac,基因产物及功能,Lac,操纵元阻遏物,mRNA,：,弱启动子控制 组成型表达,阻遏蛋白：由,4,个相同的亚基组成，每个亚基含有,347,个氨基酸残基，并能与,1,分子,IPTG,结合,乳糖操纵元的三个操纵子序列与阻遏蛋白结合的特征及其作用,阻遏蛋白质,-DNA,互作空间构像,lacZ,基因内部的,O2,核苷酸序列作为操纵基因时（,Operator,），有阻遏蛋白就会与其结合，从而阻止基因表达，这是一种高效阻遏的非常保险的方式：即编码序列具有操纵基因序列，被阻遏蛋白结合，因而不可能表达转录本。生物进化的保险机制。,阻遏蛋白结合在操纵子部位,2.,大肠杆菌对乳糖的反应,培养基中有无诱导物对,lac,mRNA,及,半乳糖苷酶活性的影响,无乳糖存在，,lac,mRNA,及,半乳糖苷酶本底水平表达,有乳糖存在，,lac,mRNA,诱导表达，,半乳糖苷酶和透过酶合成,乳糖消耗，阻遏物持续合成，细胞重新构建阻遏状态，,lac,mRNA,合成受抑制，总量下降,酶合成停止，但是蛋白半衰期较长，可以维持一段时间,安慰性诱导物,（,gratuitous inducer,）：高效诱导物，但不是半乳糖苷酶的底物,乳糖类似物,异丙基巯基半乳糖苷（,IPTG,），巯甲基半乳糖苷（,TMG,），发色底物,O,硝基半乳糖苷（,ONPG,）都是安慰性诱导物,IPTG,应用最多,与,X-gal,结合，细菌蓝白斑筛选,IPTG,TMG,ONPG,四、乳糖操纵元的正调控,1.,葡萄糖对,lac,操纵元的影响,半乳糖苷酶作用：把乳糖分解成葡萄糖及半乳糖,葡萄糖和乳糖同时加入培养基：大肠杆菌在耗尽外源葡萄糖之前不会诱发,lac,操纵子,葡萄糖对,lac,操纵子表达的抑制作用是间接的,葡萄糖的某些降解产物抑制,lac,mRNA,的合成，葡萄糖的这种效应为代谢物阻遏效应（,catabolite repression,）,2000,1500,1000,500,0.7,0.6,0.5,0.4,0.3,0.8,0,50,100,130,0,细胞总数,/,相对单位,时间,/min,-,半乳糖苷酶活性,/,（,UmL,-1,）,当葡萄糖和乳糖同时存在于培养基中时,，,lac,启动子表达受阻，没有,半乳糖苷酶活性,当葡萄糖消耗完以后,（箭头处），细胞内,cAMP,（环腺苷酸）,浓度增加，,半乳糖苷酶活性增加，一度停止生长的细胞又恢复分裂,？,细菌的,cAMP,含量，与葡萄糖的分解代谢有关：当分解葡萄糖产生能量时，,cAMP,生成少分解多，故,cAMP,浓度低,当环境中无葡萄糖供应时，,cAMP,含量升高，为何？,cAMP,合成由 腺苷酸环化酶,(AC),催化，葡萄糖抑制腺苷酸环化酶的活性,;,无葡萄糖，腺苷酸环化酶活性高，,cAMP,高,cAMP,的糖分子的,3,和,5,同时与一个磷酸形成,3-5,磷酸二酯键,glucose,cAMP,ATP,Adenylate cyclatase,AC,cAMP:adenosine 3,5-cyclic monophosphate,2.CRP,（,CAP,）与,cAMP,（环化,AMP,）,为何同时存在乳糖和葡萄糖时，乳糖操纵元受阻不开放？