Chapter-10--药物研究中的动物实验.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,新药研究中的动物实验,Chapter,6,New Drug Research and Development,新药研究,药品有效性,药品安全性,多种生物医学研究技能,人的健康,质量管理规范,特殊商品,独创性,有竞争力,R&D,风险大,费时多,耗资巨,化学,机械设备,医药,材料,生物,新药研究开发的系统工程,New Drug Research and Development,新药研究,开发的基本概念,药品,(pharmaceutical product):,指用于预防、治疗、诊断人的疾病，有目的地调节人的生理机能，并规定有适应症、用法和用量的物质。,新药,(New drug):,指,(,我国,),未生产过的药品。已生产的药品改变剂型、改变给药途径、增加新适应症或制成新的复方制剂，亦按新药管理。,新药分类：,中药、化学药品、生物制品,New Drug Research and Development,新药研究开发,新药分类,新药,(,化学药,),的,分类,第一类：,一、注册分类,1.,未在国内外上市销售的药品：,通过合成或者半合成的方法制得的原料药及其制剂；,天然物质中提取或者通过发酵提取的新的有效单体及其制剂；,用拆分或者合成等方法制得的已知药物中的光学异构体及其制剂；,由已上市销售的多组份药物制备为较少组份的药物；,新的复方制剂；,已在国内上市销售的制剂增加国内外均未批准的新适应症。,2.,改变给药途径且尚未在国内外上市销售的制剂。,3.,已在国外上市销售但尚未在国内上市销售的药品：,已在国外上市销售的制剂及其原料药，和,/,或改变该制剂的剂型，但不改变给药途径的制剂；,已在国外上市销售的复方制剂，和,/,或改变该制剂的剂型，但不改变给药途径的制剂；,改变给药途径并已在国外上市销售的制剂；,国内上市销售的制剂增加已在国外批准的新适应症。,第二类,中药新药的分类,第三类,改变已上市销售盐类药物的酸根、碱基（或者金属元素），但不改变其药理作用的原料药及其制剂。,改变国内已上市销售药品的剂型，但不改变给药途径的制剂。,已有国家药品标准的原料药或者制剂,第四类,第五类,第六类,New Drug Research and Development,新药研究开发,新药分类,生 物 制 品,第一类：,国内外尚未批准上市的生物制品。,第二类,:,国外已批准上市，尚未列入药典或规程，我国 也未进口的生物制品,。,第三类：,1,、疗效以生物制品为主的新复方制剂。,2,、工艺重大改革后的生物制品。,第四类；,1,、国外药典或规程已收载的生物制品。,2,、已在我国批准进口注册的生物制品。,第五类：,增加适应症的生物制品。,New Drug Research and Development,新药研究开发,新药的发现,：,新药,研究与开发的基础。发现一批生物活性强的先导,化合物（,leading compound,）,以及有效安全可控的侯选,药物（,new drug candidate,）是一个复杂的过程，是需要,反复评估，反复比较并分阶段实施的过程，以保证新药研,究与开发的科学性、可行性、经济性。,New drug discovery(,新药的发现,),.,局限性,A,、周期长、费用高无法大规模化,B,、动物模型会有假阳性结果,C,、难以提供确切机理的信息,Traditional drug screening,Traditional drug screening,以特定的动物，器官或细胞模型为靶，来检测对某一特定的生理生化指标的影响。,New Drug Research and Development,新药研究开发,HTS,HTS(High-throughput screening),一种药物筛选新方法。,采用分子、细胞水平的药物筛选模型，可从大量的样品中鉴别出对确定的分子靶点有相互作用的微量活性化合物。,计算机控制，自动化操作，可实现一药多选，具有快速、微量、灵敏的特点。,HTS,是新药发现的初始阶段，其目标是利用相关的生物分析找出有生物活性的化合物。观察的是药物与分子靶的相互作用，能够直接认识药物的基本作用机制。