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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,天然产物分离技术,天然药物,植物：,87%,，如人参、甘草等,动物：,12.3%,，牛黄、鹿茸等,矿物：,0.6%,，石膏、朱砂等,天然药物,是指动物、植物和矿物等自然界中存在的有药理活性的天然产物。天然药物不等同于中药或中草药。,天然产物分离技术,基于开发和应用的技术水平分析，天然药物有以下几种情况：,1,2,3,原料药，亦即传统意义上的中药（我国天然药物的主要市场）,制剂或提取物，通过一些简单的加工制成，中成药大多来源于此,纯天然有效成分，美国,FDA,即如此要求，近年来在逐步放松管制,天然产物分离技术,天然药物化学,：运用现代科学理论和方法研究天然药物中化学成分的一门学科,天然产物的结构特点、理化性质、提取分离方法及结构鉴定等,有效成分的结构修饰及构效关系,中草药在加工炮制和存储过程中的成分变化,化学成分在植物体内随环境、季节、时间及发育阶段的动态变化,天然药物化学,天然产物分离技术,一次代谢,和,二次代谢,：,糖,、,蛋白质,、,脂质,、,核酸,等对植物机体生命活动必不可少的物质，称为,一次代谢产物,；,上述物质产生过程对维持植物生命活动来说是必不可少的过程，且几乎存在于所有的绿色植物中，称为,一次代谢,；,特定条件下，一次代谢产物作为原料或前体，又进一步经历不同的代谢过程，这一过程并非所有植物中都发生，对维持植物生命活动不起重要作用，称为二次代谢，生成的萜类、生物碱等化合物称为,二次代谢产物,；,天然产物分离技术,l-,麻黄碱,(l-ephedrine),平喘、解痉作用,麻黄碱盐酸盐,发汗散寒，宣肺平喘，利水消肿,麻黄,Herbal Ephedrae,天然产物分离技术,降低血管脆性，防高血压和动脉硬化的治疗辅助药物,芦丁,(rutin),凉血止血，清肝泻火,槐花,Sophora japonica,天然产物分离技术,来源：古柯叶,具有局部麻醉作用,可卡因,(cocaine),来源：人工合成,局部麻醉药,普鲁卡因,(procaine),天然产物分离技术,喜树碱,(camptothecin),抗肿瘤,(,拓扑异构酶,I,抑制剂,),喜树,Camptotheca acuminata,10-,羟基喜树碱,天然产物分离技术,紫杉醇,(taxol),抗癌药物,(,促进微管蛋白聚合，抑制解聚，抑制细胞有丝分裂,),太平洋红豆杉树,Pacific Yew,1,2,3,天然药物化学简介,提取、分离技术,结构研究方法简介,天然产物分离技术,天然产物分离技术,中草药有效成分提取与分离,(,第二版,),，徐任生主编，上海科学技术出版社，,1981,。,植物药有效成分的提取与分离，李伯廷主编，山西高校联合出版社，,1993,。,天然有机化合物提取分离与结构鉴定，汪茂田主编，化学工业出版社，,2004,。,参考书目：,天然产物分离技术,重要性：,天然药物的研究与,开发，中药的药效物质基础研究,提取,基础,分离,天然产物分离技术,研究准备：,植物品种鉴定,(,科、属、种,),、产地；文献工作；,目标成分的结构类型,(,萜类、黄酮、生物碱,),，,确定提取、分离方法与路线；,系统预试验，活性跟踪；,天然产物分离技术,预试验的目的和要求：,中草药的化学成分比较复杂，种类很多，因此,在着手研究一个中草药的有效成分时，首先要,大致知道该中草药含有哪些类型的化学成分，,这就需要有一些比较简单的各类化学成分的,定性预试验方法,。,根据预试验的结果判断可能含有,哪些类型,的化,学成分，然后按照所含化学成分的性质，设计,有效成分分离的具体方法。