生物制药基因工程药物.ppt

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products for used in humans,Genentech,公司,1976,年，,27,岁的风险投资人,Robert Swanson,与,University of California,的教授,Herb Boyer,共饮了几杯啤酒，讨论了基因工程技术的商业前景。讨论结束时，他们决定建立一个公司，并取名为,Genentech,（,Gen,etic,En,gineering,Tech,nology,）。,第一个基因工程公司在学术界和商业界的满腹怀疑中诞生了！,Genentech,的骄人业绩,1976,Genentech,创立,1977,首次在微生物里生产了人蛋白生长激素抑制素,1978,克隆了人胰岛素基因,1979,克隆了人生长激素素基因,1980,公司上市，募集,$35million,1982,第一个基因重组药（人胰岛素）上市（转让给,Lilly,公司）,1984,第一个,VIII,因子，转让给,Cutter Biological,1985,第一个自己生产的产品（人生长激素）,1987,生产组织纤溶酶原激活剂（,tPA,）,1990,生产,interferon,1,1990,与瑞士,Roche,医药公司合并（,$2.1billion,）,美国已批准上市的基因工程药物（,1997.7,）,中文名称,商品名称,英文名缩写,开发公司,胰岛素,Humulin,Novolin,Humalog,Insulin,lispoinsulin,Lilly,Novo Nordisk,Lilly,人生长激素,Protropin,Humatrope,NutropinAQ,rhuGH,Genentech,Lilly,Genentech,干扰素,IntronA,ReferonA,Avonix,Betaseron,Actimmune,Alferon-N,rhuIFNa2b,rhuIFNa2a,rhuIFN,rhuIFN,1b,rhuIFN,1b,rhuIFNa3,Schering,Roche,Biogen,Chiron,Genentech,Interferon Science,白细胞介素,2,Proleukin,rhuIL2,Chiron,粒细胞集落刺激因子,Neupogen,rhuG-CSF,Amgen,粒细胞巨噬细胞集落刺激因子,Leukine,rhuGM-GSF,Immunex,红细胞生成素,Epogen,Procrit,rhuEPO,Amgen,Ortho,组织溶纤原激活剂,Activase,rhuTPA,Genentech,生长激素,Serostin,somatotropin,Serono,促生长素,Nutropin,Saizen,Genotropin,Norditropin,Bio-Tropin,somatopin,Genentech,Serono,Pharma/Upjohn,Novo Nordisk,Biotech General,中国已经批准上市的基因工程药物（,1998.5,）,药品名缩写,开发生产公司,批准时间,适应症,rhuINFa1b(,外用）,rhuINFa1b,rhuINFa2a,长春生研所,上海生研所,深圳兴科,长春生研所,长生药业,三生药业,1989,试,1996,正,1996,正,1996,正,1997,正,1997,正,病毒性角膜炎,HBV,HCV,HBV,HCV,尖锐湿疣，疱疹等,HBV,HCV,HBV,HCV,rhuIFNa2b,新大洲药业,里亚哈尔,华立达,安科,华新,1997,正,1996,正,1997,正,1997,试,1997,试,HBV,HCV,HBV,HCV,HBV,HCV,HBV,HCV,HBV,HCV,rhuINF,上海生研所,克隆,丽珠生物工程,1994,试,1995,试,1995,试,类风湿,类风湿,类风湿,rhuIL2,长春生研所,长春药业,四环制药,华新,三生药业,深圳兴科,中华合通,金丝利,康利制药,1997,正,1997,正,1997,正,1997,正,1997,正,1997,正,1995,试,1995,试,1995,试,癌辅助治疗,癌辅助治疗,癌辅助治疗