目前所用的模型主要集中在受体、酶、离子通道以及各种细胞反应方面。近年来也出现了基因水平的药物筛选模型，使药物筛选的范围更加广泛。,New Drug Research and Development,新药研究开发,HTS,HTS,筛选的基本步骤,第一步,选择分子靶,第二步,建立稳定表达分子靶的生物体系,.,第三步,建立简便快速的大规模的生物检测方法。,New Drug Research and Development,新药研究开发,HTS,HTS,药物筛选靶点与检测方法,1,、分子靶点筛选模型,-,细胞信号通路筛选系统,外界信号从细胞表面传递到细胞内，或者直接穿过细胞膜进入到细胞质和细胞核，最终影响某些基因的转录。在这个传递过程中，在某些特殊的细胞或一些病理状况下，可能是其中的一条或几条通路起作用，药物可以根据需要对这些通路进行阻断。,使用,信号通路筛选系统,，可直接对药物作用的分子机制有所了解。,Tyrosine kinase receptor mediated transduction,New Drug Research and Development,新药研究开发,HTS,2,、细胞膜表面受体筛选模型,（,1,）,G,蛋白耦联受体,：受体与,GTP,结合的调节蛋白的耦联，在细胞内产生,cAMP,，从而将外界信号跨膜传递到细胞内。,（,2,）,催化受体,：为单跨膜受体，分为胞外区，跨膜区和胞内区。当细胞因子与胞外区结合后，引起多个受体单体的聚合，每个聚合体的受体单体可以是同一类型，也可以不同。,G-protein coupled receptor mediated transduction,New Drug Research and Development,新药研究开发,HTS,（,3,）离子通道耦联受体：细胞表面一些神经递质的受体，自身是一些离子通道，或者与离子通道相耦联。当与配体结合时，受体构象改变，通道开放，离子进出细胞，引起电兴奋。,Facilitated diffusion via ion channel,New Drug Research and Development,新药研究开发,HTS,侯选药物来源,（,1New chemical,entities,NCE,（,新颖化学实体）：,指有专利保护的全新的化合物，可能在某种疾病的治疗上有重大突破，特别是疑难杂症。,一旦成功，效益巨大。但周期长，风险大，投资大。,设计合成化合物、从天然物中提取全新的有效单体，既可作为先导化合物，也可作为侯选药物。,（,2,）,Me-too,类化合物：,多指根据已知的药物进行结构修饰，而得到的结构相似的衍生物或同系物。,（,3,）天然来源的侯选药物。,（,4,）新剂型和新制剂：,缓释、控释制剂，把疗效好的化学药品制成有特色的新制剂，是国际新药研制非常活跃的领域。,New Drug Research and Development,新药研究开发,HTS,HTS,应用：,全球生物和医药业年产值,2000,亿美元，其中,R&D,费用在,130,亿美元。,新药开发成功率约为,1/10000,。从研发到市场准入平均花时,4800,个工作日，耗资,3,亿美元。,90,年代初期，制药业成本上升危及企业利润，,HTS,就应运而生。,药物作用的分子靶点：,细胞膜受体、离子通道蛋白、酶蛋白、细胞核受体、转运蛋白。,New Drug Research and Development,新药研究开发,研究过程,一、临床前研究与,IND,任务：,系统评价新的侯选药物，确定是否进入临床试验。这一阶段国外统称为,Investigational new drug,IND.,这一阶段的研究工作按,GLP,标准主要在实验室内进行。,1,、药学研究,:,化学原料药要确证药物的,化学结构,；多组分药物，确定其,主要药效成分的结构,。在此基础上研究：,制备工艺、制剂处方、药物理化常数、纯度检查、含量测定、质量稳定性研究,。