基因工程实验biochemlab.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,基因工程实验,生物化学资料网,实验目录,实验一 实验计划表,实验二 染色体DNA的提取,实验三 PCR扩增,实验四 凝胶电泳法回收目的DNA及其体外连接,实验五 感受态细胞的制备,实验六 重组质粒的转化,实验七 质粒的提取,实验八 重组质粒的酶切鉴定,实验一 实验计划表,一、实验目的,、了解本学期整体的实验流程及安排。,、熟练使用微量移液器。,、学习制备琼脂糖凝胶。,生物化学资料网,基因工程（,Gene Engineering,）又称重组技术，把不同生物的与载体相连，并导入到受体细胞中去增殖、表达。基因工程包括切、接、转、增、检五大要素。,二、实验原理,生物化学资料网,凝胶电泳系统、微量移液器、三角瓶、微波炉、铲子、手套,琼脂糖、1,TBE、加样缓冲液,三、实验用具及试剂,目的基因的获取,基因组总提取凝胶电泳检测,扩增目的基因 产物的电泳检测,产物纯化获得目的基因,四、实验操作,1.本学期实验计划,生物化学资料网,使用注意事项,未装吸头的微量移液器绝对不可用来吸取任何液体。,一定要再允许范围内设定容量，千万不要将读数的调节超出其适用的刻度范围，否则会造成损坏。,不要横放带有残留液体吸头的移液器,不要用大量程的移液器移取小体积样品,微量移液器每日用完后，应旋转到最大刻度，让弹簧恢复原形，保持弹性。,为了确保微量移液器的准确性，移液器必须定期进行校准。,生物化学资料网,3.琼脂糖凝胶制作,选择好胶盒、胶板和梳子，洗净，把胶板放入胶盒中，梳子插上。,量取25ml 1TBE溶液放入锥形瓶或烧杯中,称量0.25g 琼脂糖，倒入锥形瓶中,将锥形瓶放入微波炉中，让溶液沸腾2-3次，琼脂糖彻底融化,锥形瓶取出，稍稍冷却后倒入胶盒中,等待琼脂糖冷却凝固形成点样孔后即可,掌握酚氯仿法提取的原理和操作。,一、实验目的,实验二基因组总,提取,生物的大部分或几乎全部都集中在细胞核或类核中。DNA在体内通常都与蛋白质结合，蛋白质对DNA制品的污染常影响到以后的DNA操作过程，因此需把蛋白质除去，一般采用酚氯仿抽提法。苯酚、氯仿对蛋白质有极强的变性作用，而对DNA无影响。经苯酚、氯仿抽提后，蛋白质变性而被离心沉降到酚相与水相的界面，DNA则留在水相，少量的或与DNA紧密结合的蛋白质可用蛋白酶予以去除。DNA制品中少量的RNA无影响，必要时可加入不含DNase的RNase去除RNA污染。,二、实验原理,消化缓冲液:TE、EDTA、NaCl、SDS、蛋白酶K,Tris平衡酚、氯仿:异戊醇(24:1)，NaAc，无水乙醇，70%乙醇,三、实验用具与试剂,微量移液器、高速离心机、1.5ml管、吸头、烘箱、水浴锅、1.5ml管架、胶头滴管、冰箱,、切取组织，剪碎放入研钵(越细越好)，磨成粉末。以消化缓冲液处理55水浴过夜，获得组织消化液。,、取出消化组织液，5000rpm，min，取上清液于新离心管。,、加等体积ris-平衡酚，轻轻混匀min。,4、1000rpm，10min，留上清，取上清液于新离心管。,、加等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提，轻轻混匀min。,、同。,、加等体积氯仿:异戊醇，轻轻混匀min。,、同。,四、实验步骤,、加1/10体积3mol/LNaAc，及.倍体积预冷（）无水乙醇，混匀。沉淀min。,、12000rpm，15min，弃上清。,、加70%乙醇1ml，混匀。,、同。,、管放置于烘箱中烘干。,、加ul TE或ddH,2,O溶解。,、琼脂糖凝胶电泳检测。提取染色体的基本原理是什么？操作中应该注意什么？,五、思考题,、学习扩增的基本原理。,、掌握技术的常规操作。,、了解扩增的参数设计。,一、实验目的,实验三,扩增,、聚合酶链反应(Polymerase chain reaction，PCR)：利用核酸变、复性的性质，以待扩增的为模板，在体外由引物介导的酶促合成特异片段的过程。,、反应体系,引物、dNTP、Mg,、模板、Taq DNA聚合酶，Buffer。,二、实验原理,、循环参数,9,5min,9,30s,5 30s,72 30s,goto times,72 10min,Taq DNA聚合酶，PCR缓冲液，MgCl,2,，dNTP，引物，模板，ddH,2,O，TBE电泳缓冲液，EB,加样缓冲液,三、实验用具与试剂,旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，0.2ml PCR微量离心管，PCR仪，台式离心机，琼脂糖凝胶电泳系统，紫外凝胶成像系统,、在0.2ml PCR 微量离心管中配制30ul反应体系。,dd water 20.5ul,10PCR buffer（不含MgCl2）3ul,25mM MgCl2 2ul,10mmol/L dNTP 1ul,10mol/L Primer 1 1ul,10mol/L primer 2,1ul,模板,1ul,Taq,酶 0.5u,l,总体积,30ul,四、实验步骤,、在离心机中混匀。