,癌辅助治疗,癌辅助治疗,癌辅助治疗,癌辅助治疗,癌辅助治疗,癌辅助治疗,rhuG-CSF,九源,1997,试,化疗生白血病,rhuGM-CSF,特宝,1997,试,化疗生白血病,rSK,医大实业,1996,试,心梗溶栓,rhuEPO,华欣,永铭维沃,1997,试,1997,试,再生障碍性贫血,再生障碍性贫血,bFGF,（外用）,珠海东大,1996,试,创伤，烧伤,一、基因工程与医药卫生,1,、生产基因工程药品,（,1,）传统的某些药品（如动物激素）生产：,控制某种物质合成基因,转基因“工程菌”,基因工程药品,基因表达产物,基因工程,发酵,分离提取,从动物组织中提取，生产量小，价格昂贵。,（,3,）基因工程生产的药品,重组人生长激素,重组人白细胞介素,重组人干扰素,重组人胰岛素,发酵罐,（,2,）基因工程方法生产药品的方法：,13,二、基因工程菌大肠杆菌表达系统,一：大肠杆菌表达外源基因的优势,二 大肠杆菌表达载体的基本组成,三 常用的大肠杆菌表达载体,四 真核基因在大肠杆菌中的表达,五 大肠杆菌表达真核基因存在的问题,六 基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制,七,.,人胰岛素的生产方法,一：大肠杆菌表达外源基因的优势,全基因组测序,共有,4405,个开放型阅读框架,基因克隆表达系统成熟,繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定,被美国,FDA,批准为安全的基因工程受体生物,大肠杆菌表达外源基因的劣势,缺乏对真核生物蛋白质的复性功能,缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统,内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白,细胞周质内含有种类繁多的内毒素,(,endotoxin,),periplasm,heterogous,二 大肠杆菌表达载体的基本组成,一个良好的大肠杆菌表达载体：,有抗菌素抗性基因,决定载体拷贝数的复制起点,(,ori,),供外源基因插入的多克隆位点。,参与控制转录与翻译的必不可少的原件,外源基因在原核寄主细胞中表达,它的编码结构必须是连续的,不间断的,处于寄主启动子有效控制下。,1,启动子,可使外源基因高水平表达的最佳启动子必须具备以下几个条件,1),强启动子，外源基因的蛋白质的表达量占细胞总蛋白的,10%-30%,以上,2),应能呈现出一种低限的基础转录水平,3),应该是诱导型的,能通过简单的方式,使用廉价的诱导物得以诱导。,Account for,inducible,b,:,如果在启动子的上游部位放置一个有效的转录终止子,那么由该启动子驱动的克隆基因的转录便会被限制在最低本底水平。,2,终止子,a,:,如果在克隆基因编码区的,3,末端之后，接上一个有效的转录终止子，便能够阻止转录通读过位于下游另一个启动子,c:,转录终止子还能增强,mRNA,分子的稳定性,大大提高蛋白质产物水平在构建大肠杆菌表达载体时，通常是添加全部终止密码子,阻止核糖体跳跃,(skipping),现象。,大肠杆菌格外偏爱使用终止密码子,UAA,当其后连上一个,U,而形成四联核苷酸的情况下,转译终止效率便会得到进一步加强。,3,转译起始序列,mRNA,的,5,末端之独特的结构特征,是决定,mRNA,转译起始效率的主要因素。,在构建外源基因的高效表达载体时,需认真选择有效的转录起始序列。,未鉴定出,通用,有效的转译起始序列的,保守结构,initiation factor,conserved sequence,universial,4,、,reporter gene,其编码产物可被快速测定的功能单元追踪某些特定的,DNA,结构,(,重组质粒,),是否已经导入寄主细胞,同任何一种目的启动子连接,其表达活性可作为检测启动子功能的依据。