第六章人工酶.ppt

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第六章 人工酶,第一节 人工酶的理论基础和策略,通过对生物体系的,结构,与,功能,的研究,为设计和建造新的技术提供,新思想,、,新原理,、,新方法,和,新途径,。,利用,化学模拟,作为,阐明,自然界中生物体行为的,基础,。人们认识到研究和模拟生物体系是开辟,新技术,的途径之一。,一,、人工酶概念：,人工酶是在,分子水平,上模拟,酶活性部位,的,形状,、,大小,及其,微环境,等结构特征，以及酶的,作用机理,和,立体化学,等特性的一门科学。,二、,人工酶的理论基础,1、,人工酶的酶学基础,酶是如何发生效力的？,Pauling,的稳定过渡态理论：酶先对底物结合，进而选择性稳定某一特定反应的过渡态（,TS）,降低反应的活化能，从而加快反应速度。,广义的酸碱催化、邻近与定向、变形与张力等等，都是酶催化高效性的重要原因。,设计人工酶应考虑：,（1）酶的作用机制，,（2）模拟体系中的识别、结合和催化。,这两方面必须统一结合。,2、,“,主-客体”化学,Pederson,和,Cram,研究,冠醚,时发现：冠醚（主体）与,伯胺盐,（客体）形成复合物。把主体与客体通过,配位键,或其他,次级键,形成,稳定复合物,的化学领域称为“,主-客体”化学,。,按照属性,人工酶可分为：,主客体酶模型,包括环糊精、冠醚、穴醚、杂环大环化合物和卟啉类等;,胶束酶模型；,肽酶；,抗体酶;,分子印迹酶模型,半合成酶等。,不限于,化学手段,，,基因工程,、,蛋白质工程,也发挥了重要作用。,一、,主-客体酶模型,环糊精酶模型,环糊精(,cyclodextrin,简称,CD),1、,由,D-,葡萄糖,以,1，4-糖苷键,结合的,环状低聚糖,。,2、有6个（,-CD,）、7,个（,-CD,）,及8个（,-CD,）,环糊精3种，,3、呈锥形的圆筒，,伯羟基位于较小口、仲羟基位于较大开口端。,特点：,1、,CD,分子外侧是亲水的，其羟基可与多种客体,形成氢键,。,2、其内侧是,C,3,，C,5,上的氢原子和糖苷氧原子组成的空腔，,具有疏水性,。因而能包结多种客体分子，类似酶对底物的识别。,1、水解酶的模拟,组氨酸咪唑基,在酶催化中起着重要作用。,Rama,等人将咪唑在,N,上直接与,CD,的,C,3,相连，所得的（图6-2,）,催化,pNPAc,的水解比天然酶快,一个数量级。,“强中自有强中手”,2、转氨酶的模拟,Tabushi,等将催化基团氨基引入,CD。,乙二胺的引入,（1）使反应加速2,000,倍以上，,（2）创造了一个极强的手性环境，,（3）表现出很好的立体选择性。,3.,桥联环糊精仿酶模型,它的两个,CD,及桥基上的功能基构成了具有协同包结和多重识别功能的催化活性中心，能更好地模拟酶对底物的识别与催化功能。,Matsui,等将乙二胺偶联到,CD,上，然后与铜盐作用形成桥联环糊精（,A,部分）,它催化糠偶姻（,B,部分）氧化成糠偶酰的反应，比没有催化剂时大20倍。,二、,肽酶,肽酶（,pepzyme）,就是模拟天然酶活性部位而人工合成的具有催化活性的多肽。,Atassi,和,Manshouri,利用化学和晶体图像数据有关信息，采用“表面刺激”合成法合成了两个29肽。