,如何,进行药物的化学结构确证,元素分析,官能团分析,四大光谱分析（紫外吸收光谱、红外吸收光谱、核磁共振谱和质谱）,X,射线衍射,基本原则,提供充分的试验数据和图谱,正确进行解析,能够确凿证明药物分子的结构,如何,进行药物合成工艺的优选与研究,实验室研究阶段,小量试制阶段,中试生产阶段,实验室研究阶段任务,尽快合成,确证结构,测定理化参数,了解性质,分离纯化手段：反复分馏、多次重结晶、各种层析技术,小量试制阶段任务,提供足够数量的药物供临床前评价,研究,提出一条基本适合于中试生产的合成工艺路线,工艺路线的考虑因素,步骤越短、产率越高,流程简单、常规设备,原料充足、价格低廉,生产安全、环境保护,回收利用、降低成本,中试生产阶段,向工业生产过渡的重要环节,New Drug Research and Development,新药研究开发,新药研究过程,2,、临床前,药理学与毒理学评价,任务：,药物的主要药效学、一般药理学、药物代谢动力学研究，以阐明药物作用的靶器官、主要药物作用特征、对机体重要系统（神经、心血管、呼吸系统）的影响，并研究机体对受试药物的处置规律。,新药毒理学研究包括全身性用药的毒性试验、局部用药的毒性试验、特殊毒性试验和药物依赖性试验等。,目的：是保证临床用药的安全有效。,New Drug Research and Development,新药研究开发,新药研究过程,一般毒性试验,急性毒性试验,重复给药毒性试验（长期毒性试验）,特殊毒性试验,遗传毒性试验,生殖毒性试验,致癌毒性试验,药物依赖性试验,毒物代谢动力学试验,三、临床研究与,NDA,主要任务：,A,、按照,GCP,的要求和规定是在人体上确证新药的疗效和毒性。,B,、临床研究是评价侯选药物能否成为一个新药的最终的标准，这一阶段称为,New drug application,NDA.,New Drug Research and Development,期,初步临床药理学及人体安全评价试验,观察人体对新药的耐受程度和药物代谢动力学,为制定给药方案提供依据,期,是随机盲法对照临床试验。对新药有效性及安全性作出初步评价，推荐临床给药剂量。,期,是扩大的多中心临,床试验。应遵循随,机对照原则，进一,步评价有效性、安全性。,期,是新药上市后监测。,注意罕见不良反应。,新药临床试验分为,、,、,、,期,New Drug Research and Development,新药研究开发,新药研究过程,1,、选择合格的临床试验单位和研究人员；,2,、建立各单位的伦理委员会,(ethics committee);,3,、试验前获得病人的知情同意书,(informed consent);,4,、制定符合,GCP,要求的临床试验方案,(protocol),；,5,、建立标准化的,Standard operating procedure,SOP;,6,、进行正确的数据处理与统计分析,7,、建立临床试验质控监督体系。,四、临床研究的基本条件,New Drug Research and Development,新药研究开发,新药研究过程,五、新药的申报与审批,新药的申报：,完成,期临床试验后经国家药品监督管理局批准，即发给,“,新药证书持有,“,药品生产企业许可证,”,，并符合,GMP,要求的企业或车间可同时发给批准文号，取得批准文号的单位方可生产新药。,加快程序审评：,一类新药。,新药生产：,第一类化学药品及第一、二类中药批准后一律为试生产，试生产期为,2,年。其他各类新药一般批准为正式生产。,新药的补充申请：,增加规格、改进生产工艺、改变包装等。,新药保护：,一类新药,12,年，二、三类为,8,年，四、五类为,6,年。,临床前,主要药效学,研究,药物效应动力学,Pharmacodynamics,，,PD,简称药效学,研究药物对机体和病原体的作用原理的科学,基本要求：安全，有效、可控和稳定，其中有效性或疗效确切,-是新药治病救人的首要条件。,药效评价的任务,发现新药：用各种方法将原理作用不明的化合物的有效药理作用暴露出来,评价新药：通过系统严密的科学设计将已发现有效的药物的优缺点弄清楚，从而决定取舍,药效学,研究的基本内容,试验设计,试验方法,药效学实验的动物模型,药效学实验的指标,药效学研究的动物选择,对受试药物的要求,药效学实验的 剂量,给药途径和方法,药效学研究的对照,临床前,主要药效学研究时如何选择动物,实验动物管理条例,对,药效学研究中的用药剂量如何测定,必须做多种剂量的药效反应,ED50,越低，作用越强,给药量的确定,参考结构和作用相似的药物剂量作为应用剂量,或者以小鼠中毒剂量或致死剂量的1/5,或,1/10,作为应用剂量,按等比关系设立至少,3,个剂量组进行动物实验,考虑动物种属，年龄，给药途径调整给药剂量。