,天然产物分离技术,系统预试：,生物碱：碘化铋钾、硅钨酸等,氨基酸、肽和蛋白质：茚三酮,酚类化合物和鞣质：,1%,三氯化铁、香草醛,/,盐酸,糖、多糖和苷：费林试液、,a,-,萘酚,皂苷：醋酐浓硫酸反应、溶血、泡沫,甾体：间二硝基苯,黄酮：,1%,三氯化铝,(,荧光,),蒽醌：,1%,硼酸溶液,天然产物分离技术,原料的提取：,溶剂提取法,相似相溶定律,天然产物分离技术,有机化合物分为三类：,水溶性,亲脂性,亲水性,未成盐的生物碱，未成苷的黄酮、蒽醌、萜类、甾体。,苷类,(,黄酮、三萜、甾体等与糖的结合物,),糖类、氨基酸、蛋白质、盐类,天然产物分离技术,有机溶剂分为三类,水,亲水性有机溶剂,亲脂性有机溶剂,与溶剂的结构有关，常见溶剂极性强弱顺序,:,石油醚,/,环己烷、苯、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇、水,天然产物分离技术,化合物的酸碱性,酸性化合物,碱性化合物,两性化合物,天然产物分离技术,溶剂的选择：,溶解度,化学性质稳定,安全、价廉,天然产物分离技术,提取溶剂：,水（鞣质、糖类、蛋白质）,HCl/NaOH,成盐溶出,冷水、热水,醇（乙醇、甲醇）,95%-,大多数小极性及中等极性化合物,60-70%-,皂苷、黄酮苷,40-50%-,强心苷,丙酮、乙酸乙酯、苯等（苷元）,天然产物分离技术,浸渍法,（冷浸）,煎煮法,（水,/,烯醇）,回流法,（有机溶剂,）,渗漉法,（连续冷浸）,提取方法：,水蒸气,蒸馏法,（挥发油）,升华法,(,樟木,-,樟脑,),天然产物分离技术,提取方法：,冷浸法（,3-4,次）,渗漉法（,10,倍量）,受热易分解物 溶剂梯度,煎煮法（,3-4,次）,水或稀醇,天然产物分离技术,化学成分的分离方法：,分类,粗分（部位分离）,细分（部位分组分离）,单分（单体成分分离）,天然产物分离技术,分离纯化常用方法原理,4.,物质分子大小差异进行分离,3.,物质的吸附性差别进行分离,2.,物质在两相溶剂中的分配比,不同进行分离,1.,物质溶解度差别进行分离,天然产物分离技术,1.,利用溶解,度差别进,行分离,1,2,3,4,5,利用温度不同引起溶解度的改变,改变混合溶剂的极性,调节溶液的,pH,值,沉淀法,盐析法,天然产物分离技术,结晶的方法,一、影响结晶的条件：,1,有效成分在混和物中的含量,一般说含量愈高愈容易结晶。有的化合物要比较纯时,才能得到结晶，有的虽含量不高，如条件选择得当，,也可使之结晶。,2,合适的溶剂条件,这一条比较重要，有时有效成分在有关部位中含量即,使很高，因溶剂选择不当，还是不能得到结晶。反之，,有时含量不高，因选择了合适的溶剂，常常能够结晶。,天然产物分离技术,3,有效成分的浓度饱和溶液）,浓度高些容易结晶：但浓度过高时，相应杂质的,浓度或溶液的粘度也增大，有时反而阻止结晶的,析出。实际工作中有时将较稀的溶液放置，等溶,剂自然挥发到适当的浓度和粘度，即能析出结晶。,4,合适的温度和时间,一般温度低些较好，有时在室温中久不析出结晶，,可以放置在冰箱或阴凉处。,天然产物分离技术,二、结晶溶剂的选择：,将欲结晶的物质在各种常用有机溶剂中试验溶解,度，包括冷时和热时的溶解度。放置过程中，先,塞紧瓶塞看其是否能结晶；如不结晶，可打开塞,子，使其逐步在室温中自然挥发，这样低沸点的,溶剂较易挥发而比例逐渐减少，慢慢析出结晶。,天然产物分离技术,三、单体的纯度检测：,溶点与熔距,薄层法：,三个系统，,R,f,值分别在,0.20.3,，,0.40.5,，,0.60.7,液相法：保留时间（,R,t,）,天然产物分离技术,2.,物质在两相溶剂中的分配比不同,2,3,4,5,6,逆流连续萃取法,逆流分配法（,CCD,）,液滴逆流色谱法（,DCCC,）,高速逆流色谱法（,HSCCC,）,气液分配色谱（,GC,或,GLC,）,1,液,-,液萃取法,7,液,-,液分配色谱（,LC,或,LLC,）,天然产物分离技术,HSCCC,高速逆流色谱法,天然产物分离技术,物理吸附,(,硅胶,),化学吸附,半化学吸附,(,聚酰胺,),在天然有机化合,物分离及纯化工,作中，吸附现象,利用得十分广泛。其中又以,固,-,液,吸附,用得最多。