,模拟,胰凝乳蛋白酶活性部位,模拟胰蛋白酶的活性部位，,水解蛋白的活力分别与其模拟的酶相同,三,、,半合成酶,以天然蛋白质或酶为母体，用化学或生物学方法引进适当的活性部位或催化基团，或改变其结构从而形成一种新的“人工酶”。,1、选择性修饰氨基酸侧链（化学诱变法）,Bender,等首次成功地将枯草杆菌蛋白酶活性部位的,丝氨酸（,Ser）,残基,，经,PMSF,活化后再用巯基化合物取代，将丝氨酸转化为,半胱氨酸,。特点：,对肽或酯没有水解活力，,但能水解高度活化的底物（如硝基苯酯）,2、,将辅酶引入到结构已知的蛋白质上。,例如：黄素木瓜蛋白酶,黄素的,溴酰衍生物,可与,木瓜蛋白酶,的,Cys,25,共价结合,成,黄素木瓜蛋白酶,。,特点：酶活力可与老黄素酶相当。,其他的辅酶（如维生素,B1、,吡哆醛、卟啉等）都可以共价偶联到某些酶的结合部位，从而产生新的实用催化剂。,3、,在抗体结合部位附近的适当位置引入催化活性基团。,基本方法：,用化学法将一个催化活性基团引入抗原类似物中，利用抗体与抗原类似物的亲和结合作用，使催化活性基团与抗体结合部位附近的氨基酸残基共价结合，将催化活性基团与抗原类似物分离，,在结合部位附近就引入了活性基团,Schultz,等应用此方法已成功地将-,SH,引入到抗体,MOPC315,的结合部位附近。,提高硫解速率达,60000倍,。,第三节 印迹酶,分子印记技术概述,人们对小分子仿酶体系、抗体酶、半合成酶、分子印迹酶模型和胶束酶模型等人工酶进行了系统的研究，已经取得了很大进展。,分子识别在生物体如酶、受体和抗体的生物活性方面发挥着重要作用，这种高选择性来源于与底物相匹配的结合部位的存在。,为获得这样的结合部位，科学家们应用环状小分子或冠状化合物如冠醚、环番、环糊精、杯芳烃等来模拟生物体系。,这样的类似于抗体和酶的结合部位能否在聚合物中产生呢？,分子印记,:以一种分子充当模板，其周围用聚合物交联，当模板分子除去后，此聚合物就留下了与此分子相匹配的空穴。如果构建合适，这种聚合物就像“锁”一样对钥匙具有选择性识别作用，这种技术被称为分子印迹。,1972年首次报道成功地制备出分子印记聚合物。,分离提纯、免疫分析、生物传感器，特别是人工模拟酶方面显示出广泛的应用前景。,一、,生物印记,定义：生物印记（,bioimprinting）,是,分子印记,的一种形式，它是指以,天然的生物材料,，如蛋白质和糖类物质为骨架，在,其上,进行,分子印记,而产生的对,印记分子,具有,特异性识别空腔,的过程。,特点：,（1）产生很好的,识别作用,。,（2）生物分子构象的柔性在无水的有机相中被取消，其,构象被固定,。,1.,以蛋白质为基础的生物印记,印记过程,（1）酒石酸作用于牛血清白蛋白，,（2）冷冻干燥，,（3）用有机溶剂抽提酒石酸，,（4）得到酒石酸印记的牛血清白蛋 白。,印记的白蛋白在无水乙酸乙酯溶剂中结合酒石酸的量,是未印记蛋白结合酒石酸的,30,倍,印记机理：,（1）,配体（印迹分子）在蛋白质水溶液中与多肽链的,多个部位发生氢键相互作用,，使多肽链围绕配体拆叠，形成新的构象，,（2）,此构象在除掉配体后仍能在无水有机相得以保持,，因而印迹的分子带有恰似配体形状的孔穴，可以,在有机相中通过氢键结合配体,。,（3）印记的生物分子只能,在无水有机相中起作用,。若将其移入,水相,则没有任何印记效果,。,例：,生物印记法修饰,-,胰凝乳蛋白酶。