猪人工授精实验室关键技术朱士恩.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,猪人工授精实验室关键技术,中国农业大学动物科技学院,朱士恩,zhushien,Tel:[phone],2007.04.26,报告内容,猪人工授精的历史及现状,猪人工授精的实验室设备,猪人工授精的意义,猪精液的人工采集,猪精液的品质检查,猪精液的保存处理,猪精液处理后输精,猪人工授精的历史及现状,该技术始于20世纪30年代，已有70多年的历史,我国始于上世纪50年代，未达到理想的推广程度,20世纪90年代后，该技术得到迅速普及,目前该技术已成为猪配种繁殖的主要手段之一,猪人工授精的意义,减少饲养头数充分发挥优秀公猪的遗传潜力,减少疾病传播，提高生产效率，获得更高的经济效益,与繁殖控制技术结合，利于现代化养猪技术体系建立,精液保存技术的发展，加快猪育种进程,公畜使用不受其生理年限限制,便于引入外源群体基因，加快遗传进展的扩散速度,实现科学养猪，养猪生产规模化，现代化的重要手段,精液的冷冻保存，可降低活体保种成本，防止基因漂变,猪人工授精的实验室设备,仪 器,显微镜、精子密度测定仪、电子天平、恒温水浴,锅、恒温精液保存箱、pH计（试纸）、精子计数,数器、移液器等,器 皿,温度计、量筒、烧杯、保温瓶、,采精杯,、玻璃棒等,消耗品,纱布、输精瓶、输精管、乳胶手套、采精袋、稀,稀释粉等,猪精液的采集,采集前的准备工作,猪精液采精的方法,手握采精法,用温的生理盐水清洗猪腹部和包皮,一手带双层手套，另一手持集精杯,公猪伸出阴茎时，脱去外层手套,用手紧握伸出的公猪阴茎螺旋状龟头,顺其向前冲力将阴茎的“S”状弯曲拉直,收集浓份精液于集精杯的一次性采精袋,采精流程,成年公猪：2次/周,采精频率,青年公猪：1次/周,猪精液的品质检查,品质检查的目的,精液显微镜检查,精液外观检查,精液的外观检查,颜 色,乳白色或浅灰色,呈云雾状,绿色、黄色,浅红色、红褐色,气 味,略带腥味,恶臭等异常气味,pH 值,正常精液pH值为 7.07.8,pH值越低,精子密度越大,采精量,电子天平称量法,按1g=1 ml计,射精量为200500 ml,正常,正常,异常,异常,精液的显微镜检查,精子活率检查,精子畸形率检查,精子密度检查,精子活率检查,玻片升温至37,取精液10l制片,于37恒温台上,相差显微镜下,400倍观察精子,与受精能力相关,精子活率,精液品质的指标,按0.11.0的十级评分法进行评估,目测估测法,活率要求,鲜精活率,0.7才可进行稀释配制,保存精液活率,0.6才可以使用,精子密度检查,估测法,精子密度仪法,血细胞计数法,主观性强，误差大,一个精子为“密”,一个精子为“中”,一个精子为“稀”,最准确，但速度慢,滴上1滴稀释精液,原精液200L,3%NaCl稀释10倍,计数板上放盖玻片,计数5个中方格精子,将该数乘以50万,方便、时间短、重复性好,猪精子密度一般为23亿/ml,生产上主要以精子密度仪法检测,精子计数,注意：让稀释后的精液通过毛细作用自行吸入！,用吸管稀释后精液注入计数室,共有两个对称的计数室,精子计数,精子计数室及一个中方格,精子计数方法,以图示次序计数，精子的头部为准，依数上不数下，数左不数右的原则进行计数格线上的精子。白色精子不计数,计算公式,1ml原精液内的精子数5个中方个数的精子数5 10 1000 稀释倍数,（如为原精液不 稀释倍数）,精子畸形率检查,取中层精液抹片,固定液固定20min,Giemsa染色90min,水洗并风干,置1000倍油镜下,观察精子 300个,畸形率检查方法,相差显微镜直接观察,伊红或姬姆萨等染色后普通显微镜观察,畸形率要求,一般要求不超过18%为宜,染色后显微镜观查,仪器观察精子活力及膜的完整性,A.死精子区域:PI,阳性;AnV-FITC,阴性。,B.死精子区域:PI,阳性;AnV-FITC,阳性。,C.活精子区域:PI,阴性;AnV-FITC,阴性。,D.活精子区域:PI,阴性;AnV-FITC,阳性。,A),H33342,标记所有精子细胞核呈现蓝色荧光；,PI,标记死精子的细胞核呈现红色荧光；,发生顶体反应或顶体膜破损的精子被,FITC-PNA,标记,呈现绿色顶体。