,3.,物质的吸附性差别进行分离,天然产物分离技术,固,-,液物理吸附色谱：,运用较多的一种方法，特别适用于很多中等分子量的样品,（分子量小于,1,000,的低挥发性样品）的分离，尤其是脂,溶性成分。一般不适用于高分子量样品如蛋白质、多糖或,离子型亲水性化合物等的分离。,吸附层析的分离效果，决定于,:,吸附剂,(,硅胶、氧化铝、活性炭,）、溶剂和,被分离化合物的性质这三个因素。,天然产物分离技术,硅胶是酸性吸附剂，适用于小极性及中等极性成分,(,中性、酸性,),的分离。,层析用硅胶为一多孔性物质，分子中具有硅氧烷的交链结构，同时在颗粒表面又有很多,硅醇基正相硅胶,天然产物分离技术,反相硅胶：,反相硅胶是在正相硅胶（普通硅胶，官能团为,OH,）的基础上进行化学反应把,OH,取代为,OR,（,R,是碳氢链或称作碳链，,CH,）。碳链可以和化合物相互作用，因为不同的化合物和碳链相互作用作用程度不同，相互作用越大需要分离的时间越长；如此，混合的化合物即可逐渐分离出来。,目前常用的为,C18,（由,18,个碳组成的碳链），除此以外还有,C12,，,C8,，,C6,适用于分离亲水性化合物（苷类化合物）,天然产物分离技术,吸附剂：氧化铝,氧化铝带有,碱性,，对于分离一些碱性中草,药成分，如生物碱类的分离颇为理想。不宜用,于醛、酮、酸、内酯等类型的化合物分离。,不可逆吸附较为严重,。,天然产物分离技术,对极性物质具有较强的亲和能力。故同为溶质，极性强者将被优先吸附。,溶剂极性越弱，则吸附剂对溶质将表现出越强的吸附能力。溶剂极性增强，则吸附剂对溶质的吸附能力即随之减弱。,溶质即使被硅胶、氧化铝吸附，但一旦加入极性较强的溶剂时，又可被后者置换洗脱下来,。吸附是可逆的。,吸附剂的特点,天然产物分离技术,洗脱溶剂的选择,须根据被,分离物质,与所选用的,吸附剂性质,这,两者结合起来加以考虑。,待分离物质极性,弱极性,强极性,吸附剂性质,弱极性,强极性,洗脱剂的选择,天然产物分离技术,官能团的,种类、数目、排列方式,官能团的,极性强弱,化合物的极性及其强弱判断,天然产物分离技术,官能团,极性,R-COOH,大,Ar-OH,R-OH,R-NH,2,R-NH-R,R-N-R,2,R-CO-NR,2,R-CHO,R-CO-R,R-CO-OR,R-O-R,小,天然产物分离技术,大体上溶剂极性的大小可以,根据介电常数的大小来判,断。介电常数越大，极性,越强。,溶剂的极性,溶剂,介电常数,极性,环己烷,2.0,弱,苯,2.29,乙醚（无水）,4.47,氯仿,5.20,乙酸乙酯,6.11,丙酮,20.7,乙醇,26.0,甲醇,31.2,水,81.0,强,天然产物分离技术,分离方法,-,平面色谱,薄层色谱（,TLC,）,定性：预试试验,样品对照,-,标准品种类：硅胶,G,，,GF,254,，反相硅胶,显色：通用,-,碘蒸气、,10%H,2,SO,4,/EtOH,专属,-alkaloids,flavonoids,等,石油醚,/,环己烷,-,乙酸乙酯,极,性,递,增,石油醚,/,环己烷,-,丙酮,氯仿,-,丙酮,氯仿,-,甲醇,氯仿,-,甲醇,-,水,乙酸乙酯,-,甲醇,-,水,实验室中最常应用的,混合溶剂,天然产物分离技术,天然产物分离技术,天然产物分离技术,天然产物分离技术,R,1,R,2,R,f,=,R,2,R,1,R,f,：比移值,溶剂前沿,点样处,样品点,天然产物分离技术,制备薄层色谱（,PTLC,）,制备量,:g,级,吸附剂（,absorbents,）,材料：,Silica gel,尺寸：,2020 cm,；,2040 cm,厚度：,0.5-2 mm,样品带,手工,自动点样器,天然产物分离技术,流动相的选择,样品的收集、洗脱,显色：定位,转移,洗脱,样品带宽的解决方法,a.,用极性流动相展开约,2cm,，,使带变窄,b.,用带浓缩带的板子,天然产物分离技术,制备样品时引入的杂质,粘合剂,杂质 指示剂,Others (,分解物，,Al,2,O,3,作吸附剂,),难点：无法鉴别；,溶剂极性增大，杂质量多,解决办法：,Sephedex