,模板分子是：,酶的抑制剂,N-,乙酰,D-,色氨酸,，,印记对象是：,-,胰凝乳蛋白酶,。,修饰酶在环己烷中反应，可催化合成,N,乙酰,D,色氨酸乙酯,修饰酶在水中只能,催化,L-,型氨基酸酯,。,利用生物印记方法可将,蛋白质,转化为,半合成酶,，印记后使蛋白质表现出与,天然酶相似的性质,或被赋子了其他特性。,主要过程为,首先使蛋白质部分,变性,，扰乱起始蛋白质的构象;,加入,印记分子,，使印记分子与部分变性的蛋白质充分结合；,待印记分子与蛋白质相互作用后，用交联剂,交联,印记的蛋白质；,经透析等方法,除去,印记分子。,产生了类似于酶的新的活性中心，从而赋予了新的酶活力。,起始蛋白质既可以是无酶活力的,蛋白质,（如牛血清蛋白等），又可以是具有催化活力的,酶,（如核糖核酸酶、胰蛋白酶、葡萄糖异构酶等），,印记分子通常是某种,酶的抑制剂,、,底物修饰物,或,过渡态类似物,等。,注意：,印记的生物分子只能在有机相中起作用，若将其移入水相，则没有印记效果。,2.,以糖类为基础的生物印记,二、生物印记酶,生物印记是分子印迹中非常重要的内容之一。,先后获得了有机相、水相催化印记酶。,1.有机相生物印记酶,例1：脂肪酶有机相催化的生物印记。,水溶性脂肪酶在通常状况下是非活性的，其结合部位有一个“盖子”。,当底物脂肪以脂质体形式接近酶时，盖子打开，脂肪的一端与结合部位结合。,Braco,等将适当两亲性的,表面活性剂,与,酶印迹,，,待表面活性剂分子与酶充分接触后，将,酶复合物冷冻干燥,，,用非水溶剂,洗去表面活性剂,后，脂肪酶的活性中心的,“盖子”被去除,，,形成了活性中心,开启的活性酶,。,选择,不同活性剂,诱导产生的非水相脂肪酶，其结合部位构象发生了,新的变化,。,2.,水相生物印迹,（1）酯水解生物印迹酶,1984年，,Keyes,等首例用这种方法制备的印迹酶。,印迹分子：吲哚丙酸，,印迹牛胰核糖核酸酶，,待起始蛋白质在部分变性条件下与吲哚丙酸作用，,用戊二醛交联固定印迹蛋白质的构象,透析去除印迹分子,制得了具有酶水解能力的生物印迹酶。,特点：,印迹酶粗酶具有7.3,U/g，,而非印迹酶则无酯水解酶活力。,粗酶经硫铵分级纯化后，比活力增至22,Ug。,再经柱层析纯化后，出现 3种交联组分，其中低分子量组分显示出最高酶活力达到600,U/g。,印迹酶的最适,pH、,底物饱和特性、产物抑制等均与天然酶类似，但具有较宽的底物特异性。,（,2,）,HF,水解生物印迹酶,氟水解酶催化含氟化合物的水解反应。而使含氟有机磷和磺酸类化合物解毒。,常见的底物：二异丙基氟磷酸（,DFP）、,对苯甲基磺酰氟（,PMSF）,等。,Keyes,研究小组的工作,印迹分子：不同的底物类似物,印迹核糖核酸酶,结果：,催化,DFP,的活力比相应的,抗体酶高,，甚至,超过,了某些天然酶的活力。,（3）,具有谷胱甘肽过氧化物酶（,GPX）,活性的生物印迹酶,GPX,的酶活性中心具有,GSH,特异性结合部位。罗贵民等应用单克隆抗体制备技术，以,GSH,修饰物为半抗原已制备出具有,GSH,特异性结合部位的含硒抗体酶其催化活力已达天然酶水平。,如何制备有,GPX,活性的含硒生物印迹酶？,印迹分子的要求：,印迹分子应体现,GSH,的结构特征，使其诱导出对,GSH,具有较好结合的酶结合部位；,稳定性好；,不与交联剂发生化学反应；,考虑到修饰基团能诱导出疏水结合部位。