,usage,半乳糖苷酶基因,lacZ,、,碱性磷酸酶基因、,荧光素酶基因,(luciferase),基因、,半乳糖激酶基因,(galK),氯霉素抗性,(,乙酰转移酶,),基因,(cat),四环素抗性基因,(tet,r,),alkaline phosphatase,三 常用的大肠杆菌表达载体启动子,广泛使用的大多数质粒表达载体启动子,噬菌体的,P,L,启动子,大肠杆菌乳糖操纵子,lac,启动子,色氨酸操纵子,trp,启动子,pBR322,质粒的,beta,内酰胺酶启动子,Lactose Operon,图,1-1,在大肠杆菌中基因表达的,3,个重要信号,启动子 核糖体结合位点,基因,终止子,DNA,RNA,转录,核糖体结合,mRNA,位点,图,1-2,基因转录起始位点上游序列的比较,TTGACA,TATA,AT,Pu,Py,-35,区,-30,-70,正调控区,-20,负调控区,+1,-10,区,GC,区,.CAAT,区,TATA,AA,T,PuAPy,-40,-110,+1,-20,-30,增强子,CCGCCC,或,GGGCGG,或,GGCCAATCT,T A,原核,真核,图,1-3,通过表达载体在大肠杆菌中被表达,P,R,T,T,P,R,T,PR,mRNA,蛋白质,表达载体,外源基因,将外源基因插入限制性酶切位点,转化大肠杆菌,图,1-4,杂交基因的构建和融合蛋白的合成,P R T,P R T,插入外源基因,ATA TTA,正确融合,N,端,C,端,不正确融合,外源基因不被翻译,表达,ATA TTA,GGA GCT,GGA GC,融合蛋白,亲和层析法纯化,化学试剂除去大肠杆菌肽段,图,1-5,在大肠杆菌中表达外源基因长遇到的问题,翻译,转录,P R T,T,转录,大肠杆菌不能切除内含子,转录提前终止,图,1-6,真核细胞表达载体常用的,4,种启动子,P,半乳糖,转录,GAL10,P,甲醇,转录,乙醇氧化酶基因,（,a,）,GAL,启动子,（,b,）,AOX,启动子,（,c,）葡萄糖水解酶启动子,（,d,）纤维二糖水解酶启动子,P,纤维素,转录,纤维素二糖水解酶基因,P,淀粉,转录,葡萄糖淀粉酶基因,木糖,不转录,四 真核基因在大肠杆菌中的表达,三种表达部位各有不同的优缺点,/,而且对克隆基因表达产物的制备有很大关系。,在细胞质中表达,在细胞周质中表达,以分泌到细胞外的形式表达。,1,外源基因在大肠杆菌中表达蛋白质位置,cytoplasm,periplasm,1),细胞质中表达,expressed in,cytoplasm,包含体是存在于细胞质中的一种由不可溶性蛋白质聚集折叠而成的晶体结构。,在表达中应尽可能限制包含体产生,并促进形成天然三维结构的蛋白质。,多采用与分子伴侣共表达的方法,可能是增加外源蛋白的可溶性和折叠能力的一种有效途径。,insoluble,chaperon,周质,:,指大肠杆菌一类,G,-,菌中，位于内膜和外膜之间的细胞结构部分。,在大肠杆菌中,已成功的使用了各种不同类型信号肽,将细胞质中蛋白的蛋白质转运至周质。,周质中表达外源蛋白质优点,:,A:,周质中蛋白质种类少,周质中表达的外源蛋白质能够被有效的浓缩和纯化。,b:,周质氧化环境有利于蛋白质按正确的方式折叠,c:,在周质中蛋白质降解不广泛。,来自原核、真核的外源基因都成功的在大肠杆菌细胞周质中实现了有效表达。,2),周质中表达,expressed in,periplasm,3),分泌表达,使在大肠杆菌中表达的外源蛋白质分泌到胞外培养基中进行分离纯化,这种研究思路称为外源蛋白质的分泌表达。,目的蛋白稳定性高,:,目的蛋白易于分离,目的蛋白末端完整,将外源基因与大肠杆菌信号肽编码序列重组在一起进行分泌表达,其,N,端的甲硫氨酸残基可在信号肽剪切过程中被有效除去,这些真核基因在大肠杆菌中表达时,蛋白质甲硫氨酸残基往往不能被切除。,分泌表达优点,:,重组人胰岛素原若分泌到细胞周质中,其稳定性大约是在细胞质中的,10,倍,许多真核生物成熟蛋白,N,端不含有甲硫氨酸残基。,intact,excise,外源真核生物基因很难在大肠杆菌中进行分泌型表达,;,外源基因分泌表达的表达率通常要比包涵体形式低很多,分泌表达缺点,相对其它生物细胞,大肠杆菌蛋白分泌机制不健全。,目前产业化的异源蛋白分泌型重组大肠杆菌工程菌很少,Perfect,sound,分泌型重组蛋白具有较高比例正确构象，,对蛋白酶不敏感,蛋白质的分泌机制,原核细胞周质中有多种分子伴侣,可阻止分泌蛋白随机折叠,分泌至细胞周质或培养基中,重组蛋白很少形成分子间二硫键,与包涵体相比,random,Sulfer,inner,outer,重组大肠杆菌,-,目的蛋白完全分泌,分泌型目的蛋白表达系统构建,有些,G,-,能将细菌的抗菌蛋白（细菌素）分泌到培养基中,这一过程严格依赖于,细菌素释放蛋白,它激活定位于内膜上的磷酸酯酶,导致细菌内外膜的通透性增大。