LH-20,纯化,天然产物分离技术,实 例,丁香酚,吸附剂：硅胶,G,展开剂：石油醚,-,乙酸乙酯,(9:1),，苯,-,乙酸乙酯,(19:1),，,苯,-,醋酸乙酯,-,甲醇,(8:1:1),，苯,-,丙酮,(9:1),显色方法：,5,香草醛硫酸，,5,三氯化铁乙醇,丁香,天然产物分离技术,人参二醇,吸附剂：硅胶,G,展开剂：氯仿,-,乙醚,(1:1),，苯,-,丙酮,(5:2),，苯,-,乙酸,乙酯,(1:1),，环己烷,-,丙酮,(2:1),显色方法：硫酸乙醇溶液显色,人参,天然产物分离技术,人参皂苷,Rb1,吸附剂：硅胶,G,展开剂：氯仿,-,甲醇,-,水,(65:35:10)(10,以下放置的下,层溶液,),，正丁醇,-,乙酸乙酯,-,水,(4:1:5),的上层,溶液，氯仿,乙酸乙酯,-,甲醇,-,水,(15:40:22:10),(10,以下放置的下层溶液,),，氯仿,-,甲醇,-,丙酮,(75:20:2),显色方法：硫酸乙醇溶液显色,天然产物分离技术,儿茶素,吸附剂：硅胶,G,展开剂：氯仿,-,丙酮,-,甲醇,-,醋酸,(7:2:1.5:0.5),显色方法：,2%,三氯化铁、,5%,香草醛溶液显色,茶叶,天然产物分离技术,士的宁,吸附剂：硅胶,G,，硅胶,GF,254,，氢氧化钠溶液制备的硅胶,G,展开剂：甲苯,-,丙酮,-,乙醇,-,浓氨水,(4:5:0.6:0.4),，氯仿,-,乙醇,-,环己烷,-,浓氨水,(9:3:3:0.4),，苯,/,甲苯,-,丙酮,-,浓氨水,-,乙醇,(8:6:2:0.5),，氯仿,-,乙醇,-,环己,烷,(3:1:1),显色方法：茚三酮试剂，碘化铋钾试剂（生物碱）,马钱子,天然产物分离技术,大黄素,吸附剂：硅胶,G,，硅胶,GF,254,展开剂：石油醚,/,正己烷,-,甲酸乙酯,-,甲酸,(15:5:1),的上层,溶液，苯,/,甲苯,-,乙酸乙酯,-,甲醇,(15:2:0.2),，环,己烷,-,乙酸乙酯,-,氯仿,-,甲醇,(15:9:6:4),，苯,-,乙,醇,/,甲醇,(8:1),显色方法：氨熏显色，紫外灯,掌叶大黄,天然产物分离技术,龙胆苦苷,吸附剂：硅胶,GF,254,展开剂：氯仿,-,甲醇,-,水,(30:10:3),的下层溶液，正丁醇,乙酸乙酯,-,水,(4:1:5),显色方法：磷钼酸显色，紫外灯,龙胆,天然产物分离技术,技术发展,a.HPTLC,b.,巨形板,PTLC,不锈钢板（,60,60 cm,，厚度,5mm,）,上样量,10 g,c.,带浓缩带的,PTLC,薄层板的下部有一条,4mm,的浓缩带，孔径有,400A,，,对样品有浓缩作用且不会产生分离效果，因此当样,品到达浓缩带的边缘时，已经被浓缩成一条细线。,d.,展开方式,多次展开（同向）,双向展开,天然产物分离技术,加压薄层色谱（,Overpressure Layer,Chromatography,）,简介,1979,年,Tyihak,综合,TLC,，,HPTLC,的优点，,吸收,HPLC,的某些特点。,平面 细颗粒 蒸汽相 恒流速,装置,天然产物分离技术,特点,a.,与传统的,PTLC,比较,b.,效率,50 mg 0.5 g 1h,c.,优点,制备型,OPLC,联机检测，分段收集,应用,氨基酸，多肽，胡萝卜素，生物碱等,天然产物分离技术,离心薄层色谱（,Centrifugal TLC,）,简介,CTLC,是在,TLC,和柱色谱基础上发展起来，利用,旋转离心力，连续洗脱。,装置,倾斜盘，流动相中央进入,梯度、,UV,检测、,N,2,保护,固定相 活化 反复使用,天然产物分离技术,天然产物分离技术,天然产物分离技术,天然产物分离技术,天然产物分离技术,天然产物分离技术,特点,优点：（,1,）快速,30 min,（,2,）流动相少,（,3,）可反复使用 （,4,）进样方便,（,5,）直接洗脱 （,6,）直接检测，接收灵活,（,7,）可梯度洗脱 （,8,）占地小，移动方便,（,9,）分离杂质少,缺点：（,1,）固定相限制 （,2,）,Rf,值,（,3,）显色 （,4,）收集污染,（,5,）上样量少,应用,生物碱，人参皂苷,纸色谱（,PC,）,天然产物分离技术,简介,纸色谱属于液,-,液分配色谱。