,一般药理学（安全药理学）研究,是指新药主要药效作用以外广泛药理作用的研究，为临床提供更多的信息,应在人体试验前进行,具体试验可结合在毒性试验中或单独进行,一般药理学,研究的意义,了解新药的全面药理作用,有助于探索新药的作用机制,有助于发现新用途,补充毒性观察的不足，为长期毒性的试验设计提供参考,New Drug Research and Development,新药研究开发,新药研究过程,一般,药理学,研究内容,精神神经系统：观察给药后动物的外表、毛发、姿势、步态等行为活动。有无麻醉、催眠、镇静、体位变化等。,心血管系统：给药后动物心率、心律、血压、心电图等有无变化。,呼吸系统：给药后呼吸频率、幅度和节律变化。,其他：消化、泌尿、血液、免疫等,。,药物代谢动力学,pharmacokinetics,，,PK,简称药代动力学,研究药物在机体内的代谢变化,规律：,了解药物在体内吸收、分布、代谢和排泄过程的动态变化，并可定量描述,药物代谢动力学的意义,是临床前药理评价的主要内容之一,对药效学评价有作用,对毒理学评价有,作用,对新药合成有指导意义,New Drug Research and Development,新药研究开发,新药研究过程,药,代动力学,研究内容（吸收、,分布、代谢及,排泄动力学）,采用临床应用的给药途径，在治疗剂量范围内用三种剂量做药物浓度,-,时间曲线。明确是否有线性关系。,提供初步数学模型及吸收速率常数、消除速率常数、,Cmax,、,Tmax,、清除率、,t,1/2,等参数,。,测定血浆蛋白结合率；,分布试验至少测定心、肝、脾、肺、肾、脑、,胃肠道、生殖腺、体脂、骨骼肌等组织中的分布。,排泄试验至少做尿、粪、胆汁中的排泄量。,应写明化合物纯度。应用放射性标记者，要写 明标记部位。应结合层析等方法证明所测定的化合物是原型药物或代谢产物。,New Drug Research and Development,新药研究开发,新药研究过程毒性评价或安全性评价的基本目的,受试物,毒性作用,的表现和性质,剂量反应（效应）研究,确定毒作用的靶器官,确定损伤的可逆性,其它：敏感检测指标和生物学标志、,毒性作用,机制、毒物动力学、中毒的解救措施,毒理学研究方法,体内试验,体外试验,人体观察,流行病学研究,动物实验,人群调查,体内实验：以实验动物为模型，最终目的是通过外源化学物对实验动物的毒性反应，向,人外推,，以期评估外源化学物对人的危害及危险性。,体外实验：筛选和预测急性毒性和机制研究；,人体实验和流行病学调查：进一步深化和证实在动物实验中所得到的资料。,以动物实验为中心，动物实验的设计、实施、结果观察和评价是毒理学,研究的,基本功动物实验,整体动物实验,（,in vivo,）,体外试验,（,in vitro,）,一般毒性试 验,特殊毒性试 验,微 生 物试 验,哺乳动物试 验,急性毒性,亚急性毒性,亚慢性毒性,慢性毒性,致突变,致癌,致畸,致突变,器官水平,组织水平,细胞水平,亚细胞水平,分子水平,实验设计的统计原则,随机,：代表性,对照,：,鉴别处理因素与非处理因素的差异及处理因素效应大小，消除和减少随机化原则所不能控制的抽样误差及实验者操作熟练程度等造成的差异,空白,/,阴,/,阳性对照，自身对照，历史性对照,重复,：样本量、重复次数,毒理学实验的基本原则,动物选择,首先考虑代谢与毒性效应上与人一致,注重对受试物毒性敏感的动物物种,种属、品系、个体差异,自然寿命不太长、易于饲养和实验操作、经济易获得,动物年龄、性别,毒理学实验基本原则,根据对动物微生物控制的净化水平，实验动物分为：无菌动物、悉生动物、无特定病原体动物（,SPF,动物）、清洁动物和普通动物。,实验中小动物至少应为清洁动物及以上级别，国际上,SPF,动物已成为毒理学实验的标准实验动物。,剂量分组,实验动物必须暴露于高剂量，这是发现对人潜在危害的必需和可靠的办法。,除对照组外，一般设,3,个或,3,个以上剂量组，以观察剂量一反应,(,效应,),关系，确定受试化学物引起的毒效应及其毒性参数。