,印迹分子：,GSH,修饰物,（,GSH,的巯基和氨基用疏水基团2，4-二硝基苯修饰）,印迹,卵清蛋白,产生,GSH,的特异性结合部位。,在结合部位引入催化基团是提高酶活力,苯甲基磺酰氟（,PMSF）,活化丝氨酸羟基，,NaHSe,亲核取代，转化为硒代半胱氨酸（催化基团）。,形成了具有,GPX,活力的印迹酶,。,第四节 人工酶研究进展,人工模拟酶研究是,生物有机化学,的重要研究领域之一。,人工酶的分子设计在很大程度上反映了对,酶的结构,以及,反应机制,的认识。,研究人工酶模型可以较直观地,观察,与酶的催化作用相关的,各种因素,，如催化基团的,组成,、活性中心的,空间结构特征,、酶催化反应的,动力学性质,等。,人工模拟酶的研究，是实现人工合成具有高性能,模拟酶的基础,，在理论和实际应用上都具有重要意义。,世界发达国家重点资助这些高技术、新概念、新构思,探索性课题,。,利用环糊精、大环化合物、抗体、印迹蛋白质等为基质已制备出大量的人工酶，部分人工酶的催化效率及选择性已能与,天然酶相媲美,。,但大多数人工酶的催化活性并不高，尚缺乏系统的、定量的理论为指导。,大多数人工酶模型过于简单，缺乏对催化因素的全面考虑。,催化抗体是不对称合成的,理想催化剂,，其催化反应的范围也在不断扩大，,但催化抗体现在还未达到实用阶段。比酶催化低23个数量级。,因此，如何提高抗体酶的催化效率，抗体酶将来能否与酶竞争是个公开挑战。,以底物为半抗原所产生的抗体应当具有底物结合部位，然后在此抗体的结合部位上引入催化基团。如果引入的催化基团与底物结合部位取向正确、空间排布恰到好处，则应产生高活力抗体酶。,（1）虽然有了不少抗体酶，但对诱导方法而言，需要寻找一个最为可能诱导出抗体酶的过渡态复合物，且这是一个最为困难的问题。根本原因是酶催化反应有很多不清楚。,所以寻找抗体酶的过渡态复合物是研究的一个重要方面。,（2）通过抗体酶来研究酶的作用机理，以及为过渡态复合物设计提供理论依据，从而指导抗体酶的设计,。,（3）通过对抗体酶本身的进一步研究，搞清蛋白质结构和功能的关系问题。,（4）通过抗体酶的制备来制造一些新的原先没有的新酶。,象识别56核苷酸顺序一样的内切酶，可以识别,几个氨基酸,的多肽水解酶。如果设计出要水解什么氨基酸就有什么抗体酶相对应。,一旦有这种可能，也就有可能解决蛋白质的结构与功能研究问题上面临的困难，可以多了一条全新的研究途径。,（5）设计有治疗价值的新药物。如利用抗体酶基因来治疗遗传性疾病。,运用分子印迹技术对酶的人工模拟已成功地制备出具有酶水解、转氨、脱羧、酯合成、氧化还原等活性的分子印迹酶。虽然用分子印迹法制备的聚合物印迹酶其催化效率同天然酶相比普遍不高，但它们却具有明显的优点；制备过程简单、易操作；印迹分子的选择范围广。生物印迹技术其高效催化活性显示它是一种很有前途的人工模拟酶制备技术。用此技术制备些物印迹酶时，印迹分子的选择范围广，利用蛋白质等为骨架印迹酶的活性中心使生物印迹酶更接近于天然酶。研究印迹分子的结构与印迹的活性中心结构关系、印迹分子的结构与酶活力的关系，寻找印迹酶高活力的理论基础则相当重要。,人工模拟酶的研究属于化学、生物学等领域的交叉点，属交叉学科。综合运用化学、分予生物学和遗传学知识会大大加强人工催化剂设计方法的威力和可用性，从而产生医药工业上有用的高效催化剂。,革命尚未成功，同志仍需努力！,