分子生物学第三章-核酸的结构与功能.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,3.1 细胞内的遗传物质,3.2 核酸的化学组成与共价结构,3.3 DNA的二级结构,3.4 DNA的高级结构,3.5 真核生物的染色体及其组装,3.6 RNA的结构与功能,3.7 核酸的变性、复性与分子杂交,DNA的发现,在人们认识核酸的过程中，Griffith于1928年发现的“转化”现象具有重要作用。在那个著名的实验中，老鼠被,肺炎双球菌,感染肺炎后死亡。这种病菌的毒性来源于其表面的胶囊状多糖，因为它能使病菌免于被被感染细胞分解。不同类型（I、II、III）的肺炎双球菌具有不同的胶囊多糖，但所有的有毒病菌的胶囊多糖的表面都是平滑型（S型）。,每个S型肺炎病菌都可能会发生某种变化而生成一种表面粗糙型（R型）病菌（由位于S型病毒胶囊多糖层下的物质组成），这种病菌由于无法合成毒性多糖而不再具有毒性；在用R型病毒感染老鼠的实验中，由于被老鼠体内的抗体破坏而不会使老鼠致病。,对S型病菌进行热处理后，它们就不再具有毒性。但是一旦将这种热处理后的、无活性的病菌和R型病菌混合就会重新产生毒性。图1.2表明如果将两种无毒的病菌的混合物植入动物体内，就能使动物感染肺炎并死亡。而在病死的老鼠身上我们能检验到S型病菌的存在。,在这个实验所用的病菌中，无活性的S型病菌是III型的，活的R型病菌是从II型中提取的，而在死鼠身上检验到的有毒病菌的外壳与III型一样。这说明无活性的S型病菌的一部分物质促使活的R型病菌转化为S型病菌，因而能够合成胶囊多糖具有了毒性。,Figure 1.2 The transforming principle is DNA.,已死亡的病菌中的参与转化的那一部分物质称之为转化物。借助细胞分离机制、技术的发展，我们能够从无活性的S型病菌中将转移物提取出来的直接加入到R型病菌中去。在1944年Avery和他的同事们一系列著名的实验表明转移物的化学组成实际上就是脱氧核糖核酸（DNA）。,DNA的发现其意义是巨大深远的：虽然很久以前人们就认识到DNA是真核生物染色体的重要组成部分，但并不认为DNA也存在于肺炎球菌属的细菌中，这一发现表明原核生物的遗传物质也是DNA，同时也统一了人们在对细菌以及其它高级别生物体的遗传上的认识。,对于实验的结果在原文中这样分析到：“从化学、物理性质上分析，诱导物可能就是一种具有高聚合性和粘性的DNA。从另一个方面来看，III性的毒性多糖主要含无氮多糖，其合成受诱导物激发.如此我们就可以证明诱导物及其依次的产物在化学性质和生理作用上是截然不同的，专一的，而且在决定它们所控制的细胞部分的类型上是不可缺少的。”,这一段分析介绍了遗传物质与其表达产物的区别，也为后来的研究奠定了重要的理论基础。,RNA也是遗传物质,1956年A.Gierer和G.Schraman发现,烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus,TMV），其遗传物质是RNA。,1957年美国的Heinz Fraenkel-Conrat和B.Singre用重建实验证实了这一结论,。,核酸的化学组成与共价结构,核酸的组份,核酸是由许多核苷酸聚合而成的大分子，它的基本结构单位是,核苷酸，由碱基、戊糖和磷酸,构成。核酸所含的碱基为嘧啶和嘌呤的衍生物，主要有尿嘧啶（Uracil,U）胸腺嘧啶(Thymine,T)、胞嘧啶(Cytosine,C)、腺嘌呤(Adenine,A)和鸟嘌呤（Guanine,G），此外还有次黄嘌呤和一些稀有碱基。戊糖有核糖和脱氧核糖两种。RNA为核糖，DNA为脱氧核糖。DNA分子中的碱基为A、T、G、C，而RNA分子中为A、U、G、C。,BASES,NUCLEOSIDES,NUCLEOTIDES,Adenine(,A,),Adenosine,Adenosine 5-triphosphate(,ATP,),Deoxyadenosine,Deoxyadenosine 5-triphosphate(,dATP,),Guanine(,G,),Guanosine,Guanosine 5-triphosphate(,GTP,),Deoxy-guanosine,Deoxy-guanosine 5-triphosphate(,dGTP,),Cytosine(C,),Cytidine,Cytidine 5-triphosphate(,CTP,),Deoxy-cytidine,Deoxy-cytidine 5-triphosphate(,dCTP,),Uracil(,U,),Uridine,Uridine 5-triphosphate(,UTP,),Thymine(,T,),Thymidine/,deoxythymidine,Thymidine/deoxythymidine,5-triphosphate(,dTTP,),Comparisons of names of bases,nucleosides and nucleotides,Purine:A (deoxy)-ribose,Nitrogenous bases,Bicyclic,purines,:,Monocyclic,pyrimidine,:,Thymine(T)is 5-methyluracil(U),在核苷酸分子中，戊糖的半缩醛羟基与碱基中的氢失水缩合成,N-糖苷键,而形成核苷，核苷的5-位羟基与磷酸通过,酯键,形成5-核苷酸，不同的核苷酸用碱基第一个字母来命名。