,乳糖操纵元开放，还需一种,cAMP,的受体蛋白,（,cAMP receptor protein,CRP,）的正调控，也称为,代谢物激活蛋白,（,catabolite activating protein,CAP,）,CRP,与,cAMP,结合并发生空间构象变化而活化，能以二聚体的方式与特定的,DNA,序列结合，从而启动,Lac,操纵元,cAMP-CRP,能与,DNA,相结合，造成双螺旋弯曲，易于形成三元转录起始复合物,阻遏物则是抗解链蛋白，阻止形成开放结构,CRP,激活转录的方式,只要有这个“环”的亚基存在，阻遏物无法与,O,区相结合，,lac operon,得到表达,CAP,结合位点,CAP,为二聚体，,45KD,，被cAMP,激活,结合位点,22bp I -70 -50,II-50 -40,CAP cAMP,在,CAP,位点上与,RNA pol,的相互作用,gal,lac,和,ara,操纵子上游启动子区与,CAP cAMP,结合位点的相对位置分析,CAP,的正调控作用，结合后启动,Lac,操纵元转录,Lactose,Glucose,-,+,-,+,-,+,lac,启动子在两个相互独立的调控体系互作下实现其功能,乳糖操纵元正控系统和负控系统比较,正控系统,负控系统,主要作用因子,CAP cAMP,阻遏蛋白,转录,进行,抑制,作用位点,启动子,操纵子,消除作用的因子,葡萄糖,乳糖,五、操纵元的突变,-,遗传分析验证操纵元功能,1.,显性突变：,操纵子突变（,O,+,O,c,），结构基因组成型表达,I,+,O,C,Z Y A,lactose,I,+,O,+,等位基因间的显隐关系,w.t.(I,+,O,+,P,+,),诱导型,加入诱导物,操纵子开启,无诱导物,操纵子关闭,O,C,mut.(I,+,O,C,P,+,),（组成型）,O,C,失去与阻遏蛋白特异结合的能力,有无诱导物 操纵子均开启,组成部分二倍体,O,C,O,+,O,C,O,+,cis-dominant,i,S,p o,mut,repressor,I,+,组成部分二倍体,I,S,/I,+,I,S,/i,C,i,S,I,+,i,S,i,C,等位基因间的显隐关系,w.t.(,I,+,O,+,P,+,),诱导型,加入诱导物,操纵子开启,无诱导物,操纵子关闭,i,S,mut.(,i,S,O,+,P,+,)(,超阻型,),i,S,gene,产物阻遏蛋白不能与诱导物结合,有无诱导物，操纵子均关闭,2.,隐性突变：,阻遏蛋白基因突变（,I,+,I,C,），结构基因组成型表达,等位基因间的显隐关系,w.t.(,I,+,O,+,P,+,),诱导型,加入诱导物,操纵子开启,无诱导物,操纵子关闭,i,C,mut.(,i,C,O,+,P,+,)(,组成型,),i,C,gene,产物阻遏蛋白丧失与,O,位点结合的能力,可诱导表达,组成部分二倍体,I,+,/I,C,I,+,i,C,i,c,I,+,i,c,i,c,p o,六、,lac,操纵元中的其它特点,1.,A,基因及其生理功能,A,基因编码,半乳糖苷乙酰基转移酶,半乳糖苷酶降解的半乳糖苷分子不能进一步代谢，不少半乳糖苷衍生物在高浓度时是细胞生长的抑制物,A,基因能把乙酰基转移到半乳糖苷分子上，但它抑制了,半乳糖苷酶产物的有害性衍生物在细胞内积累，在生物进化中具有意义,2.lac,基因产物数量上的变化,在一个完全被诱导的细胞中，,-,半乳糖苷酶、透过酶及乙酰基转移酶的拷贝数比例为,1:0.5:0.2,反映了以,-,半乳糖苷作为唯一碳源时细胞的需要,调控机制：,lac mRNA,可能与翻译过程中的核糖体相脱离，从而终止蛋白质链的翻译；频率取决于每一个后续的,AUG,密码子再度起始翻译的概率,在,lac mRNA,分子内部，,A,基因比,Z,基因更易受内切酶作用发生降解，在任何时候,Z,基因的完整拷贝数要比,A,基因多,Spacer,较长时,Spacer,较短时,3.,操纵子的融合与基因工程,自然条件下，,lac,操纵子与负责嘌呤合成的,pur,操纵子偶联,位于,lac,操纵子沿转录方向的下游，中间隔一个控制细胞对,T6,噬菌体敏感性的,tsx,基因,tsx,s,Z,+,tsx,R,Z,-,部分,z,Pur,操纵基因和启动子的一部分,Lac,启动子转录酶有较高的亲和力，可高效启动转录的启动子，可使较弱启动子的转录增强，增加蛋白质的合成量,第三节 