国外生物制品质量标准2010年药典会-.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,国外生物制品检验方法研究进展,王军志,中国药品生物制品检定所,提纲,一.国际交流促进了质量标准研究与发展,二.高端理化方法用于生物制品质量研究,三.新生物学活性测定方法的研究,四.热源检测替代方法研究,一.国际交流促进了质量标准研究与发展,WHO,英国NIBSC,德国PEI,加拿大CBR,美国USP,测量学（Metrology）：,测量结论基础:,方法验证（Validation）,追溯（Traceablity）,不确定性（Uncertainty）,随着测量技术进步，新的分析测量手段应用于生物测量中，如:芯片技术开发在基因水平对测序的评价方法。,关于标准溯源（Traceablity Chain）：,国际标准（SI）,NMI,药典（Pharmacopoeias）,协作标定实验室（Calibration Labs）,常规测定实验室（Routine,Measurement Labs）,Bio-measurements主要含义：,1.采用生物学方法进行测量包括生物测定（Bioassays）、动物水平,细胞水平,分子水平的定量测定等。,2.对生物制品本身结构特性的测定，如圆二色分析蛋白质、分子结合物表面共振分析等。,对于复杂的蛋白分子，理化测定方法虽然可以提供比较多的结构信息，但其不能完全反映蛋白质的高级结构。虽然生物学活性的测定值可信限范围比较大，但其作为特异的定量方法仍被广泛应用。,只有在理化结构的测定比较全面彻底，并且理化测定方法与生物学活性测定方法关系明确，同时生产工艺稳定时，理化方法才可以替代生物学活性测定方法。,NIBSC将,蛋白组学在疫苗质量控制中的应用：,以Meningococcal OMV vaccine为例，,采用I-D SDS-PAGE电泳法，可以得到29条区带，采用质谱分析出40种蛋白多肽的序列。其中证明7种为关键抗原成份。,采用二维电泳法（2D-PAGE）发现152斑点，采用MS/MS法分离出74个多肽位段可以代表41个不同基因的产物。,采用2D-PAGE法分析两个企业同类产品，斑点数有显著差异。,免疫蛋白组学可以通过分析混合蛋白，研究哪些是有用，哪些是无用的，从而确定抗原保护成份。,Example:Complexity of vaccines,Proteomics-based identification of antigenically-active components present in OMV,Vaccines against Meningococcal group B disease,Is the concept of a“biological”(not,characterisable,by,physico,-chemical means alone)still valid?,生物测定终点法,以细胞早期分子变化测定为基础：,VEGF的生物学测定采用细胞内信号变化进行。q-PCR检测mRNA表达水平。通过IL-8mRNA诱导的VEGF活性测量。,通常采用抗病毒检测法测定-干扰素活性需要3天，而q-PCR法8小时就可以达到目的。,RNA可直接通过细胞裂解物测定，不需要纯化或酶处理。,生物测定终点法的发展（Bioassay end-point development）：,q-PCR方法可直接测定细胞早期的成份变化，可减少差异，改善灵敏度。,内源性mRNA的测定不需稳定感染细胞的传代，并作为基因检测的报告实例。,该技术可用于检测参考品和治疗产品效价，还可用于对更复杂材料（如血清）的诊断测定（中和抗体）。,提高生物测定速度，如q-PCR法与传统理化测定技术共用，可以在线监测产品质量。,出访情况简介,访问时间：2009年5月37日,地点：渥太华，加拿大卫生部生物制品质量研究中心（Center for Biologics Research,CBR）,人员:王军志 叶强,李长贵,内容：参加“中加生物制品质量控制 研讨会”并访问CBR,参观CBR实验室,与批签发部门的交流,疫苗批签发由生物制品评价中心的实验室承担,批签发实行分级管理，根据生物制品的种类、风险性进行评估，将其分为四个等级，如新疫苗和活疫苗为最高等级，除资料审核外，还需进行关键项目的实验室检测，最低等级的制品只进行资料审核。