嘌呤和嘧啶都是含氮杂环化合物，具有弱碱性，难溶于中性水溶液。另一个特点是碱基的环氮及所含的官能团能成为氢键的供体或受体。,Ad,e,nosine,guanosine,cytidine,thymidine,uridine,R,Ribose,or,2-deoxyribose,Nucleosides,In nucleic acids,the bases are covalently attached to the 1 position of a,pentose sugar,ring,to form a nucleoside,Glycosidic(glycoside,glycosylic)bond,(,糖苷键),Nucleotides,A nucleotide is a nucleoside with one or more phosphate groups bound covalently to the 3-,5,or(in ribonucleotides only)the 2-position.In the case of 5-position,up to three phosphates may be attached.,Deoxynucleotides,(deoxyribose containing),Ribonucleotides,(ribose containing),Phosphate diester bonds,多核苷酸链,多核苷酸链是由,核苷酸通过3，5-磷酸二酯键连接,成的长的线型分子。在多核苷酸链中交替的磷酸和2-脱氧核糖构成了分子的骨架，碱基为侧链。不同的多核苷酸链中，骨架是相同的，不同的是碱基的种类和排列顺序。根据规定，,多核苷酸链以连接于5-羟基的磷酸开始，以脱氧核糖的3-羟基终止,。表示法：pGpCpApT或pGCTA。,Phosphodiester bonds,DNA/RNA sequence,:,From 5 end to 3 end,Example:,5-UCAGGCUA-3,=UCAGGCUA,3 end:,free hydroxyl(-OH)group,5end:,not always has attached phosphate groups,DNA双螺旋模型的诞生,Watson&Crick,建立双螺旋模型主要是受到4个方面的影响：,（1）1938年,W.T.Astbury&Bell,用x衍射技术研,究DNA。1947年拍摄了第一张DNA的衍射,照片，并推断DNA分子的结构是：,柱状；,多核苷酸是一叠扁平的核苷酸；,核酸残基取向和分子长轴垂直,间距为3.4。,（2）1951年,Pauling&Corey,运用化学的,定律来推理，而不做具体的实验，,建立了蛋白质的-螺旋模型；,（3）晶体学者美,J.Donoh&Chargaff,的指点。,（4）,R.Franklin&Wilkins,在1952年底拍,得了DNA结晶X衍射照片。,1951年，,Pauling,提出了蛋白质的,-螺旋,结构。,1952年，,Wilkins,和,Franklin用高度定向的DNA纤维作出高质量的X-光衍射照片,1953年，,Watson,和,Crick,提出DNA的反向平行,双螺旋,模型,1962年，,Wilkins,、,Watson,和,Crick,共获诺贝尔化学奖。,DNA的双螺旋结构,1953年Watson-Crick发表DNA双螺旋模型之前，人们已经取得的结果,：,1、Chargaff(1949)证实不同物种DNA中A=T，G=C，A+G=T+C，物种之间DNA的不同在于（A+T）：（G+C）的比例不同。,2、M H Wilkins制作了高质量的DNA x-衍射图像，根据该图可推测DNA的分子结构和原子间距，但Wilkins并未对该图做出DNA为双螺旋结构的推论。,Watson和Crick根据前人的工作，发挥天才的想象，提出了DNA双螺旋模型，其特征为：,1、DNA分子是由两条多核苷酸链围绕一个中心轴盘绕而成，两条链方向相反，一条为5-3，另一条为3-5。,2、两条链为右手螺旋。,3、脱氧核糖和磷酸构成双螺旋的主链、亲水，4种碱基的排列顺序因物种不同而不同，位于双螺旋的内部，疏水，导致DNA形成右手螺旋，二条多核苷酸链依靠碱基的氢键联系。每个螺旋含10个碱基，螺距34，相邻碱基对间距为3.4。,4、双螺旋中，碱基之间具有严格的配对关系，A与T配对形成二个氢键，G与C配对形成三个氢键。,5、相邻的二个碱基对配对时不在同一位置（由于脱氧核糖中连接碱基的C并不正好处在螺旋的相对位置上），使二条链与中心轴间距不同，所以在DNA双螺旋的表面形成大沟和小沟，酶等大分子自大沟进入，进行复制，调控等生物活动。