色氨酸操纵元与负控阻遏系统,Tryptophan operon,，,negative repression,一、,trp,操纵元的阻遏系统,二、弱化子与前导肽,三、,trp,操纵子弱化机制的实验依据,四、阻遏和弱化作用的协调,四、,trp,操纵元的其它调控机制,细菌中色氨酸生物合成途径,trpG-D,和,trpC-F,基因融合,trpE,和,trpG,编码邻氨基苯甲酸合酶,trpD,编码邻氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶,trpC,编码吲哚甘油磷酸合酶，,trpF,编码异构酶,trpA,和,trpB,分别编码色氨酸合酶的,和,亚基,trpE基因是第一个被翻译的基因，和,trpE,紧邻的是启动子区和操纵区,前导区和弱化子区分别定名为,trpL,和,trpa,trpR,编码阻遏物，它距,trp,基因簇,很远,。后者位于大肠杆菌染色体,25 min,处，而前者在,90 min,位置,在,65 min,处有一个,trpS,（色氨酸,tRNA,合成酶），它与携带色氨酸的,tRNA,Trp,共同参与,trp,操纵子的调控作用,大肠杆菌中的,trp,操纵元,7000 nt,High tryptophan levels,Low tryptophan levels,Trp,Tryptophan synthesis,Trp mRNA,Attenuated mRNA,140 nt,Repressor mRNA,trp,aporepressor,Attenuator sequence,Regulatory region,Structural genes,trp,R,P,O,trp,L,trp,E,trp,D,trp,C,trp,B,trp,A,60,162,1560,1593,1350,1196,804,40,受阻遏系统和弱化系统的调控,一、,trp,操纵元的阻遏系统,阻遏蛋白,（,aporepressor,）：,trpR,基因的产物，该基因突变常引起,trp,mRNA,的组成型合成,阻遏蛋白与操纵子的结合需要色氨酸（效应物）,阻遏蛋白与色氨酸结合形成有活性的阻遏物，再与操纵区结合即关闭,trp,mRNA,转录,GCAAATATTCTGAAATGAGCTGTTGACAATTAATCATCGAACTAGTTAACTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAA,CGTTTATAAGACTTTACTCGACAACTGTTAATTAGTAGCTTGATCAATTGATCATGCGTTCAAGTGCATTTTT,RNA,聚合酶结合位点,mRNA,合成起始,操纵子区,启动子,-50 -40 -30 -20 -10 +1 +10,效应物：,色氨酸由,trp,操纵元编码的合成途径的末端终产物,当培养基中色氨酸供应不足时，,阻遏物失去色氨酸并从操纵子上解离，,trp,操纵子去阻遏，可转录,当培养基中色氨酸含量较高时，,它与游离的阻遏蛋白相结合，并使之与操纵子,DNA,紧密结合，抑制转录,trp,操纵元的阻遏系统,自动调控,避免浪费,二、,弱化子与前导肽,色氨酸高浓度和低浓度下，,trp,操纵子的,表达水平相差,600,倍，而阻遏作用仅能使转录降低,70,倍,阻遏物失活突变不能完全消除色氨酸对操纵子表达的影响,阻遏,-,操纵机制对色氨酸来说是一个一级开关，主管转录是否启动，相当于粗调开关,其它调控机制,弱化作用进行细调控,，指示已经启动的转录是否继续下去,通过转录达到第一个结构基因之前的过早终止来实现的，由,色氨酸的浓度,来调节这种过早终止的频率,1.,弱化子,前导区：,在,trp,mRNA 