糖的组织化学.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,组织化学,histochemistry,特殊染色,通过应用某些能与组织细胞化学成分特异性结合的显色试剂,定位地显示病变组织细胞的特殊化学成分,同时又能保存原有的形态改变,达到形态与代谢的结合,.,可用于检测细胞内的酶类、糖类、脂类、核酸、某些金属元素等。,糖 的 组 织 化 学,糖的分类,单糖和双糖,多糖：淀粉、纤维素、糖原,粘液物质（粘多糖）,中性粘多糖,酸性粘多糖,糖蛋白 粘蛋白 氨基己糖,4%,糖蛋白 氨基己糖,4%,5.,糖脂 含有半乳糖,脂肪酸,神经氨基醇,糖 原,一.糖原的概念,由多糖衍化而来，是天然存在于动物组织内的多糖,分布：胞浆内 肝、心肌、骨骼肌,同种葡萄糖的聚合物,作为糖原染色的切片，必须冰冻或经特殊固定液固定后进行切片,二.固定剂的选用,Carnoy,（,冷4）,无水乙醇 60,ml,防止糖原溶于水,氯 仿 30,ml,增加渗透力,冰 醋 酸 10,ml,抵消乙醇对组织的,收缩、硬脆作用,*优点：固定迅速，保存肝糖原,三.固定中注意事项,1.尽可能取小块新鲜组织及时固定，不用水溶性固定液,2.应用含酒精的溶液作为固定液，但最好不单独使用乙醇固定，以乙醇为溶剂的混合固定液固定为佳,3.固定原理：使糖原与固定液之间相结合的蛋白质凝固，糖原被周围凝固的蛋白质膜保护起来，,四.显示糖原的方法,1.碘染色,2.胭脂红染色,*3.过碘酸-,Schiff,反应,4.银浸染法,过碘酸-,Schiff,反应,Periodicacid-Schiff,PAS,(一）染色原理,过碘酸是一种强氧化剂，能氧化糖分子，使相邻二个碳原子上的羟基（-OH）变为醛基（-COOH）,Schiff,氏试剂是付品红（碱性品红）经,SO,2,作用后，形成的无色溶液,付品红,Schiff,试剂,当Schiff氏试剂与醛基作用后，形成含有发色基团的化合物，呈现紫红色沉淀,*,PAS,反应的基本原理,1.通过过碘酸的氧化作用，将糖分子中的碳键打断，游离出醛基,2.醛基与,Schiff,试剂反应显出红色沉淀,(二)染色步骤,1.切片脱蜡至水,2.1%过碘酸溶液内氧化5-10,min,3.,流水洗5,min,再用蒸馏水洗,4.用,Schiff,试剂处理10-20,min,5.流水洗10,min,6.复染(可用,Mayer,明矾苏木素或甲基绿衬染细胞核),7.脱水、透明、封片,切片经二甲苯和各级酒精复水后，入,0.5%,的过碘酸溶液中作用,15,分钟，取出后水洗,。,切片充分洗净后入,Schiff,s,试剂中进行显色。作用,15,分钟左右，将切片取出水洗，为洗去非特异性着色，将切处理品入三级新配制的亚硫酸中进行冲洗，取出后水洗，镜检。,肝糖原-,PAS,染色,X200,肝糖原-,PAS+,苏木素复染,X200,【结果】,胞浆内,PAS,阳性物质呈紫红色，颗粒状或均质团块状，胞核呈蓝色或绿色,红色深浅反应含糖原量的多少,【对照】,采用淀粉酶或唾液酶消化切片,对照片,PAS（-），,未处理片（+）,PAS,反应阳性物质,物质类别,举例,染色强度,多糖,糖原,强,中性粘液物质,结肠杯状细胞,强,某些酸性粘液物质,酸性非硫酸性含唾液粘多糖,中,基底膜,肾小球基底膜,中,色素,脂褐素,中,脂质,脑苷脂,中,淀粉样物,淀粉样物,弱,软骨,软骨,弱,真菌,曲菌,强,脑垂体,粘液样细胞,强,This normal glomerulus is stained with PAS to highlight basement membranes.The capillary loops of the glomerulus are well-defined and thin.,A888 kidney 11-PAS,A888 kidney 14-PAS,（三）,PAS,反应的应用,证明与鉴别细胞内空泡样变性,（水变性、脂肪变性、糖原）,心肌病变及其它心血管疾病的诊断和研究,糖原累积病的诊断及研究,糖尿病的诊断及研究,某些肿瘤的诊断与鉴别,肝细胞水变性,肝脂肪变性,(,石蜡切片,),肝脂肪变性,(,冰冻切片,),脂肪特染：苏丹,III,糖原累积症,PAS（+）PAS（-）,肝细胞癌 胆管癌,横纹肌瘤 颗粒细胞肌母细胞瘤,Ewing,肉瘤 骨的网织细胞肉瘤,（四）注意事项,1.