,分级管理是动态的,对CBR研究特色的体会,生物/化学/分离方法的有机结合对生物制品结构和功能的相关性研究,以各种高技术分析方法对生物制品质量进行深入研究,新检测方法的研究-新颖性、实用性,对生物制品前沿领域的把握,二.高端理化方法用于生物制品 质量研究,1.生物/化学/分离方法结合分析糖蛋白,单克隆抗体在不同供氧浓度时，采用HPAEC-PAD（高pH阴离,子交换色谱和脉冲电流检测仪）,分析方法可以看到不同条件下,的单抗的结构差异,1,.生物/化学/分离方法结合分析制品质量,单克隆抗体在不同供氧浓度时，采用FACE（荧光辅助糖电泳,）,质谱分析方法可以看到不同条件下的单抗的结构差异,FACE分析,MALDI-QqTOF-MS分析,2.,流感疫苗质量分析,应用NanoLC/MS方法分析同一企业三批流感疫苗的质量,红蓝绿代表三批制品,2.,流感疫苗质量分析,应用NanoLC/MS方法分析三个企业流感疫苗的质量,3.,EPO糖基化分析,EPO-,EPO-,不同企业的EPO通过毛细管电泳发现有不同的糖基化形态,.,成品分析，能在高浓度保护剂存在时分析,3.,EPO糖基化分析,Migr.Time,Peak Area,%,Mfr.Spec.,Glycoform 1,unresolved,-,-,5,Gl,ycof,o,rm,2(+1),16.15,33564,16.0,5-25,Gl,ycof,o,rm,3,16.40,63537,30.3,20,-35,Gl,ycof,o,rm,4,16.67,65718,31.3,25-40,Glycoform 5(+6),16.97,46855,22.4,15-35,Glycoform 6,unresolved,-,-,0.05(,对,3,个不同代进行比较,),2)CV=5.02%(,好于预期可接受的,20-30%,的范围,),基质（4批）,1)P=0.08 or 0.05,2)CV=11.88%(,好于,20-30%),操作人（3个）,1)CV=9-11.43%(individual very good).,2)P=0.012,3,个操作人,:,无差异,.,特异性,：,线性反应中，IFN均不与其他细胞因子,(TNF,GM-CSF,IL-2,IL-4,etc.up to 15 cytokines tested)反应,。,复制数：,5,per cell(,18,株克隆中有,1,株合适,),样品来源：与产品标签相符合（人注射用）,检测范围：,0 3200 IU/mL,（远大于其他报道过的方法）,不同天数：无差异（,CV=5.6%,）,新方法的优点:,新方法较传统方法更加简便、快速、客观及具有更好稳定性。,对大量克隆细胞进行筛选与分析后，在18个子克隆中仅有1株适用于试验。,CBR试验优于以前报道研究过的试验体系：如细胞更加稳定(56 passage vs.15 passages),检测范围更宽等。,干扰素测活新方法的研究(NICPBP),构建细胞株,293细胞中插入干扰素刺激,反应元件（ISRE）用嘌呤,霉素稳定,实验步骤,铺板、加样 培养21h,加入,Bright Glo luciferase reagent,读数,技术路线,干扰素测活新方法的研究,干扰素测活新方法的研究,药物类别类别,药物批号,药物效价,回收率,原有方法测量效价,IFN2a,20090503,2.93*10,6,2.81*10,6,20082010,5.73*10,6,5.87*10,6,5.79*10,6,97%,5.84*10,6,IFN2b,200909192,6.71*10,6,7.25*10,6,20070604,6.49*10,6,6.52*10,6,6.27*10,6,103%,6.78*10,6,IFN1b,20080801,9.4*10,4,9.6*10,4,0090408,3.76*10,5,3.82*10,5,3.73*10,5,93%,3.68*10,5,前期实验结果,3.新检测方法的研究,百日咳残余毒素的研究,Fetuin,N3-glycan,Substrate,COLOUR,Anti-PT,antibody,HRP-secondary antibody,HRP,Gomez et al.2006 Anal Biochem 356:244-253,PTx,pH 10.2,pH 10.2,pH 7.4,pH 7.4,百日咳毒素,(PTx),百日咳类毒素,(PTd),四.