,将细菌素释放蛋白编码基因克隆在一个合适的质粒上,携带大肠杆菌信号肽编码序列和目的基因的表达质粒,转化,受体细胞,完全分泌型受体细胞,转化,permeability,bacteriocin,二种类型,由报告基因编码序列和另一个基因启动子及其它的调节序列构成。用于研究启动子功能及调控作用分子机理。,由一种异源蛋白质基因编码序列同寄主细胞诱导型启动子构成。用于生产新型融和蛋白。,2,融和蛋白质表达,将外源基因与受体菌自身的蛋白质编码基因拼接在一起,并作为一个开放型阅读框架进行表达。这种杂合基因表达出的蛋白质称为融合蛋白。,2.1,融和基因,attention,外源基因应装在受体蛋白编码基因下游,为融合蛋白提供终止密码子。在某些情况下,并不需要完整的受体结构基因,2.2,融和蛋白的表达策略,融合蛋白表达质粒的构建原则,受体细胞的结构基因能高效表达,且其表达产物可以通过亲和层析进行特异性简单纯化,两个结构基因拼接位点处的序列设计十分重要,它直接决定融合蛋白的裂解。,两个蛋白编码序列应保持一致的翻译阅读框架,在,DNA,水平上，人工设计引入的蛋白酶切割位点或化学试剂特异性断裂位点,可以在体外从纯化的融合蛋白分子中释放回收异源蛋白,Base on,consistent,使克隆外源基因有效转译,有效转译：取决于核糖体的结合位点,受到编码区起点核苷酸序列影响。,可使蛋白质产物稳定,免受寄主胞内酶的降解作用,因此可以得到较高的产率。,可能构成一种信号肽指导大肠杆菌蛋白质分配到细胞的正确位置。,能够使用亲和层析技术分离纯化融合蛋白。,2.3,表达融合蛋白质的优点,ribosome,3,整合型异源蛋白的表达,工程菌在没有选择压力存在下,可以连续培养而不丢失目的基因表达盒,这对以改良物种遗传性状为目的的基因工程特别有意义,3.1,整合形式表达目的蛋白的特点,目的基因稳定表达,目的基因表达率低,整合型的目的基因随受体细胞染色体,DNA,一起复制,在大多数情况下相当稳定,单拷贝整合的目的基因表达率受到限制,此时可通过强化表达元件加以补偿,replicate/stability,Species/improvement,intensify,转位因子依赖型的体内重组,同源序列依赖型的体内重组,3.2 DNA,体内重组的基本原理,生物细胞内天然存在的一类无复制能力的,DNA,可移动因子,不同生物种群拥有结构不同的转位因子,噬菌体,G,片段,(G-Fragment),原核微生物 插入顺序,(IS),真核微生物 转座子,(Tn,、,Ty),高等植物 可移动因子,(Ac,、,Ds),高等动物 跳跃基因,(mobile gene),转位因子,transposon,转位因子依赖型的体内重组,转位因子的结构,transposon,palindrome,repressor,inversion region,整合形式,同源整合,同源序列依赖型的体内重组,同源整合,一般地说,距离越远、长度越长、同源性越高,重组的频率也就越高,反之亦然。,同源整合,1,基因结构存在很大差异。大多数真核基因含有内含子，细菌细胞中没有除去内含子机制；,五 大肠杆菌表达真核基因存在的问题,2,转录信号不同。真核基因转录的,mRNA,分子不具有结合细菌核糖体所必须的,SD,序列。细菌,RNA,聚合酶不能识别真核生物启动子,3 mRNA,的分子结构有所差异。绝大多数真核,mRNA,分子的,3,末端有,poly(A),尾巴，在,5,末端有一个帽结构。影响,mRNA,在细菌中的稳定性及与细菌核糖体相结合的能力，阻止正常的转录和转译。,4,真核生物的蛋白质,-,有些是通过前体分子加工来的。,在细菌中不存在这种修饰作用。