5,端,trpE,基因的起始密码前有一个长,162 bp,的,mRNA,片段，为前导区,弱化子：,当,mRNA,合成起始后，有色氨酸时，转录总是在这个区域终止，产生一个仅有,140,个核苷酸的,RNA,分子，终止,trp,基因转录，该区域为弱化子,茎,环结构：,引起终止的,mRNA,序列自身配对形成茎,环结构，具典型的终止子特点,2.,前导肽,在,Trp,中，含,AUG,和,UGA,，若翻译起始于,AUG,，可产生一个,14 aa,短肽，这个假设的短肽称为,前导肽。,前导肽第,10,，第,11,位上有相邻的两个色氨酸密码子，,UGG,UGG,，参与了,trp,操纵元中的转录弱化机制,弱化子结构,trpE,基因的起始密码前有一个,162 bp,的,mRNA,片段,四个区域的,可能配对方式,10,11,位的,Trp,3.,转录弱化作用机理,无色氨酸，无负载色氨酸的,tRNA,Trp,，通过两个相邻色氨酸密码子的速度慢，当,4,区被转录完成时，核糖体才进行到,1,区（或停留在两个相邻的,trp,密码子处），前导区结构为,2 3,配对，,无,3 4,配对,，可转录,有色氨酸，核糖体很快就通过两个相邻色氨酸密码子，,2 3,不能配对，,有,3 4,配对,形成茎,环状终止结构，终止转录,2,3,3,4,Trp codon,在核糖体上,Trp codon,离开核糖体,trp,操纵元的转录与翻译偶联调控,转录和翻译偶联，才可能发生弱化作用,如果当其他氨基酸短缺或所有的氨基酸都不足时，核糖体翻译移动的速度就更慢，甚至不能占据,A,的序列，结果有利于,A,和,C,发夹结构的形成，于是,RNA,聚合酶停止转录,等于告诉细菌：“整个氨基酸都不足，即使合成色氨酸也不能合成蛋白质，不如不合成以节省能量”,细菌其他氨基酸合成系统的许多操纵子（如组氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸等操纵子）中也有类似的弱化子存在,原核,RNA,前导序列的变构引起转录继续,2:3,抗终止构型,AUG.,UGA,成功通读,继续转录,2,3,1,4,区没有配对的发夹结构,1:2,暂停发卡结构,1,终止构型,3:4,终止转录发卡式构型,暂停构型,UUUUUUU,前导肽编码区,RNA,转录起始位点,第一个结构基因,启动子,DNA,暂停位点,弱化子,前导肽编码区,2,3,4,A,G,U,AUG ,ATG TGA,1,2,3,4,原核,RNA,前导序列的变构引起转录的终止或弱化,三、,trp,操纵子弱化机制的实验依据,在色氨酸浓度高时，色氨酰,tRNA,合成酶缺陷型的,trp,操纵元表达,温度敏感突变株,trpS5,的,Trp tRNA,合成酶只在,30,0,C,时有活性，在,42,0,C,时无活性,30,0,C,时，色氨酰,tRNA,合成酶有活性，可生成,tRNA,Trp,，,trp,操纵元不表达,42,0,C,时，色氨酰,tRNA,合成酶失去活性，不能生成,tRNA,Trp,，,trp,操纵元表达,另有一个缺失前导区及,D,基因的突变体（,trpLD102,），该细菌在有色氨酸的培养基中仍有很高的色氨酸合成酶活性,有实验证明，在不加色氨酸的培养基中，,trp mRNA,的合成仍然受到部分阻遏,现在一般认为，野生型细胞中同时存在着有活性和无活性的阻遏物，培养基中色氨酸浓度的变化，能够使这两种阻遏物间的平衡发生倾斜，最终做出关闭或启动,trp,操纵子的决定，从而维持一定的色氨酸含量,四、阻遏与弱化作用的协调,一种可能是阻遏物从有活性向无活性的转变速度极低，需要有一个能更快地做出反应的系统，以保持培养基中适当的色氨酸水平,弱化子系统主要是对外源色氨酸浓度做出反应。