,质量控制,优良实验室规范（,GLP,）,实验操作规程,试剂选择,仪器使用,实验环境,急性毒性,作用,acute toxicity,机体,一次,或,24h,内,多次,接触外源化学物后在,短期,内（最长,14,天）所产生的毒性效应，包括,一般行为,和,外观改变,、,大体形态变化,以及,死亡效应,一、急性毒性的概念,急性毒性（,acute toxicity,）,急性毒性的概念,In 1984,5,000 people died and 30,000 were permanently disabled due to exposure to methyl isocyanate,（异氰酸甲酯，,MIC,）,from an industrial accident in India,Many,people die each year from inhaling carbon monoxide from faulty heaters,急性毒性的概念,需要注意,急性接触的次数,一次,:,经口、注射；呼吸道、皮肤,(,一段时间,),24h,多次,中毒效应出现的时间,不能仅以接触毒物后毒性症状出现的时间，主要,以接触毒物的时间,，观察时间：,714,天,强度,一次性大剂量，中毒症状明显，常发生死亡,二、急性毒性试验的目的,求出致死剂量及其他急性毒性参数,观察中毒表现、毒作用强度和死亡情况，初步评价毒物的,毒性效应,特征,为其他毒理试验提供接触剂量和选择观察指标的依据,为毒理学机制研究提供线索,急性毒性的参数,半数致死剂量：,LD,50,（,1,）,LD,50,剂量,小于人的可能摄入量的,10,倍 放弃,（,2,）,LD,50,剂量大于人的可能摄入量的,10,倍 进入下一轮实验,LD,50,越小，该物质的毒性越大,化合物经口急性毒性分级标准,毒性分级,大鼠经口,LD,50,(mg/kg),大约相当体重,70kg,人的致死剂量,mg/kg,6,级，极毒,5,级，剧毒,4,级，中等毒,3,级，低毒,2,级，实际无毒,1,级，无毒,15000,稍尝,5004000,400030000,30000250000,25000050000,500000,急性毒性的参数,剂量,-,反应曲线,急性毒性的参数,ED,TD,：,ED,50,TD,50,霍恩法（,Horn,）：,4,个剂量组,平均移动内插法（,moving average interpolation,）,改进寇氏法,（,Karber,法、平均致死量法）,Bliss,法（,多用于新药临床毒理学研究，计算复杂,）,最大似然性法（,maximum likelihood method,），最精确的计算方法,LD,50,的几种计算方法,改进寇氏法,利用剂量对数与死亡率呈,S,型曲线而设计的方法,该法计算简便，准确率高，较为常用,要求：每组动物数相同、至少,5,个实验组、各剂量组组距呈等比级数、死亡率呈正态分布、最低剂量组死亡率,80,。,要素,三、急性毒性试验方法的要点,实验动物,染毒途径,染毒剂量,观察周期,观察指标的选择、计算方法和评价,急性毒性反应与人近似,易于饲养、操作方便,繁殖力较强，数量较大,价格较低，易于获得,（,一）实验动物的选择和要求,主要原则,除特殊需要外，首选哺乳动物,实验动物的物种和品系,啮齿类,（,rodent species,）,非啮齿类,（,nonrodent species,）,小鼠：昆明种、,NIH,、,ICR,大鼠：,Sprague-Dawley,（,SD,）、,Wistar,犬或猴,为了有利于预测化合物对人的危害，要求选择两种以上的实验动物，最好一种为啮齿类，一种为非啮齿类，分别求出其急性毒性参数。