,5,细菌的蛋白酶,-,可以识别和降解真核生物的蛋白质产物,结构不稳定性,重组,DNA,分子上某一区域发生缺失、重排、修饰，导致其表观生物学功能的丧失,六 基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制,1,工程菌遗传不稳定性表现形式,基因工程菌的遗传不稳定性主要表现在重组质粒的不稳性,具有下列两种表现形式,分配不稳定性,整个重组,DNA,分子从受体细胞中逃逸,segregative instability,domain,Deletion,region,rearrange,受体细胞中的限制修饰系统对外源重组,DNA,分子的降解,2,工程菌遗传不稳定性的产生机制,外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的生长代谢,能量、物质的匮乏和外源基因表达产物的毒性诱导受体细胞产生应激反应，关闭合成途径，启动降解,重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配,是重组质粒逃逸的基本原因,受体细胞中内源性的转座元件促进重组分子的缺失重排,Deletion,以构建稳定性高质粒,:,将,R1,质粒上的,parB,基因引入表达型载体中,:,其表达产物可以选择性地杀死由于分配不均匀所产生的无质粒细胞,3,改进载体、受体系统,正确设置载体上的多克隆位点,:,禁止,DNA,片段插在稳定区内,将受体细胞的致死性基因安装在载体上，并构建条件致,死性的相应受体系统。,eg,:,大肠杆菌的,ssb,基因,(DNA,单链结合蛋白编码基因,),根据载体上的抗药性标记,向培养系统中添加相应的抗生素,(,药物和食品生产时禁止使用抗生素,),4,施加选择压力,根据载体上的营养缺陷型标记,向培养系统中添加相应的营养组份,(,培养基复杂,成本较高,),correspond,使用可控型启动子控制目的基因定时表达及表达程度,5,控制目的基因过量表达,使用可控型复制子控制质粒的定时增殖或降低质粒的拷贝数,(,优化基因工程菌的培养工艺,),培养基组成,:,限制培养基比丰富培养基更有利于稳定,培养温度,:,较低培养温度有利于重组质粒的稳定,replicon,1982,年,美国,Ely LiLi,公司首先使用重组大肠杆菌生产人胰岛素,成为世界上第一个上市的基因工程药物。,1987,年,Novo,公司,成为世界上第一个上市的基因工程药物。,1987,年,Novo,公司又推出了利用重组酵母菌生产人胰岛素的新工艺。,七,.,人胰岛素的生产方法,基因工程法生产人胰岛素,体外胰岛素受体结合性能、淋巴细胞和成纤维细胞的应答能力、降血糖作用、血浆药代动力学等指标上均与天然胰岛素没有任何区别,具有无免疫原性、注射吸收迅速。充分展示了基因工程在生物医药领域中的巨大潜力。,potential,immunogenic,SH,SH,SH,SH,C C C C,COO_,SH,SH,N,C C,S.S.,Pre-pro-insulin,S,S,S,S,C C C C,COO_,S,S,C C,S-S,Pro-insulin,N,S,S,S,S,C C C C,COO_,C C,S,S,S-S,insulin,N,基因工程菌的构建战略：化学合成,A,链和,B,链的编码序列,表达重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建,A,链和,B,链分别表达法,1,synthesis,由于,A,链和,B,链上共存在六个半胱氨酸残基，体外二硫键的正确配对率较低,通常只有,10%-20%.,采用这条工艺路线生产正确配对率较低,采用这条工艺路线生产的重组人胰岛素每克成本高达,100,美元以上。,A,链和,B,链分别表达法,生产技术评价,为了进一步降低生产成本,美国,Ely LiLi,公司随后又建立了第二条生产重组人胰岛素的工艺路线,基因工程菌的构建战略,人胰岛素原表达法,proinsulin,表达产物后处理路线,B,链中第,22,位上的,Arg,和第,29,位上的,Lys,由于良好折叠的原因,对胰蛋白酶不敏感,在人胰岛素原表达工艺中,由于,C,肽的存在,胰岛素原能形成良好的空间构象,三对二硫键的正确配对率也相应提高,折叠率高达,80%,以上。,生产技术的评价,目前美国,Ely LiLi,公司采用此工艺年产十几吨的重组人胰岛素。,虽然这条工艺路线不比,AB,链分别表达法更为简捷,而且还要使用两种高纯度的酶制剂,但理想的折叠率在很大程度上弥补了工艺繁琐的缺陷,使得每克最终产品的成本仅,50,美元。