,、管放入仪中，按照原理中的条件设置程序，进行反应。,、PCR结束后，取3ul PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。,五、思考题,PCR中产生非特异性条带的原因可能有哪些？,实验四 凝胶电泳法回收目的DNA及其体外连接,一、实验目的,1.学习和掌握从琼脂糖凝胶中回收DNA片段的方法。,2.掌握DNA体外连接的方法。,二、实验原理,DNA,分子在琼脂糖凝胶中的电泳速率与以下因素有关,DNA,分子大小,DNA,分子构象,琼脂糖凝胶浓度,电泳所用电压,电泳缓冲液,生物化学资料网,2.利用硅胶膜在高盐浓度时能特异性吸附DNA，而在低盐浓度时可使DNA被洗脱的原理纯化DNA。,3.Taq酶参与PCR反应中，产物双链核酸中的3端各多连接一个脱氧腺苷酸A，与商业开发的pMD18-T载体可在DNA连接酶作用下，按照碱基配对形成环状的完整质粒。,生物化学资料网,三、实验用具及试剂,凝胶电泳系统，刀片，紫外仪，酒精灯,1.5ml EP管，1.5ml EP管架，65 水浴锅,PCR产物，1TBE，加样缓冲液，TakaRa胶回收试剂盒，TA克隆试剂盒，DL2000 marker,生物化学资料网,1.2%琼脂糖凝胶电泳,2.在紫外灯下用干净的手术刀割下含有目的DNA琼脂糖块装在1.5ml的EP管中称量减1克即为凝胶块重量,3.加入5个凝胶体积量的DR-Buffer,4.混匀 65加热融化凝胶块,5.加入DR-,Buffer量的1/2 体积的DR-Buffer,当目的片段小于400bp再加入终浓度为20%的异丙醇,6.将上述溶液short后转移至spin coloumn中12000rpm,1min 弃滤液,7.加入500ul RinseA 12000rpm 30s 弃滤液,8.加入700ul RinseB 12000rpm 30s弃滤液,9.同8,四、实验步骤,10.将spin coloumn安置于新的1.5ml EP管中 在spin coloumn膜中央加25ulElution Buffer 放入烘箱1min 12000rpm 1min 保存1.5ml EP管1%胶检测,11.链接反应（冰上操作）,在一支0.2 ml EP管中加入以下试剂：,纯化的目的DNA片段,4.5ul,Vector,0.5ul,连接液,5ul,混匀 16,连接过夜,五、思考题,为什么连接反应的温度要定在16度？,生物化学资料网,实验五 感受态细胞的制备,掌握感受态细胞的制备方法,2.,学习和理解影响细胞感受态的因素,一、实验目的,生物化学资料网,感受态是指受体（或者宿主）细胞最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是有受体菌的遗传性所决定的。转化过程中所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，既不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。用Cacl,2,处理受体细胞，使细胞的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞。,二、实验原理,生物化学资料网,三、实验用具及试剂,培养皿，离心管，冷冻高速离心机，超低温冰箱，摇床，锥形瓶,Cacl,2，,LB Amp,-,液体培养基,，,LB Amp,-,固体培养基，DH5,甘油菌,1.先从保存菌种DH52(-70),划线培16h(37),2.从平板中挑取一个单菌落移到4ml，LB Amp,-,培养基中，37摇荡过夜180250rpm,3.按1%的接种量将过夜培养的菌转接于50ml LB Amp,-,的培养基中，37，250rpm（2h2.5h）,4.当培养菌生长至OD,600,达0.50.6时（约22.5h），将培养菌取出，在无菌条件下将细菌转移至50ml无菌聚乙烯离心管中，冰浴10min，以使培养液冷至0,四、实验步骤,5.4，5000rpm/min,7min,6.细胞沉淀用10ml冰冷的Cacl,2,溶液重悬于4，5000rpm/min，5min,7.细胞沉淀用10ml冰冷的Cacl,2,溶液重悬冰上放置30min，于4，5000rpm/min，5min,8.用2ml冰冷Cacl,2,溶液重悬各管细胞，然后按每管100ul的量分装于预冷的0.5ml EP管中存于-70,生物化学资料网,五、思考题,如果实验对照组本不该长菌落的平板上长出了一些菌落，你将如何解释这种想象？,生物化学资料网,实验六 重组质粒的转化,一、实验目的,掌握重组质粒的转化方法,生物化学资料网,二、实验原理,1.转化是将外源DNA 分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段。