过碘酸溶液与,Schiff,试剂均可反复使用多次，用后密封放入冰箱4保存,2.新鲜配成的溶液与应用过的作用时间不同，刚配成的作用时间短，以后逐渐延长,3.过碘酸溶液在作用前应与室温接近，温度太低，造成氧化不全，影响效果,4.,Schiff,试剂如呈淡红色，则应弃去重配,5.,Schiff,试剂配法很多，区别不大，可以随意选用,6.,Schiff,试剂作用时，染色缸必须加盖，不然,Schiff,试剂将因,SO,2,消失而失效,Schiff,试剂,碱性复红 1,g,1N,盐酸 20,ml,偏重亚硫酸钠 1,g,重蒸馏水 200,ml,粘 液 物 质,(,粘 多 糖,),人体的各种腺体及其他许多组织、细胞，如结缔组织、纤维母细胞、软骨基质等都能合成和分泌粘液物质，统称为,粘多糖,或,粘液,分类,中性粘多糖,酸性粘多糖,1.硫酸化粘液物质 结缔组织 （强）,上皮 （弱）,2.非硫酸化粘液物质,含己糖醛酸的结缔组织粘液物质,含唾液酸的上皮粘液物质,粘液物质染色在诊断中的应用,用于一般粘液性病变的观察,肿瘤的诊断与研究：用显示粘液的染色方法进行观察和鉴别,胃粘膜上皮分泌中性粘液，而胃肠上皮化生或肠型胃癌细胞分泌酸性粘液,-,AB-PAS,染色区分中性与酸性粘多糖,酸性粘多糖含有硫酸基团和羧基。用阳离子染料与酸性基团结合形成盐键而显色。利用染液不同的,PH,值及不同的电解质浓度，可以区别酸性粘多糖的二种基团,-,HID-AB,法,不同,PH,的,竞争性抑制,PH2.5,时，二种酸性粘多糖均被奥蓝着色,PH1.0,时，仅硫酸粘多糖着色,2.电解质浓度与粘液物质着色的关系,MgCl,2,浓度 显示物,0.06,M,羧酸和硫酸化粘液,0.3M,弱和强硫酸化粘液,0.5,M,强硫酸化粘液,0.7,M,强硫酸化结缔组织粘液,0.9,M,硫酸角质,显示糖分子和酸性基团的 组化方法,1.奥蓝-过碘酸,Schiff,氏法,（,AB-PAS）,【目的】,鉴别胃粘液（中性粘多糖）和肠粘液（酸性粘多糖）；对鉴定肠上皮化生有一定意义,【,染色原理,】,奥蓝是一种水溶性氰化亚钛铜盐，带有阳电荷，与组织中的酸根结合形成盐键。,AB-PAS法：首先酸性粘多糖为奥蓝染色，不再与PAS发生反应；仅中性粘多糖为PAS阳性,【,染色步骤,】,1.石蜡切片脱蜡至水，蒸馏水洗,2.1%奥蓝的醋酸（3%）液染30分钟（,PH,约2.5）,3.蒸馏水洗,4.1%过碘酸液氧化5-10,min,5.,蒸馏水洗,6.,Schiff,试剂作用10-30,min,7.,流水洗10,min,8.,脱水，透明，封片,Alcin blue,染色液：,奥蓝1,g，,蒸馏水97,ml，,冰醋酸3,ml,临用前过滤使用，调节,PH2.5-3,之间,【结果】,中性粘多糖（胃粘液呈红色，酸性粘多糖（肠粘液）呈蓝色，酸性和中性混合粘液呈紫红色,AB-PAS X100,AB-PAS X200,2.高铁双胺-奥蓝法（,HID-AB）,法,【目的】,主要用于鉴别硫酸化粘多糖和唾液酸粘多糖，对确定肠化生类型有一定价值,正常胃粘膜上皮，十二指肠腺中性粘液,小肠氮乙酰化唾液酸粘液,大肠氧乙酰化唾液酸粘液和硫酸粘液,肠型胃癌,唾液酸粘液 硫酸粘液,弥漫型胃癌,中性粘液,高分化腺癌,硫酸粘液,中低分化腺癌,唾液酸粘液,大肠型化生,硫酸粘液,小肠型化生,不含硫酸粘液,高铁双胺染液,N，N-,二甲基-间-苯二胺二盐酸盐 120,mg,N，N-,二甲基-对,-,苯二胺二盐酸盐 20,mg,溶于预热至25的蒸馏水50,ml,中，再加入60%,FeCl,3,.6H,2,0 1.5ml (PH1.4-1.5),【染色原理】,二胺盐离解后带阳电荷，与硫酸化粘液物质结合成复合物而显色。,该反应缓慢，需加入,FeCl,3,作为催化剂,FeCl,3,的作用,-使二胺盐氧化形成棕黑色阳离子色原，加快染色,-使染色液的,PH,降至1.4,以后奥蓝（,PH2.5）,把羧基化的唾液酸粘液染成蓝色,【,染色步骤,】,1.切片脱蜡至水,2.蒸馏水洗,3.入双胺溶液 28 18-24小时,4.自来水稍洗，蒸馏水洗,5.入3%冰醋酸水溶液（,PH2.5）3min,6.,奥蓝染液30,min,7.,流水洗5,min,8.,蒸馏水洗,9.脱水，透明，封片,【结果】,硫酸粘液呈棕黑色，含羧基的唾液酸粘液呈蓝色，中性粘液不着色,胃 -,Spicer,高铁双胺法,X200,