,根据接触途径选择实验动物,急性经口和吸入毒性试验,大鼠、小鼠,急性经皮毒性试验,成年大鼠、豚鼠、家兔,实验动物的物种和品系,大鼠：,180-240g,小鼠：,18-25g,家兔：,2-2.5kg,实验动物的年龄和体重,刚成年、健康、未曾交配和受孕的动物,小动物根据体重,同一次试验同一批实验动物体重变异范围不应超过平均体重的,20%,实验动物的性别,雌雄各半,如雌、雄动物毒效应有明显差异，应分别并求出雌性和雄性动物的,LD,50,值,特殊的试验研究可仅作单一性别的急性毒性试验,实验动物分组与数量,根据组数和每组数量来决定数量,LD,50,，,一般为,4-6,组,大、小鼠每组,10,只，犬类,6,只,严格遵循随机、均衡的原则,实验动物的预检,给药前检疫观察,大、小鼠、兔、豚鼠,1,周，犬猴,23,周,适应新环境，减少环境和生理条件变化可能对试验结果的影响,筛检健康状况不符合试验要求的动物,实验动物的给药前禁食处理,经口途径染毒，实验动物胃肠道内食物存留量对化学毒物的毒性可产生较明显的干扰,大、小鼠隔夜禁食，染毒,2h,后提供饲料,经口多次染毒可不禁食,（二）受试物及处理,理化特性,水溶液、混悬液、油溶液,水溶性受试物：蒸馏水、去离子水、生理盐水，保持与体内渗透压一致,（注射）,水不溶性受试物：溶于或悬浮于适当的有机溶剂中,受试物一般应临用前新配,受试物成分和配方应稳定不变,适宜容积染毒,毒性较大的受试物给药量较小,毒性较低的受试物常需较大量的染毒,给药容积根据染毒途径和实验动物,经口：,20ml/kg(,空腹动物,),经皮：,2ml/kg,静脉：,1ml/kg(5min,以上,),受试物及处理,(,三,),染毒方法,模拟实际接触的途径和方式,有利于不同化学物之间结果的比较,受试物的性质和用途,受试物毒性评价程序的要求,工业毒物：经呼吸道、皮肤,农用化学物：经口、皮肤、呼吸道,药品：经口、注射、皮肤,食品：经口,环境污染物：经口、呼吸道、皮肤,染毒途径,染毒方法,消化道、呼吸道、皮肤、注射,染毒途径影响受试物急性毒性,染毒方法,不同途径的吸收量和吸收速率,吸收速率：静脉注射,呼吸道,肌肉注射,腹腔注射,皮下注射,消化道,皮内注射,经皮,同一受试物不同染毒途径,LD,50,的大小通常符合上述规律,经口（胃肠道）染毒,LD,50,值来比较不同化学物急性毒性大小,灌胃,：溶液或混悬液，以注射器经导管注入胃内，,等容量灌胃法,吞咽胶囊：将受试物装入胶囊中，放至舌后部，迫使动物咽下。犬、猴,喂饲：将受试物掺入动物饲料或饮水中供实验动物自行摄入,染毒方法,空腹,灌胃后,2,3h,复食,灌胃法,静式吸入染毒,动式吸入染毒,经呼吸道染毒,气管内注入,染毒方法,吸入染毒,静式吸入染毒,染毒方法,方法：一定体积的密闭容器，加入易挥发的液态或气态受试物,染毒柜体积、动物数、时间，依据实验动物最低需气量计算,优点：简单、方便、受试物消耗少，适合于小鼠,缺点：氧气减少，浓度不稳定，经皮吸收，不适合稍大动物，挥发性不强的受试物用此法受限,实验动物最低需气量及不同体积染毒柜应放置动物数关系,动物种属,呼吸通气量,(L/,小时,),最低需气量,(L/,小时,),不同容积染毒柜放置动物数,(,只,),25L,50L,100L,300L,小 鼠,大 鼠,1.45,10.18,3.45,30.5,35,610,1,1215,12,3640,56,动式吸入染毒,将实验动物处于有空气流动的染毒柜中，新鲜空气不断流入，污染空气不断流出。温度、湿度、氧及二氧化碳分压相对恒定，并有随时补充受试物，维持浓度稳定。可采样监测受试物浓度，可持续接触受试物，无时间限制,染毒方法,动式吸入染毒装置的组成,染毒柜,机械通风系统,配气系统,染毒方法,动式吸入染毒设备,A,整体暴露,B,口鼻暴露,动式吸入染毒优缺点,染毒方法,优点：受试物浓度和氧分压比较稳定,缺点：设备要求高，消耗受试物量很大，操作比较复杂，费时费工,经皮肤染毒,染毒方法,农药、化妆品、工业、环境、外用药物,常用大鼠,染毒方式：,脱毛：化学或机械法脱毛（体表面积的,10%,）,染毒：局部涂敷或大鼠、小鼠浸尾法,经注射途径染毒,染毒方法,注射药品、机制研究、毒物代谢动力学,分类：,几种动物不同注射途径注射量,(ml),范围,注射途径,小鼠,大鼠,豚鼠,兔,狗,静脉,肌肉,皮下,腹腔,0.20.5,0.10.2,0.10.5,0.21.0,1.02.0,0.20.5,0.51.0,1.03.0,1.05.0,0.20.5,0.51.0,2.05.0,3.010,0.51.0,1.03.0,5.010.0,5.015.0,2.05.0,3.010.0,（四）剂量选择,参考新化学物的理化性质,参考相关资料,先用少量动物，以较大的剂量间隔染毒，找出,10%-90%,（或,0%-100%,）的致死剂量范围，然后设计正式实验的剂量和分组,根据试验所选的,LD,50,计算方法确定剂量组数预试一般每组,4,只动物，每次,3,组，以,10,倍为组距。