,2.化学转化法,利用Cacl,2,处理感受态受体细胞，然后通过热休克处理，即置于42高温热激90s，热休克后，是受体菌在不含抗生素的培养液中生长至少半小时以上，使其表达足够蛋白质，以便能在含抗生素的平板上生长菌落。,生物化学资料网,三、实验用具及试剂,水浴锅，培养箱，枪头，冰盒，超净台，微量加样器，制冰机，牙签,DH5,感受态细胞，连接产物，LB Amp-液体培养基，LB Amp+液体培养基，LB Amp+培养基平板,1.5ul连接液加100ul感受态细胞（-70取出），置冰上，加后轻轻旋动,2.冰上静置30min,3.42水浴90s热休克，冰上3min,4.加10ul LB（Amp,-,）至菌液，混匀（颠倒）,5.37烘箱30min,6.37，摇床 30min 180rpm,7.涂平板 100ul/板，37培养1216h,8.挑克隆 挑取菌落接入5ml LB Amp+液体培养基中，37 振荡过夜,四、实验步骤,生物化学资料网,五、思考题,当质粒加入宿主细胞进行转化，再涂布在含有Amp的LB培养基平板前，为什么要在LB培养基中培养1h?,生物化学资料网,实验七 质粒的提取,1.学习质粒DNA提取的基本原理,2.掌握质粒最常用提取方法,一、实验目的,生物化学资料网二、实验原理,细菌质粒DNA的提取是根据环状质粒DNA分子具有相对分子质量较小、易于复性的特点进行的，碱法是常用的提取方法。在热或碱性条件下DNA分子双链解开，若此时将溶液置于复性条件，由于变性的质粒分子能在较短的时间内复性而染色体DNA不能复性，从而分离质粒DNA。,生物化学资料网,三、实验用具及试剂,高速离心机、微量移液器、枪头、凝胶电泳系统，凝胶紫外成像系统，EP管,EB，加样缓冲液，阳性克隆的培养液，质粒提取试剂盒,生物化学资料网,四、实验操作,1.取14ml过夜培养的阳性克隆菌液，12000rpm离心2min,弃上清,2.用250ul的solution(含RNaseA1)充分悬浮细菌沉淀,3.加入250ul的solution,轻轻上下翻转混合56次使菌体充分裂解，形成透明溶液,4.加入400ul的4 预冷的solution，轻轻上下翻转混合56次，直至形成紧实凝集块，室温静置2min,生物化学资料网,5.室温12000rpm，10min，取上清,6.将试剂盒中的Spin column安置于collection Tube上,7.将操作6中的上清液转移至Spin column中12000rpm，1min，弃滤液,8.将500ul的RinseA加入Spin column中，12000rpm，30s，弃滤液,9.加700ul的RinseB加入Spin column中，12000rpm，30s，弃滤液,10.同9,生物化学资料网,11.将Spin column安置于新的1.5ml离心管上,在Spin column膜中央处加入60ul灭菌或Elution Buffer,室温静置1min,12.12000rpm，1min洗脱DNA,13.凝胶电泳检测提取效果，并以空载体做对照，从质粒大小上初步判断是否有外源基因进入载体,生物化学资料网,五、思考题,在碱法提取质粒DNA操作过程中应该注意哪些问题？,生物化学资料网,实验八 重组质粒的酶切鉴定,1.学习和掌握限制性内切酶的特性,2.了解重组质粒的鉴定方法，重点掌握重组质粒的酶切鉴定方法,一、实验目的,生物化学资料网,二、实验原理,1.限制性核酸内切酶：是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶。是体外剪切基因片段的重要工具，所以常常与核酸聚合酶、连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶。限制性核酸内切酶不仅是DNA重组中重要的工具，而且还可以用于基因组酶切图谱的鉴定,生物化学资料网,2.影响核酸限制性内切酶活性的因素,DNA,的纯度；,DNA,的甲基化程度；,酶切消化反应的温度；,DNA,的分子结构；,溶液中离子浓度及种类；,缓冲液的,pH,值。,生物化学资料网,三、实验用品及试剂,恒温水浴锅、微量加样器、枪头、凝胶电泳系统、凝胶成像系统,酶,Hind,III 和,BamH,I,核酸内切酶（Takara）,Hind,III,和,BamH,I酶解缓冲液(10通用 buffer)，琼脂糖，,pMD18-T质粒，加样缓冲液,生物化学资料网,四、实验步骤,对初步确定有外源基因进入的质粒用限制性内切酶进行切割，进行进一步的鉴定,重组质粒,DNA 10ul,ddH,2,O 7ul,10,通用缓冲液,2ul,BamH,I,（,10U/ul,）,0.5ul,Hind III,（,10U/ul,）,0.5ul,总体积,20ul,2.37 保温0.5-1h,3.利用空载体与目的基因片段为对照，对酶切后的片段进行比对，从酶切后的片段的数目及大小上进行确认,五、思考题,除了酶切鉴定重组质粒外，还可以选用何种方法鉴定？,