纸色谱使用滤纸作为载,体，附着在纸上的水是固定相。样品溶液点在纸上,作为展开剂的有机溶剂自下而上移动，样品混合物,各组分在水,-,有机溶剂两相发生溶解分配，并随有机,溶剂的移动而展开，达到分离的目的。,使用范围,纸色谱在,糖类化合物,、,氨基酸,和,蛋白质,、,天然色素,等有一定亲水性的化合物的分离中广泛的应用。,天然产物分离技术,特点,纸色谱的操作与薄层色谱很相似，只是纸色谱的载,样量比薄层色谱更小些。,设备,滤纸,层析筒,天然产物分离技术,分离方法,-,柱色谱,常压柱色谱,吸附性柱色谱,分配性柱色谱 植物有效,柱色谱 离子交换柱色谱 成分分离,凝胶过滤柱色谱 主要手段,聚酰胺柱色谱,大孔吸附树脂,天然产物分离技术,吸附性柱色谱,填料,Silica gel,（,100200,目,/200300,目），,Al,2,O,3,生物碱 亲水性,Al,2,O,3,甾体 脂溶性,Silica gel,挥发油 脂溶性,天然产物分离技术,柱子规格的选择,径高比：,1:10 1:20,体积：硅胶的溶胀系数,色谱条件的选择,a.,最佳分离度,b.,最多的斑点数目,c.,能够找到适合的梯度,d.,起始,R,f,在,0.150.2,之间,天然产物分离技术,装柱,Al,2,O,3,：吸附剂,:,样品,(2050:1),Silica,：吸附剂,:,样品,(,550:1,),1),干法 与,TLC,吻合度较好，溶剂消耗少,2),湿法 紧密，空隙小，前沿整齐,上样,1),湿法 少量溶剂溶解上样,(,低极性溶剂，,CHCl,3),2),干法 低极性溶剂溶解性差，,干法拌样：,将水浴锅置于通风厨中，温度控制在,70,度左右,将蒸发皿中放入少量吸附剂,(,510,倍,),，慢慢滴,加样品溶液，不断搅拌，待溶剂挥发后，再加,入样品溶液，直到样品全部被吸附剂吸附，挥干,天然产物分离技术,洗脱,等度洗脱,梯度洗脱,收集与检查,等量收集,TLC,检查,合并,系统分离和目的性分离,根据目的不同而不同,天然产物分离技术,聚酰胺柱色谱,简介,聚酰胺（,poliamide,）吸附属于氢键吸附，,是一种用途十分广泛的分离方法，极性物,质与非极性物质均可适用，但特别适合分,离,酚类,、,醌类,、,黄酮,类化合物。,天然产物分离技术,聚酰胺与酚类、醌类形成氢键缔合的能力在,水中最强,，,在含水醇中随着醇浓度的增高而减弱，在高浓度醇或,其它有机溶剂中则几乎不缔合。,聚酰胺氢键吸附能力,大,小,天然产物分离技术,水,甲醇,丙酮,氢氧化钠水溶液,甲酰胺,二甲基甲酰 胺,尿素水溶液,各种溶剂在聚酰胺柱上的洗脱能力由弱至强顺序：,天然产物分离技术,聚酰胺粉的制备,国产（,1530,目）层析用（,80100,目）,粗粉乙醇浸泡过夜，倾出上清液，,6080,度烘干,23,小时备用。必要时可以将商品,聚酰胺研细。,操作,1,）装柱 细粉水浸泡装柱，自然沉降,2,）上样,2030%,水溶液上样,4060:1,3,）洗脱,水 含水醇,95%,醇,3%NaOH 5%NaOH,聚酰胺再生,5%NaOH,天然产物分离技术,分配柱色谱,原理,利用混合物在两相互不混溶中分配系数不同，,而达到分离的一种柱层析方法。分配系数差,异愈大，分离效果愈好。,支持剂,硅胶、硅藻土、纤维粉,溶剂系统的选择,TLC,，,PC,选择,操作,装柱、上样、洗脱,天然产物分离技术,强心苷的分离,羊角拗,Strophanthus divaricatus,主治祛风湿，通经络，解疮毒，杀虫,天然产物分离技术,羊角拗苷,天然产物分离技术,凝胶柱色谱（,Sephadex LH-20,）,葡聚糖凝胶,(Sephadex LH-20),简介,由葡聚糖凝胶,Sephadex G-25交联亲脂性羟丙基,而制备，是同时具备,吸附层析,、,分配色谱,和,分子,筛功能,的独特层析介质，溶剂系统没有限制，包,括水相缓冲液、丙酮、乙酸乙脂、氯仿、二氯甲,烷、四氢呋喃、甲苯和各种混合溶剂，大量文献,证明它非常适合于天然产物纯化，特别是中草药,有效成分如甙类、生物碱、黄酮、蒽醌、内酯、,帖类、甾类、多酚的分离。