专题1基因工程.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因工程,主要内容,1）基因工程的概念,2）基因工程的工具,3）基因工程的基本步骤,什么叫基因工程？,基因工程又叫,基因拼接技术,或,DNA重组技术,。该技术是在,生物体外,，通过对DNA分子进行人工“,剪切,”和“,拼接,”，对生物的基因进行,改造,和,重新组合,，然后,导入,受体细胞,内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内,表达,，产生出人类所需要的,基因产物,。,（一）基因工程的概念,（一）基因工程的概念,基因工程的别名,操作环境,操作对象,操作水平,基本过程,结 果,实 质,基因拼接技术或DNA重组技术,生物体外,基因,DNA分子水平,人类需要的基因产物,剪切,拼接,导入,表达,基因重组,材料：,含抗虫基因的苏云金杆菌,无抗虫基因棉花,实验设计：如何应用基因工程培育抗虫棉？,抗虫棉,普通棉,基因工程培育抗虫棉的简要过程：,（一）基因工程的概念,普通棉花,(,无抗虫特性,),苏云金芽孢杆菌,提取,抗虫基因,与运载体DNA拼接,导入,棉花细胞,(,含,抗虫基因,),棉花植株,(,有,抗虫特性,),上述培育抗虫棉的关键步骤是什么？,表达,（一）基因工程的概念,基因工程培育抗虫棉的关键步骤：,关键步骤一：,抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内,提取出来,关键步骤二：,抗虫基因,与运载体DNA连接,关键步骤三：,抗虫基因,导入受体(棉花)细胞,被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个,伸出的核苷酸,，他们之间正好,互补配对,，这样的切口叫,黏性末端,。,限制酶,黏性末端,黏性末端,A A T,G A A T T C,G A T G A T T C C G T A A T,G A A T T C,G A,T T A,C T T A A G,C T A C T A A G G C A T T A,C T T A A G,G C,黏性末端,平末端,识别序列,切割DNA分子时产生的两种不同末端,2、,DNA 连接酶“分子缝合针”,作用：,DNA连接酶,可把黏性末端,之间的缝隙,“,缝合,”起来，即把梯子两边扶手的断口连接起来，这样一个重组的DNA分子就形成了。,E.coliDNA连接酶：,T,4,DNA连接酶：,黏性末端,黏性末端和平末端,DNA连接酶,“缝合”切开的磷酸二酯键,3、,基因进入受体细胞的载体“分子运输车”,问题：1、常见载体有哪些？,2、载体如何与目的基因重组在一起？,3、载体应满足哪些条件？,1、,质粒,、噬菌体的衍生物、动植物病毒,A A T,G A A T T C,G A T G A T T C C G T A A T,G A A T T C,G A,T T A,C T T A A G,C T A C T A A G G C A T T A,C T T A A G,G C,目的基因,目的基因插入位点,3、载体需满足哪些条件呢？,提示：,假如目的基因导入受体细胞后不能复制将怎样？,作为载体没有酶切位点将怎样？,目的基因是否进入受体细胞，你如何察觉？,如果载体对受体细胞有害将怎样？,能在宿主细胞内复制，,否则将在细胞增殖中丢失。,有多个酶切位点，,利于外源基因插入。,具有某些标记基因，,以便筛选导入成功细胞。,对受体细胞要无害，,从而保证导入成功。,载体必须具备4个条件：,重组DNA分子的模拟操作,目的要求,模拟重组DNA分子的操作过程，说出其基本原理。,材料用具,两种颜色(如绿色和粉红色)的硬纸板，在绿硬纸,板上依次等距离写上字母。,剪刀(代表EcoRI)，,透明胶条(代表DNA连接酶)。,小试身手:,思考：请按真实操作过程思考一下：,1你模拟插入的DNA片段能称得上一个基因吗?,2如果你操作失误，碱基不能配对，可能是什么原因造成的?,课后思考题：,（二）基因工程的工具,1、说出限制酶、DNA酶、DNA解旋酶间的不同点。,2、说出DNA连接酶、DNA聚合酶间的不同点。,胰岛素从猪、牛等动物的胰腺中提取，,100Kg,胰腺只能提取,4-5g,的胰岛素，其产量之低和价格之高可想而知。,将合成的胰岛素基因导入大肠杆菌，每,2000L,培养液就能产生,100g,胰岛素！使其价格降低了30%-50%!,材料：,人胰岛素基因,大肠杆菌,实验设计：,如何运用基因工程生产人胰岛素？,基因工程生产胰岛素的简要过程：,大肠杆菌,(,不能合成胰岛素,),人体细胞,提取,胰岛素基因,与运载体DNA拼接,导入,大肠杆菌,(,含,胰岛素基因,),大肠杆菌,(,能合成胰岛素,),表达,（三）基因工程的基本步骤,据图说出运用基因工程生产胰岛素的基本步骤,基因工程生产胰岛素的简要过程：,大肠杆菌,(,不能合成胰岛素,),人体细胞,提取,胰岛素基因,与运载体DNA拼接,导入,大肠杆菌,(,含,胰岛素基因,),大肠杆菌,(,能合成胰岛素,),表达,目的基因的获取,基因表达载体的构建,将目的基因导入受体细胞,目的基因的检测与鉴定,（三）基因工程的基本步骤,方法：,1、从,基因文库,中获取目的基因,2、利用,PCR技术,扩增目的基因,2、通过DNA合成仪用化学方法直接,人工合成,一、目的基因的获取：,基因文库,基因组文库,部分基因文库（如cDNA文库）,1、从,基因文库,中获取目的基因,基因组文库,cDNA文库,基因组文库与部分基因文库的关系,2、利用,PCR技术,扩增目的基因,PCR技术,PCR概念？