,一,种能促进融合蛋白分泌的工程菌构建策略是将胰岛素或胰岛素原编码序列与,beta-,內酰胺酶基因拼接,beta-,內酰胺酶通常能被大肠杆菌分泌到胞外。,获得的工程菌同时具备了稳定高效表达可分泌型融合蛋白的优良特性,为胰岛素的后续分离纯化工序减轻了负担。,分泌型重组人胰岛素表达法,上述三种重组大肠杆菌的构建路线均采用胰岛素或胰岛素原编码序列与大肠杆菌,beta-,半乳糖苷酶基因拼接的方法,所产生的融合型重组蛋白表达率高、稳定性强,但不能分泌,只要以包涵体的形式存在于胞质中。,62,（,inclusion bodies IBs),基因工程包含体的纯化,基因工程菌培养液不同表达形式的前处理,胞外分泌型表达：离心,收集液相浓缩纯化。,胞内表达：,胞内可溶性表达：离心,收集菌体细胞破碎离心，收集上清纯化,胞内周质表达：离心,收集菌体低浓度溶菌酶或渗透压冲击等溶解目标物离心,收集上清液纯化。,不溶性包涵体：离心,收集菌体细胞破碎离心,收集沉淀包涵体洗涤目标蛋白变性溶解复性纯化。,63,外源蛋白在大肠杆菌中的积累,蛋白,产物占菌体总蛋白,外源蛋白的积累,人胰岛素,50%,形成包涵体,-,丙酰胺酶,20%,在细胞间区,人体干扰素,25%,形成包涵体,凝乳酶原,形成包涵体,牛生长激素,30%,形成包涵体,-,内酰胺酶,形成间区包涵体,人胰岛素原,5%26%,形成包涵体,64,包涵体：一种蛋白质不溶性聚集体，包括目标蛋白、菌体蛋白等。目标蛋白一级结构是正确的，但立体结构是错误的，所以没有生物活性。,包涵体的形成：大肠杆菌中目标产物的表达水平过高，超过正常代谢水平，过多表达产物聚集在细胞内，形成不溶性的包涵体。,高表达产生的积聚物在细胞内部形,成不溶物原因？,蛋白过量积聚，超过溶解度，导致沉淀；,蛋白生成太快，分子间疏水基团相互作用而聚集沉淀；,蛋白生成太快，分子内部二硫键的错误连接导致沉淀；,表达蛋白过多，与其结合,/,诱导组分不足，不能形成溶解状态,蛋白质自身不稳定。,包含体的构成,65,基因工程包涵体的纯化方法,收集菌体细胞,细胞破碎,包涵体的洗涤,目标蛋白的变性溶解,目标蛋白的复性,包含体的出现不仅增加了生物分离设计的难度，也为蛋白质折叠机理研究提出了新的课题。,欲获得天然活性态的目标产物，必需分离包含体后，溶解包含体并使其中的目标蛋白恢复应有的天然活性。,66,包涵体获得几种常见的工艺路线,(,一,),机械破碎,(,高压匀浆、高速珠磨）,离心提取包含体,加变性剂溶解,除变性剂复性,67,特点,:,是利用了包含体与细胞碎片的密度差，用离心法将包含体与细胞碎片和可溶性蛋白质分开，获得了干净的包含体，再对包含体溶解复性。,优点：,摆脱了大量的杂蛋白、核酸、热原、内毒素等杂质，使后面的分离纯化简单了。从这个角度上讲，包含体的形成对分离纯化亦有好处。,缺点,:,要经过几次离心才能除去大部分的细胞碎片，加工时间较长。,路线,1,的特点,68,包涵体获得,几种常见的工艺路线（二）,机械破碎,膜分离获得包涵体,加变性剂溶解包含体,除变性剂复性,69,路线（二）应用了膜分离技术，用微孔膜除去可溶性蛋白质。,优点是封闭式操作，不污染环境也不受环境污染，能量消耗也比离心法少。,缺点：细胞碎片和包含体一起被膜挡住，难以分开；而且膜的堵塞和浓差极化常常导致可溶性蛋白质的滞留。,路线,2,的特点,70,包涵体获得,几种常见的工艺路线（三）,化学破碎,（加变性剂）,离心除细胞碎片,除变性剂复性,71,用化学法破碎，所采用的试剂既可以破碎又可以溶解包含体，将两道工序和为一道，节省了设备和时间，比前两者更适合于实验室操作。,缺点是所有的可溶性杂质都没有除去，混杂在产物中间，给后续分离带来困难。,路线三：,72,1,）包涵体的洗涤,细胞破碎后，包含体呈颗粒状，致密。,洗涤的重要性：,收集的沉淀中，除包涵体外，还包括许多杂质，如膜蛋白、肽聚糖、脂多糖等，复性时会与目标蛋白一起复性形成杂交分子而聚集，给后步纯化带来困难。,洗涤剂：,温和的表面活性剂、蔗糖、低浓度的弱变性剂（如尿素）或脱氧胆酸等。能溶解除去部分膜蛋白和脂质类杂质。,洗涤剂浓度,以溶解杂质，不溶解包涵体中表达产物为原则。,73,2,）目标蛋白的变性溶解,包涵体中不溶性的目标蛋白必须溶解到液相中，才能进一步纯化。