,Sephadex LH-20,在,植物化学研究中的应用广泛。,天然产物分离技术,原理,分子筛,：分子的大小和形状,吸附层析：被分离化合物与凝胶间的氢键,分配层析：被分离化合物在流动相（溶剂）和,固定相（凝胶）之间的分配,操作,1,）装柱,洗脱剂溶胀后悬浮液搅拌装柱,2,）上样,3,）洗脱,水溶性好 水或电解质溶液,水溶性差 醇水或丙酮水,极性较小 丙酮、氯仿,天然产物分离技术,再生,洗脱剂平衡,有污染：,0.2N NaOH-0.5N HCl,浸泡,水洗净,-,平衡,保存：,50%,丙酮水溶液,应用,纯化，除去杂质,分离,天然产物分离技术,离子交换柱色谱,原理,利用大分子树脂网状结构内存在的交换基团而,进行的交换性柱层析方法。,影响离子交换的因素,PH,值,欲交换化合物的性质,欲交换化合物的浓度,温度,交换溶剂,交换流速,树脂用量,天然产物分离技术,树脂的选择,阳离子交换树脂,阴离子交换树脂,操作,a.,树脂预处理,b.,装柱,c.,上样,d.,交换,e.,洗脱,f.树脂再生,天然产物分离技术,生物碱的分离,洋金花,/,白曼陀罗,Datura metel,平喘止咳；麻醉止痛；解痉止搐,天然产物分离技术,大孔吸附树脂柱色谱,大孔吸附树脂简介,大孔树脂吸附技术是上世纪七十年代发展起来的一,种新工艺，是由,苯乙烯,、,二乙烯,或,a,-,甲基丙烯酸酯,等聚合而成的高分子网状孔穴结构。药液通过大孔,树脂吸附，其中的有效成分吸附在树脂上，再经洗,脱回收，可除掉药液中杂质，是一种纯化精制药的,有效方法。非极性吸附树脂在吸附药液中成分时，,主要是依靠物理结构（如比表面、孔径等）起作用，,不同的树脂有不同的针对性。其操作的基本程序大,多是：,提取液,-,通过大孔树脂,-吸附上有效成分的,树脂,-,洗脱,-,洗脱液回收,-,洗脱液干燥,-,半成品,。,该技术目前已较广应用于新药的开发和生产中,主要,用在分离和提纯过程中。,天然产物分离技术,大孔吸附树脂的优点,经大孔树脂吸附技术处理后，可有效地去除水煎,液中大量的糖类、无机盐、黏液质等吸潮成分，,有利于多种中药剂型的生产，增强产品的稳定性。,大孔树脂吸附技术还能缩短生产周期，所需设备,简单。免去了静置沉淀、浓缩等耗时多的工序。,大孔吸附树脂的吸附原理,天然产物分离技术,影响分离的因素,分子极性大小,分子体积,PH,值,树脂柱的清洗,洗脱液的选择,操作,树脂预处理,装柱,上样,洗脱,树脂再生,薄膜蒸发仪,天然产物分离技术,实际应用,适合中等程度的水溶性化合物，天然色素，从发酵,液中得到抗生素,(,青霉素,/,先锋霉素,/,螺旋霉素,),蛋白质,(,胰岛素,/,肽系抗生素,),，功能性食品添加剂,(,维生素,),等,聚苯乙烯合成吸附树脂吸附 含有,电子的化合物,如含有苯环和共轭双键的化合物,甲基丙烯酸甲酯类吸附剂吸附 含羧基、酯基、,氨基、酰胺基等与,H,可结合的官能团的化合物,天然产物分离技术,大孔树脂在贯叶金丝桃提取物制备中的应用,贯叶金丝桃,80,乙醇提取物,正己烷,脱脂,乙酸乙酯提取,黄酮和双萘醌,残渣,溶于水,D101,树脂,水洗脱,除去杂质,95,乙醇洗脱,总黄酮,贯叶金丝桃,Hypericum,perforalurn,抗抑郁、抗病毒,天然产物分离技术,特殊柱色谱,干柱柱色谱,减压柱色谱 植物有效成分,特殊柱色谱 短柱柱色谱 分离新方法,闪式柱色谱,棒色谱,天然产物分离技术,干柱柱色谱,简介,特点,1,）优点：,a.,分离效果比湿法装柱高；,b.,可用薄层最佳分离条件直接套用；,c.,对有荧光或颜色的物质，可在紫外灯下将已,分离的各层带分别切开，避免常规液相层析,中因流出液收集不当而造成的层带交叉；,d.,适用于制备性分离,e.,设备简单，消耗溶剂少，工时省，,2,）缺点：,样品容量比湿法装柱小，因此，消耗填充剂量大,天然产物分离技术,原理,与薄层层析相同，借颗粒间的孔隙所产生的毛细作,用而展层，因此，可套用薄层条件，分离效果亦相,同。