,PCR的原理？,PCR反应地点？所需原料？反应过程？,PCR技术原理及反应过程,原理：,DNA复制,反应过程：,1、加热,至9095,，目的基因DNA解链。,（变性）,2、冷却,至5560，引物结合到互补DNA链。,（退火）,3、加热至7075，DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。,（延伸）,4、,重复循环,原料：,模板DNA、耐高温的DNA聚合酶、四种脱氧核苷酸、引物、ATP等,地点：,PCR扩增仪,3、通过DNA合成仪用化学方法直接,人工,合成,（基因较小、核苷酸序列已知）,目的基因的提取方法,2.反转录法,3.根据已知的氨基酸序列,合成DNA,1.鸟枪法,1）鸟枪法（散弹射击法）：,用,限制酶,将,供体细胞,中的,DNA切成许多片段,，将这些片段分别,载入运载体,，然后通过运载体分别转入不同的受体细胞，让供体细胞提供的外源DNA的所有片段分别在各个,受体细胞,中,大量复制,（即,扩增,），从中,找出含有目的基因,的细胞，再利用一定的方法将包含目的基因的DNA片段,分离,出来。,2）逆转录法：,以,目的基因,转录成的,信使RNA,为模板，,逆转录,成互补的,单链DNA,，然后在酶的作用下,合成双链DNA,，从而获得所需的基因。,目的基因的mRNA,DNA,(即目的基因),逆转录,3）根据已知的氨基酸序列合成DNA法：,根据,已知,蛋白质的,氨基酸序列,，,推测,出相应的,信使RNA,序列，然后按照,碱基互补配对,原则，,推测,出它的,结构基因的核苷酸序列,，再通过化学方法，以,单核苷酸为原料合成目的基因,。,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,推测,推测,目的基因,化学合成,（基因较小、核苷酸序列已知）二、基因表达载体的构建,思考：,作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成,任务吗？为什么？,三、将目的基因导入受体细胞,转化：,目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。,将目的基因导入植物细胞,导入动物细胞,导入微生物细胞,常用方法,农杆菌转化法,显微注射技术,Ca,2+,处理,能否根据农杆菌将目的基因导入双子叶植物的原理，设计一个抗病基因导入小麦方案。（理论上说，你认为该如何做？）,将目的基因导入植物细胞农杆菌转化法,将目的基因导入动物细胞显微注射技术,将目的基因导入微生物细胞,大肠杆菌,Ca,2+,处理,大肠杆菌,感受态细胞,基因表达载体+缓冲溶液+感受态细胞,Ca,2+,处理法,四、目的基因的检测与鉴定,1、检测与鉴定的目的,目的基因进入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性,检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因,（DNA水平）,检测目的基因是否转录了mRNA,（RNA水平）,检测目的基因是否翻译成蛋白质,（蛋白质水平）,个体生物学水平,鉴定,2、检测与鉴定的方法,知识延伸,DNA分子杂交技术,该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双链DNA解开，把单股的DNA小片段用同位素、荧光分子或化学发光催化剂等进行标记，之后同被检测的DNA中的同源互补序列杂交，从而检出所要查明的DNA或基因。,思考,：,检测mRNA 是否合成，可以用分子杂交的方法吗？,检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗原抗体杂交,个体生物学水平的鉴定,可以,总 结,（一）基因工程的概念,（二）基因工程的工具,（三）基因工程的步骤,转基因鲑鱼,抗虫害的玉米,抗虫害的玉米,转黄瓜抗青枯病基因的甜椒,转鱼抗寒基因的番茄,寻根问底：,如果不构建基因表达载体，直接将目的基因导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，结果会怎样？,提示：,有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物中的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，没有进行表达载体的构建，这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定什么基因导入了受体植物。此法目前争议颇多，严格来讲不算基因工程,。,