外源色氨酸浓度很低的信号虽然足以引起,trp,操纵子的去阻遏作用，但是这个信号还不足以很快引发内源色氨酸的合成,在这种环境下，弱化子就通过抗终止的方法来增加,trp,基因表达，从而提高内源色氨酸浓度,1.,细菌中为什么要有弱化子系统呢？,2.,为什么还要有阻遏体系呢？,没有阻遏体系，只有弱化也可以调节色氨酸酶系的合成,阻遏的作用是在有大量外源色氨酸存在时，保障阻止非必需的先导,mRNA,的合成，不合成色氨酸转录本，生物的合成系统更加经济，避免浪费,组氨酸操纵子拥有在功能上与,trp,操纵子完全相同的弱化子结构，但没有阻遏物，它的表达完全受弱化子调节,五、,trp,操纵元的其它调控机制,大肠杆菌（,E.coli,）：,共有,5,个基因参与色氨酸生物合成，构成色氨酸操纵元,trpG D,和,trpC F,为融合基因，翻译出的多肽具有双重功能,有两个启动子控制整个操纵子的转录，能够感受色氨酸和无负载的,tRNA,Trp,的浓度变化,枯草芽孢菌（,Bacillus subtilis,）：,色氨酸操纵子包括,6,个基因，处于一个,12,个基因的大操纵子内,B.subtilis,还有第,7,个色氨酸合成基因,trpG,（又称,pabA,），位于叶酸操纵子中,翻译出来的,Trp-PabA,多肽链能发挥两个酶的作用，一个用于色氨酸途径，一个用于叶酸途径,B.subtilis,（枯草芽胞杆菌）中色氨酸操纵元的调控机制,色氨酸激活调节蛋白,TRAP,，形成终止子结构,无负载的,tRNA,Trp,聚集使,TRAP,失活，激活转录和翻译,无负载的,tRNA,Trp,浓度升高，,rtpA,基因编码的,AT,蛋白与,TRAP,结合，激活转录,第四节 其它操纵元,一、半乳糖操纵元,二、阿拉伯糖操纵元,三、阻遏蛋白,Lex,的降解与细菌中的,SOS,应答,四、多启动子调控的操纵子,一、半乳糖操纵元,大肠杆菌半乳糖操纵子（,galactose operon,）在大肠杆菌遗传图上位于,17 min,处,包括,3,个结构基因：,异构酶（,UDP galactose 4 epimerase,galE,），半乳糖,-,磷酸尿嘧啶核苷转移酶（,galactose transferase,galT,），半乳糖激酶（,galactose kinase,galK,）,3,个酶的作用：,使半乳糖变成葡糖,1,磷酸,调节基因是,galR,与,galE,、,T,、,K,及操纵区,O,等离得很远，而,galR,产物对,galO,的作用与,lacI-lacO,的作用相同,gal,操纵元的结构及其代谢途径,P E T K,mRNA,gal,操纵子,（,a,）操纵元的结构,（,b,）代谢途径,半乳糖操纵元的结构及其调控机制,1.cAMP CRP,对,gal,启动子的作用,gal,操纵子,P O,区序列中有两个相距仅为,5 