一般水溶液很难将其溶解，只有采用蛋白质变性才能使其形成可溶性的形式。,常用变性剂：,5-8 mol/L,盐酸胍和,6-8 mol/L,尿素,作用：破坏离子间相互作用；,表面活性剂如,1-2,SDS,，,作用：破坏蛋白质肽链间的疏水相互作用。,PH9.0,的碱溶液和有机溶剂，使用较少。,影响变性因素：时间、,pH,、离子强度、变性剂种类和浓度。,74,原理：,在变性剂溶液中，溶解的蛋白质呈变性状态，即蛋白质高级结构被破坏，但一级结构和共价键没有破坏。当部分变性剂被除去后，蛋白质会重新折叠成具有活性的正确构型，该过程称复性。,复性方法：,稀释法除变性剂 加入大量水或缓冲液。,膜分离法除变性剂 透析、超滤、电渗析。,层析法：凝胶层析，,高效疏水层析,3,）目标蛋白的复性,75,蛋白质复性影响因素：,变性剂浓度,目标蛋白浓度；,pH,和离子强度；,氧化还原条件。,还原剂：,二硫苏糖醇、,-,巯基乙醇、还原型谷胱甘肽；,氧化剂：,氧化型谷胱甘肽,;,碱性下通空气。,复性区,多聚物生成区,絮凝沉淀区,盐酸胍浓度,mol/L,红血球碳酐酶复性操作中变性剂,与蛋白质浓度对复性的影响,蛋白质浓度,mol/L,76,肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体蛋白在,E.coli,中的高密度发酵过程中以两种形式表达：,细胞内有活性的可溶性蛋白形式（约占目标蛋白的,30%,）,无活性的包涵体形式（约占目标蛋白的,70%,）。,悬浮破壁,PBS,洗涤,离心,硫铵沉淀,亲和层析,阳离子交换层析,溶解,复性,亲和层析,湿菌体,发酵液,干净菌体,上清液,包涵体,纯品,活性检测,破壁液,离心,离心液,洗涤,举例：,TRAIL,的分离纯化,77,1.,包涵体的洗涤,粗制包涵体用,50mM,磷酸盐缓冲液，含,150mM NaCl pH=7.4(1:3 w/v),洗涤,2-3,次；,用含有,1M NaCl,的磷酸缓冲液洗涤,1,次,(1:3 w/v),将粘附其表面的大部分蛋白及水溶性杂质除去；,用,6M,尿素及,0.5%TritonX-100,联合洗涤,1,次,(1:3 w/v),，去除另一些杂蛋白，这时得较纯包涵体（纯度达,80%,左右）；,用,SDS-PAGE,电泳检测纯度。,2.,包涵体的变性溶解,洗涤后包涵体用含有,30mM DTT,及,5mol/l,盐酸胍的,Tris,缓冲液,pH=8.0 (1:5 w/v),变性溶解 室温搅拌,2h,，,95%,以上的包涵体可被溶解；,离心，,13000rpm,，,20min,弃沉淀得到溶解液。,78,3.,包涵体复性（间歇式流加稀释复性法）,以含,DTT,和,ZnSO4,的,Tris-HCl为复性缓冲液，再添加,0.4M L-,Arg,，,0.5M,尿素，,0.5M,NaCl,作为蛋白聚集抑制剂，,变性溶解液可多次流加，每次流加的时间是以上一次流加蛋白已达到部分复性为准。本实验中，流加间隔时间确定为,90min,，每次流加浓度为,150mg/L,，变性液流加次数可高达,6,次，最终浓度可达到,1mg/ml,，,4,缓慢搅拌一段时间，,对,50mM,Tris-HCl,，,300mM,NaCl,，,0.1M,尿素及,0.2mM ZnSO4,混合液透析过夜，透析后离心除去复性过程中聚集的蛋白，,超滤浓缩（也可用硫酸铵沉淀进行浓缩）得复性蛋白液。,79,5.,复性后纯化,复性浓缩后蛋白 金属亲和层析 吸附,洗涤：,40mmol/L,咪唑，洗除非特异性吸附的杂蛋白,洗脱：,100mmol/L,咪唑,目标蛋白,纯度达,95%,以上（由,SDS-PAGE,和,RP-HPLC,鉴定）,收率,75%,80,包含体产物分离工艺（牛生长激素分离提取）,81,来自发酵罐的菌体经过离心除去培养液后加入缓冲液悬浮，通入高压匀浆器反复破碎三次。匀浆经过离心和水洗除去细胞碎片，再添加溶菌酶、,EDTA,和促进剂以除去脂蛋白和未破碎的细胞。包含体经离心沉淀和水洗后进行变性溶解，溶解剂为,6mol/L,盐酸胍。溶解的同时通入空气氧化以打断错误连接的双硫键。离心除去沉淀，含变性蛋白质的上清液经超滤浓缩后过凝胶柱除去杂蛋白，再加入复性缓冲液进行透析复性。复性过程中产生的絮凝沉淀用离心除去。