干填充剂颗粒的深孔内充满空气，溶剂和样品,分子很难进入颗粒的深孔，吸附与解吸主要在外部,表面进行。克服了样品分子由于进出填充剂深孔所,造成的扩散及传质缓慢，因此其柱效比湿装柱高。,1,）填充剂种类：,a.,吸附色谱（硅胶、氧化铝）,b.,聚酰胺色谱,c.,分配色谱,天然产物分离技术,2,）展开剂：,多采用混合溶剂,避免溶剂解混产生，影响分离效果,解决办法：搭配极性相差适当的溶剂,如 石油醚,-,乙醚 氯仿,-,乙醇,石油醚,-,乙醇 氯仿,-,甲醇,苯、苯酚等不透过紫外光的溶剂对紫外光灯,检出层带有影响,3,）分离条件探索,探索和选择对样品分离度最大的填充剂和展开剂,薄层色谱,(,最佳分离条件,),同批次,4,）样品容量,1:100 1:300,样品只能与吸附剂的外部表面接触,天然产物分离技术,操作,a.,柱的制备,(,常用,50cm),聚乙烯薄膜柱,玻璃柱,b.,加样和展开,加样：溶液加样；拌样加样,展开：,c.,层带的定位及分割,天然产物分离技术,天然产物分离技术,减压柱色谱（抽柱）,简介,简便、实用、快速的层析方法，其基本原理与吸附,层析相同，适用于较大量的制备性分离或提取物的,极性分段划分。（粗分）,操作,G-4,垂熔玻砂漏斗或短粗柱、磨底抽滤瓶、减压泵,及分部收集瓶组成。,a.,装柱,b.,上样,c.,洗脱,d.收集,天然产物分离技术,注意事项,a.,真空度,2070 mmHg,b.,洗脱剂极性,由小到大梯度递增,c.,交叉色带,应用实例,二萜生物碱的分离,黄酮的分离,天然产物分离技术,闪式柱色谱,简介,20,世纪,70,年代末发展起来的快速柱色谱技术,柱短，分离时间短，快，分离效率高。,闪式硅胶,（,Flash Silica gel,）进口,/,国产,球型微粒，粒度在,40-63,m,m(230-400,目,),之间,加压层析,0.3-1Kg/cm,2,10mg-10g,样品,10-15min,天然产物分离技术,天然产物分离技术,天然产物分离技术,操作,与普通柱层析法基本相同。,a.,装柱：湿法 干法（,20cm,）,b.,上样：拌样 湿法,c.,洗脱：,Rf 0.2-0.3,加液,8-10cm,，加压,实际应用,皂苷、甾体、生物碱、黄酮,天然产物分离技术,加压柱色谱,类型,低压柱层析,加压柱层析 中压柱色析,高压柱色析,优点,分离因子,a,高，故能完成复杂的分离过程,a,=,两组分的相对保留时间之比,分离因子是评价色谱柱选择性的一种指标,天然产物分离技术,制备型与分析型的区别：,分析型：不要求样品回收,制备型：要求样品载量高，因此便要求有特殊的层析,装置和操作系统,基本原理,1,）加压柱层析效果的好坏,Speed,分析型,制备型,Resolution,Load,与,Load,相关的因素,柱径 柱长 粒度 填充剂密度,2,）加压柱色谱目的,得出一个化合物,Lab.,一定纯度,回收率,生产规模 单位时间内分得的化合物量,洗脱液流速快,可用更细的颗粒，分辨率提高,避免不稳定化合物在开口柱上由于长时间暴露而,导致分解（最大优点）,天然产物分离技术,3,）分类,Analytical HPLC:ug-5mg,Prep.HPLC:5 mg-gms,Low-pressure LC:10mg-1g,Medium-pressure LC:100 mg-100 g,选择制备型系统要考虑的事,以上各法的极限（适应范围）,要分离的样品量,根据以上条件要求而选用的方法,柱大小，固定相，压力，洗脱剂,天然产物分离技术,4,）操作,a TLC,探索条件（层析系统选择）,b,分析型小试,c,优化条件（超载）,d,套用优化条件（制备）,e,正式操作,f,获得纯品,g,分析鉴定纯品,h,柱的再生,天然产物分离技术,5,）,Prep.LC,的各种条件的应用情况及优化,a.Column:loading,f,size,column