,荧光显微镜下观察精子的活力和顶体状态,流式细胞仪观察精子的活力和顶体状态,B),C),猪精液的保存处理,精液的稀释,精液的分装,精液的保存,精液的冷冻及解冻,精液的运输,精液的稀释,器具须消毒，使用前，用少量稀释液冲洗一遍,品质检查不合格(活率0.7)的精液不能稀释,精液采集后尽快稀释,原精贮存时间不宜超过30min,稀释时严禁太阳光直射精液,应于较暗处操作,精液要求等温稀释,以精液为标准,调节稀释液温度,稀释液沿杯壁加入到精液中,沿一个方向搅拌混匀,高倍稀释时先进行低倍稀释,以防“稀释打击”,稀释倍数:根据精液的品质,输精量,配种母猪头数,以每个输精剂量40亿/80 100ml来确定稀释倍数,稀释后要求静置片刻再作精子活率检查,采精量200 ml,活率0.8,密度2亿/ml,每个输精剂量含40亿/100 ml。,总精子数,=200 ml 2亿/ml=400亿,稀释份数,=400亿 0.8/40亿=8份,需稀释液,=8100 ml-200 ml=600 ml,精液的分装,精液的分装,瓶装,管装,袋装,分装简单方便,用于冷冻保存,输精方便，但需分装机,分装后标注,公猪品种,公猪耳号,生产日期,稀释液名称,稀释后分装的猪精液,精液的保存,保存温度,常温（17等）,低温（4等）,冷冻（-196）,生产上：常温17,常温保存要求,精液需缓慢降温，室温12h或纱布包裹,每12h将精液摇匀1次，要轻缓均匀,注意冰箱内温度的变化防止温度升高或降低,减少保存箱开关次数，以减少对精子的影响,使用前检查活率，活率,0.6精液应弃之,用稀释液保存的精液，应尽快用完,精液的冷冻及解冻方法,(Westendorf et al.设计，Bwanga et al 改进),稀释流程,冷冻流程,解冻流程,精液采集并进行质量检查,用BTS稀释，降温（15，3 h）,离心（,800g,，10 min），弃除上清,用LEY稀释，降温（5，2 h）,5条件下，用含甘油的LEY稀释,分装于5ml扁平袋（细管）或0.5 ml细管,置于冷冻支架并移入程序冷冻仪（5）,3/min，5,-5，保持 1 min结晶,50/min，-5,-140，,液氮储存,5ml扁平袋:50，13 s,5ml 细管:50 ，40 s,0.5ml 细管:50，12 s或37,20s,精液的运输,精液运输关键,保温、防震、避光,运输注意事项,运输前应检查活率，低于0.7的精液严禁调出,包装瓶（袋）应排尽空气，以减少运输震荡,运输过程中，放入保温箱中保温（1618）,到达目的地，检查精子活率，合格方可接收,运输过程中，应严格避光,输精,输精的时间,输精的方法,填写输精记录,人工授精,（Artifical insemination：AI）,借助于专门的器械，用人工的方法采取公畜精液，经体外检查与处理后，再输入发情母畜的生殖道内，使其受胎的一种繁殖技术。,人工授精技术包括：,采精,精液品质评定,稀释,保存,运输,输精等环节。,输精的时间,输精时间,第一次输精：出现静立反射后12h左右进行,第二次输精：第一次输精后812h进行,竖耳，阴部红肿，出现静立反射,母猪接收公猪或其它母猪的爬跨,有爬跨其它母猪的行为,发情母猪表现,猪发情症状与人工授精最佳时间,受精率：,静立前一天：,10%,；静立第一天：,70%,；静立第二天：,98%,；静立第三天：,15%,最佳时间：,静立后,1224h,输 精 方 法,子宫颈输精法,intra-cervical insemination，intra-CAI,子宫内输精法,post-cervical insemination，post-CAI子宫角输精法,deep uterine insemination，DUI,宫颈输精法,消毒清洁双手，戴上消毒手套,清洁母猪外阴、尾根及臀部周围,取出灭菌后的输精管，在其前端涂上润滑剂,将输精管45向上插入母猪生殖道内直到子宫颈,取出精液轻轻摇匀，去除瓶嘴，接输精管，输精,输精完毕后抽出输精管,输精流程,输精次数,一个情期内输精两次(间隔812 h),猪人工授精,精子在母畜生殖道运行中的损耗,射精后的精子在母畜生殖道内要通过三道屏障：,子宫颈,子宫腺窝与宫管结合部,壶峡连接部,精子在受精前的准备,（精子获能与顶体反应）,精子在母畜生殖道内存活时间和维持受精能力的时间,动物品种,牛,猪,羊,马,维持存活时间,1556h,50h,48h,6d,维持受精能力,1820,h,812,h,1216,h,4,20h,各种家畜精液的稀释倍数和输精剂量,家畜种类,稀释比例,输精计量（,ml,）,有效精子数（亿）,猪,1:13,3050,1020,牛,1:1040,11.5,0.10.5,马,1:13,2030,2.55.0,羊,1:13,0.1,0.20.5,冻精解冻和输精过程中应注意的事项,解冻水浴温度应为39适宜;,三防(寒、热、光)，一快(输精时间);,保证有效精子数(活率0.3);,严格操作规程(卫生、消毒、禁止吸烟、解冻方式要规范);,检查卵泡的发育程度（内窥镜输精法）。,猪人工授精最佳部位,猪腹腔内窥镜于子宫角输精,谢谢大家！,