bp,的启动子,每个启动子拥有各自的,RNA,聚合酶结合位点,S,1,和,S,2,gal,操纵子可以从两个启动子分别起始基因转录,有两个相重叠的,Pribnow,区,TGT,TATGCTATGGTT,ATTTCATACCATAAGCCTAATGGAGCGAATTATGAGAGTT,ACA,ATACGATACCAA,TAAAGTATGGTATTCGGATTACCTCGCTTAATACTCTCAA,-20,-10,+1,+10,+20,+30,S,1,S,2,mRNA1,mRNA2,MetArg,Leu,cAMP-CRP,对从,S1,和,S2,起始的转录有不同作用,无葡萄糖时，,cAMP-CRP,浓度高，从,S1,起始的转录顺利进行，,RNA,聚合酶与,S1,的结合需要半乳糖,有葡萄糖时，无,cAMP-CRP,，转录从,S2,开始,条件,表达,有,Glu,有,Gal,P2,启动,S2,开始转录,gal E,，组成型表达,有,Glu,无,Gal,OE,和,OI,相互作用，成环，转录只进行,20,碱基便停止,无,Glu,有,Gal,P1,启动，,3,个基因转录,无,Glu,无,Gal,P1,不启动,半乳糖不仅可以作为唯一碳源供细胞生长，而且与之相关的物质,-,尿苷二磷酸半乳糖（,UDP-gal,）是大肠杆菌细胞壁合成的前体，生长过程中的所有时间里细胞必须能够合成差向异构酶，保证尿苷二磷酸的供应,在没有外源半乳糖的情况下，,UDP-gal,是通过半乳糖差向异构酶（,galE,基因的产物）的作用由,UDP-,葡萄合糖成的,2.,双启动子的生理功能,假如只有,S1,启动子，由于这个启动子的活性依赖于,cAMP-CRP,，当培养基中有葡萄糖存在时就有不能合成异构酶,galE,；,假如只有,S2,启动子，那么在葡萄糖存在的情况下，半乳糖使操纵子处于充分诱导状态，这无疑是一种浪费,从必要性或经济性考虑，都需要一个不依赖于,cAMP-CRP,的启动子（,S2,）进行本底水平的组成性合成，以及一个依赖于,cAMP-CRP,的启动子（,S1,）对高水平合成进行调节,二、阿拉伯糖操纵元,阿拉伯糖（,arabinose,）是另一个可以为代谢提供碳源的五碳糖,在大肠杆菌中阿拉伯糖的降解需要,3,个基因：,araB,、,araA,和,araD,分别编码,3,个酶：,araB,基因编码核酮糖激酶，,araA,编码,L-,阿拉伯糖异构酶，,araD,编码,L-,核酮糖,-5-,磷酸,-4-,差向异构酶,1,.ara,操纵元的特点,双向转录：,araP,BAD,和,araPc,转录方向相反,AraC,有,3,个结合位点（,O1,，,O2,，,araI,：激活蛋白结合位点）Pc,和,O1,重叠,AraC,既可充当阻遏物，也可作为激活剂。纯的,AraC,结合,araO1,，阻遏作用；,C+Ara,结合于,araI,调节区，诱导，正调节。,araC,本身受到操纵调节（自身调节）,araC,的表达受自身产物,AraC,的调控：当没有阿拉伯糖时，,AraC,起着一个转录阻遏物的作用。,阻遏,araC,转录大约需要,40,个,AraC,。因此当,AraC,蛋白水平低时，,araC,将表达直至存在足够的,AraC,去阻遏它的转录。,2.AraC,蛋白的正、负调节作用,有,Ara,无,Glu,时,，,AraC,蛋白与诱导物阿拉伯糖相结合后，结合于,araI,，诱导,araPBAD,转录,正控系统中，起始转录还需要,cAMP CRP,参与,当,Glu,较高，,Ara,水平较低时,，,AraC,过量，可结合到,araO1,，,阻遏,Pc,。,AraC,蛋白与操纵区,O2,以及,araI,诱导因子结合区上半区相结合，形成,DNA,回转结构，,araBAD,基因不表达,阿拉伯糖水平低，葡萄糖水平高,AraC,蛋白作为,P,BAD,活性正、负调节因子的双重功能是通过该蛋白的两种异构体来实现的,Pr,是起阻遏作用的形式，可以与现在尚未鉴定的类操纵区位点相结合，,Pi,是起诱导作用的形式，它通过与,P,BAD,启动子结合进行调节,没有阿拉伯糖时，,Pr,形式占优势；有阿拉伯