efficiency,a,K number of theoretical plates,resplution,b.Stationary phase:,硅胶,-,普通,(,正相,),键合相,(,反相,),AgNO,3,-coated silica gel-,涂层,AgNO,3,分离萜类,(,不同双键数目或位置,),Paired-ion Chromatography-,生物碱,在柱上增加一种离子,该离子与欲分离物,相反,从而成为离子对,而成中性,易分离,Chiral stationary phase,c.,装柱技术,天然产物分离技术,d.,加样法（,Sample introduction,）,e.,加压泵（,Pump,）,f.,检测器（,Detectors,）,g.,流动相（,Eluent,）,h.,分离样品收集,天然产物分离技术,低压柱色谱,简介,低压柱层析可以用玻璃自制，现绝大多数是购买,预制柱。,长度：从,240mm-440mm,内径：从,10mm-37mm,外径：从,13mm-42mm,L ID OD,进样量,A 240 10 13 0.3-1ml 0.2g,B 310 25 28 1-5ml 1g,C 440 37 42 2-10ml 3g,天然产物分离技术,操作,a.,填充剂,40-60,m,m,与,TLC,相同，流速快,b.,加压,氮气瓶,(,约,5bar),；机械泵,c.,洗脱,d.,收集,天然产物分离技术,天然产物分离技术,中压柱色谱,简介,载样量,0.1-1g,流速,30-100ml/min,填料粒度,20-30,m,m,最大压力,70 bar,操作,a.,装柱,b.,上样,c.,洗脱,d.,收集,天然产物分离技术,天然产物分离技术,制备型,HPLC,简介,载样量,1-100g,流速,25-170 ml/min,填料粒度,25-200,m,m,最大压力,40 bar,操作,a.,装柱,b.,上样,c.,洗脱,d.,收集,天然产物分离技术,天然产物分离技术,天然产物分离技术,天然产物分离技术,1,2,3,天然药物化学简介,提取、分离技术,结构研究方法简介,纯度鉴定,1,）物理常数：,mp,，,D,2,）,TLC,（,PC,）：三种展开系统均为单一斑点。,3,）,GC,，,HPLC,天然产物分离技术,天然产物分离技术,化合物类型,1,）文献调研：同种、同属及相近属植物的成分,2,）鉴别反应：,化合物结构,1,）光谱方法：,UV,IR,、,NMR,、,MS,2,）化学沟通：化学降解、衍生物制备、人工合成,3,）立体结构：,CD,、,ORD,、,2D-NMR,、,X-,射线衍射,天然产物分离技术,光谱法简介,1,）质谱（,MS,）,/,高分辨质谱（,HR-MS,）,确定分子量,确定分子式,离子源,:,电子轰击,(EI),，化学电离,(CI),，电喷雾,(ESI).,天然产物分离技术,2,）红外光谱（,IR,）,提供结构中官能团、骨架等信息；,4000-1500 cm,-1,特征频率区；,1500-600 cm,-1,指纹区。,天然产物分离技术,3,）紫外光谱（,UV,）,适用于分子中含有共轭双键、,-,不饱和羰基、,芳香类化合物。,天然产物分离技术,4,）核磁共振谱（,NMR,）,氢谱（,1,H-NMR,）,提供信息：化学位移；积分曲线（氢个数）；,偶合常数,J,天然产物分离技术,碳谱（,13,C-NMR,）,提供信息：化学位移；碳个数；碳类型（,DEPT,）,天然产物分离技术,DEPT,谱,天然产物分离技术,二维谱（,2D-NMR,）,COSY,HMQC,HMBC,NOESY,TOCSY,COSY,谱可以归属相邻,H,信号,TOCSY,谱可以将自旋系统内一组,H,信号明确地归属,HMQC,谱可以将与之相对应的,C,信号加以归属,HMBC,谱对于判定成苷位置具有重要意义,天然产物分离技术,天然产物分离技术,HMQC,谱,天然产物分离技术,HMBC,谱,