,包含体产物分离工艺（牛生长激素分离提取）,质谱在蛋白质、多肽分析中的应用,质谱在蛋白质、多肽分析中的应用,分子量的测定,蛋白质、多肽纯度的鉴定,肽质量指纹谱,肽序列测定技术,蛋白质的翻译后修饰鉴定,其他,蛋白质鉴定,分子量的测定,用,ESI-MS,和,MALDI-TOF-MS,测定蛋白质和多肽的分子量，精确度可达,0.1,0.01,，这远比其它方法,(,如,SDS-PAGE,、凝胶过滤、超离心等）精确。,正确测定蛋白质的分子量，可以提供很多信息，如确定分子大小，从氨基酸组成分析的结果求得准确的氨基酸组成，验证已测定的一级结构是否正确等。,分子量测定实例,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，高效凝胶过滤色谱以及电喷雾离子化质谱三种方法对新发现的一种蛋白质（来源于福建尖吻蝮蛇蛇毒,是一种具有类凝血酶活性的弱酸性蛋白质）的分子量进行了测定。,测定方法,分子量,非还原,SDS-PAGE,26.2kDa (,二硫键未打开,),还原,SDS-PAGE,29kDa (,二硫键被还原,),HPGFC,24.5kDa,ESI-MS,30298Da,分子量测定实例,天花粉蛋白的一级结构测定，在86年时曾出现差错，当时测定的结果表明它是由234个氨基酸残基组成，分子量为25682Da。90年，我们发现结构测定有误，重新修正了其一级结构。它应由247个氨基酸残基组成，正确分子量为27141.32Da。,93年，用MALDL-TOF-MS和ESI-MS测定了天花粉的分子量。,天花粉蛋白,（,TCS,）的,MALDI-TOF-MS,的分子量图谱,天花粉蛋白（,TCS,）的,ESI-MS,的分子量图谱,分子量测定实例,-,苦瓜子蛋白的一级结构计算,(,包括糖部分,),的分子量为,29156Da,，用,MALDI-TOF-MS,测定的分子量为,29074Da,，二者相差,82Da,。这种差异可能是个别氨基酸测定的差错造成，估计整个结构测定不会有大错误,。,分子量测定实例,-,苦瓜子蛋白其,C,端用羧肽酶的方法测定为,-S-T-A-D-E-N,，但尚不能完全确定。,苦瓜子蛋白在,190,位有一个色氨酸，我们用,BNPS-Skatole,降解色氨酸，降解后的肽用,HPLC,分离，得到含有,C,端的一段小肽,(59,个氨基酸残基,),用,MALDI-TOF-MS,测定其分子量为,6443,与计算得到的,59,肽的分子量为,6442.9,非常相符，因此也就证明了,C,端,59,个氨基酸残基的顺序是正确的。,-,苦瓜子蛋白,Trp,降解,C,端肽分子量,蛋白质、多肽纯度的鉴定,根据质谱测定分子量的作用，质谱还可用来作蛋白质、多肽纯度的鉴定。,只要质量有差异的杂质都可以被检出，此方法灵敏度高，用量少,(pmol,水平,),、速度快，并有独到之处。,蛋白质、多肽纯度的鉴定,实例,1,：天花粉蛋白,C-,端微观不均一，即有二个,C,末端，一个多一个,Ala(,即,247,个氨基酸残基,),，一个少一个,Ala(,即,246,个氨基酸残基,),，用,ESI-MS,完全能够分辨出来,实例,2,：,如猪胰岛素和人胰岛素混在一起，用,MALDI-TOF-MS,也能够清楚地分出二个峰。两者的差异仅在猪胰岛素,B,链的第,30,位为,Ala(89.09Da),，而人胰岛素相应的位置为,Thr(119.12Da),，两者相差,30Da,（如图,13-11,）。这些差异用其他方法是很难检出的。,蛋白质鉴定,肽质量指纹谱,+,基于串联质谱多肽测序,蛋白质鉴定,肽质量指纹谱,由于各种蛋白质的氨基酸序列,(,一级结构,),不同，蛋白质被酶解后产生的肽段序列也各异，,肽混合物质量数亦具特征性,，称为肽质量指纹谱,(peptide mass fingerprint,PMF),，可用于蛋白质的鉴定。,PMF,流程,肽质量指纹谱,MALDI-TOF-MS,是最有效的分析肽混合物的质谱仪，肽混合物,不需分离,可直接分析，基质辅助激光电离方法能,耐受一定浓度的盐,，仪器,灵敏度高,，标准样品,1 pmol,的量就足够，质量数,准确度,可达,0.1,0.01,，且,操作简单，分析速度快,，依仪器型号不同,一次可分析,十几个到几十个样品。,PM