根据第一次预试结果判定需要增加还是降低剂量，组距保持不变，直至粗略预测到,LD,100,及,LD,0,为止。,各组剂量的计算,i=,（,lgLD,90,-lgLD,10,）,/,（,n-1,）,或,i=,（,lgLD,100,-lgLD,0,）,/,（,n-1,）,i,为组距，,n,为设计的剂量组数。以最低剂量值（,LD,0,或,LD,10,）的对数剂量加上一个,i,值，即是第二个剂量组的对数剂量，依次类推直至最高剂量组,剂量选择,剂量选择,化学物,LD,50,大于,2g/kg,或,5g/kg,，表明毒性不大,我国药品的毒理研究指导原则规定要以最大容积最高浓度给予动物后未见死亡,不必计算,LD,50,全面观察动物的各种反应和变化，仔细分析实验动物在染毒后出现的,中毒表现,、,剂量效应,、,时间分布,。观察记录的内容：,中毒体征及发生过程,死亡情况和时间分布,体重,病理形态学变化,（五）毒性作用观察,毒性作用观察,中毒体征及发生过程,详细观察和记录动物出现的中毒体征,发生时间,体征发展的经过,各个系统的特征,初步确定急性毒性靶器官,不同表现提供毒性机制的信息,续表,6-1,啮齿类动物急性中毒表现,毒性作用观察,死亡情况和时间分布,实验动物的死亡数对,LD,50,值产生明显影响,分析中毒死亡时间的分布规律可以提供重要信息：原形，代谢,体重,毒性作用观察,反映动物中毒后综合性整体变化，比较客观简便的量化指标,应定期多次称量动物的体重变化，一般为每周,1,次或,2,次,对体重指标的变化要仔细观察和分析,体重变化的原因,毒性作用观察,影响食欲或消化系统的功能,影响食物的吸收和利用,影响水的摄取,肾功能急性损伤,毒性作用观察,病理检查,死亡动物：大体病理变化，如脏器外观、大小、色泽的变化，有无充血、出血、水肿或其他改变,存活动物：观察期结束时亦应进行解剖检查，必要时做组织病理学检查,（六）观察时间和周期,染毒以后应即刻开始观察动物中毒表现和死亡情况,给药当天应连续或多次观察，以后可根据情况，每天,2,次或多次观察直至试验周期结束,观察周期一般为,14,天,LD,50,计算,时以观察周期内各组动物的总死亡数为依据,不同化学物质引起动物死亡的时间存在个体差异,速杀型化学毒物仅计算,24h,的死亡率,观察时间和周期,急性毒性试验求出,LD,50,值,，通过,LD,50,值进行急性毒性分级,(,acute toxicity classification,),，评价毒物的急性毒性强弱，比较毒物的急性毒性大小,四、急性毒性分级和评价,急性毒性分级和评价,急性毒性分级和评价,按照急性毒性分级标准评价毒性大小是相对粗略的分级,报告：,LD,50,、急性毒性级别；中毒体征、出现体征时间、死亡前征兆、死亡时间和剂量组间分布、存活动物的体重变化和恢复情况、死亡动物的病理变化,Introduction,Method and materials,Results,Discussions,1,2,3,4,举 例,举 例,1,材料与方法,1.1,主要试剂：四硼酸钠、亚硒酸钠,举 例,举 例,结果,急性毒性试验：急性硒中毒动物在服药,5min,后出现急性硒中毒症状，最初表现为呕吐、腹泻，然后呼吸困难，四肢痉挛，直至死亡。急性硼中毒动物在服药,60min,后出现急性中毒症状，表现为不好动、腹泻、口鼻出血，甚至惊厥死亡,举 例,结果,举 例,结果,联合作用评价结果,举 例,讨论,LD,50,：四硼酸钠对雌、雄性大鼠,1470mg/kg,。亚硒酸钠对雄性大鼠,14.70mg/kg,，对雌性大鼠,6.81mg/kg,。联合对大鼠的急性毒性，雄性大鼠为,1727.10mg/kg,，雌性大鼠,1717.94mg/kg,举 例,讨论,我国工业毒物急性毒性分级标准评价：本实验四硼酸钠与亚硒酸钠混合毒物属于低毒类物质。该毒物的值可为亚慢性毒性实验提供染毒剂量水平的设计依据,举 例,不同,阶段的毒理学试验项目,第一阶段：急性毒性试验,第二阶段：遗传毒性试验、传统致畸试验、短期喂养试验,第三阶段：亚慢性毒性试验,第四阶段：慢性毒性试验（包括致癌试验）,