替代定量方法研究,1,流感病毒通用抗体,2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 (-)(+),Influenza HA subtypes,80,60,50,40,30,HA0,HA2,针对流感病毒血凝素的通用抗体,1,流感病毒通用抗体,2.单核细胞活化试验简介,单核细胞活化试验,(the monocyte activation test,，,MAT),为一种检测药品中炎性因子及热原污染物质的体外试验新方法。,依单核细胞来源不同可将该方法大致分为以下三类,:,人外周血单个核细胞（,PBMNC,）法,单核细胞系法（如,THP-1,、,MM-6,）,人全血法,MAT,法基本原理,IL-6,热原物质刺激单核细胞(如人外周血单个核细胞，,PBMNC,)后,导致其形态改变并释放某些能致机体发热的蛋白进入血液。因该类蛋白可引起机体体温升高，又将其称为内致热原，其成分主要为各类细胞因子(如IL-6、IL-1、TNF-等)。,MAT,法基本原理,MAT法将热原物质、受试药品分别与单核细胞孵育，通过免疫化学分析法(如ELISA)检测与比较孵育体系中细胞因子的含量，,反映药品中各类炎性因子及热原物质的污染情况。,MAT,法主要特点,针对家兔热原检查法使用活体动物进行体内实验的问题，MAT法为一种不使用动物的体外实验方法,针对细菌内毒素检查法只能特异性检测内毒素的问题，MAT法能检测出较多种类（包括内毒素与非内毒素来源）的热原物质,Limulus crabs,系列浓度内毒素标准品刺激,PBMNC,分泌,IL-6,试验,IL-6(pg/ml),Endotoxin concentration(EU/ml),The data from Robin Thorpe PhD.,NIBSC.,系列浓度受试药品（,Contaminated Factor VIII,）刺激,PBMNC,分泌IL-6,试验,Samples negative in the,rabbit pyrogen test&,bacterial endotoxins test,LPS(EU/ml),MAT（PBMC/IL-6）法用于检测内毒素及非内毒素来源热原物质,The data from Robin Thorpe PhD.,NIBSC.,Four initial donors,Drug complies with specification,REJECT,ACCEPT,Continuation with four additional donors,Drug complies with specification,ACCEPT,REJECT,NO,(1-4 positive responses),NO,(2-4 positive responses),YES,(0 positive responses),YES,(0 positive responses),YES,(1 positive response),MAT,法判断标准,(4/4 or 7/8 donors),MAT,法国外发展与应用概况,欧洲药典“MAT专家组”于2008年11月在法国斯特拉斯堡完成了对该方法专论的起草，并于2009年3月提交至欧盟，计划于2010年将MAT法作为家兔热原实验的正式替代方法。,在某些药害事件中，NIBSC已将MAT法用于检测某些治疗性免疫制剂（如TGN1412）的非必要内在活性（该活性在临床前评价中均未发现！）。,MAT法国内研究现状,国内对该方法的研究始于2002年，中国药品生物制品检定所相关科室已对包括人全血法、人外周血单个核细胞法、THP-1法在内的MAT法进行了较全面地基础研究，已基本建立该类方法并应用于某些药品（如中药注射液、疫苗类产品等）的热原检测中。,现计划对该方法应用于实际药品热原控制做进一步应用研究，为其进入2015年版药典积累详细的资料。,Acknowledgment(致谢):,Dr.Robin NIBSC,Dr.Li Seal CBR Canada,Dr.Misheal CBR Canada,Li Changgui(李长贵),Ye Qiang(叶强）,Li Juan(李娟）,Xu ranran(徐然然),Zhang Shuming(张庶民),others,谢谢各位专家,敬请指导,