,DNA double helix,Watson and Crick,1953.,Two separate strands,Antiparellel,(5,3 direction),Complementary,(sequence),Base pairing,:,hydrogen bonding that holds two strands together,Essential for replicating DNA and transcribing RNA,Sugar-phosphate backbones,(negatively charged):outside,Planar bases,(stack one above the other):inside,Base pairing via hydrogen bonds,Double helix,B form,:,Right-handed,10 base pairs/turn,34,/turn,Diameter:ca.20,Other forms:,A,:11 bases/turn,base plate 20,slant,Z,:12 bases/turn,left-handed helical,one groove,C1,Nucleic Acid,Structure,DNA双螺旋结构的多态性,1、A-DNA,和,B-DNA,在自然状态下，在溶液中DNA一般为B型，在实验室中使水合的B-DNA溶液脱水，则DNA将从B型转变为A型。,在机体内DNA-RNA杂合分子可能是A型，RNA-RNA双螺旋也是 A型。,此外，除了A、B-DNA外，在实验室还观察到了其他构象的DNA，这一现象称为DNA结构的多态性（polymorphism），B-DNA是DNA的二级结构的基本构象，也是最稳定的构象。,DNA结构产生多态性的原因：多核苷酸链的骨架含许多可以转动的单键，主要的转动发生在磷酸二酯键的两个O-P键上，N-苷链也可转动，人而使糖环可采取不同的折叠形式和苷键采取不同的构象。,2、Z-DNA,Z-DNA是美籍华人科学家王惠君和Rich研究寡核苷酸d（CG）x3的x射线分析后发现的（1979）。,当溶液中Na+的浓度高至足以中和DNA上的磷酸基上的负电荷时，B-型DNA转变为Z型DNA，左手双螺旋，由于Z-DNA中戊糖-磷酸链在螺旋外的走向呈“Z”型，故名Z-DNA。,在实验中这种Z-DNA主要在适当离子条件下，由不少于6bp的交替嘌呤-嘧啶序列形成的，现已有证据说明Z-DNA存在于天然的DNA中，其存在可能与基因表达的调控有关。,A型,B型,Z型,螺旋方向右手,右手,左手,直径,约2.6nm,约2.0nm,约1.8nm,每匝螺旋碱基对数目(n),11,10,12(6个二聚体),每对碱基旋转角度(=360n),33,36,60(每个二聚体),每对碱基旋转上升(h),0.26nm,0.34nm,0.37nm,螺距,2.8am,3.4nm,4.5nm,碱基对与中心轴倾角,20,6,7,大沟,窄，深,宽，深,平坦,小沟,宽，浅,窄，深,窄，深,糖苷键,anti,anti,anti(嘧啶),syn(嘌呤),反向重复序列,真核细胞DNA上的另一个特点是有大量的反向重复序列，即正读和反读都有相同的意义的序列。对DNA结构来说，即在一个假想轴的两侧，某些碱基序列之间有倒转重复的关系，DNA变性后，倒转重复序列之间可以形成十字形结构或发夹结构。,-NABCDEF-EDCBAN-,-NABCDE-FEDCBAN-,DNA的高级结构,十字架结构,DNA三股螺旋构型称为H-DNA，它是双螺旋DNA分子中一条链的某一节段，通过链的折叠与同一分子中DNA结合而形成。其中一条链只有嘌呤AG，另一条链只有嘧啶CT，H-DNA可在转录水平上阻止基因的转录。,超螺旋结构是DNA分子高级结构的主要形式，可分为正超螺旋与负超螺旋两类，,超螺旋方向与双螺旋方向相反，为负超螺旋即左旋,，是主要的超螺旋结构。,线状DNA形成的超螺旋,环状DNA形成的超螺旋,拓扑异构酶,or溴化乙锭,拓扑异构酶,or溴化乙锭,DNA扭曲与双螺,旋相同（拧紧）,DNA扭曲与双螺旋相反（松开）,负超螺旋,松弛DNA,正超螺旋,Lk,=,Lk,o,Relaxed,closed circular,Re-join the DNA,Lk,=,Lk,o,4,Lk,=-4,Break the circular DNA,Untwist 4 x 360,o,twist 4 x 360,o,Lk,=,Lk,o,+4,Lk,=+4,DNA isolated from cell negatively supercoiled by 6 turns per 100 turns of the helix.,Lk,/,Lk,=-0.06,Negatively,supercoiled,positively,supercoiled,Lk,=-4,染色质结构,Chromatin Structure(eukaryotic cells),染色质是一种纤维状结构，高度有序的DNA-蛋白质复合物，由核小体（nucleosome）成串排列而成。在细胞核的大部区域，染色质的折叠压缩程度较小，染色时着色浅，这部分染色质叫常染色质（euchromatin），DNA的包装比为10002000。细胞分裂时，常染色质进一步折叠压缩，形成典型的染色体结构，此时DNA的包装比为10000。而着丝点等部位的染色质在细胞间期就折叠得非常紧密，和细胞分裂时的染色体类似，这部分叫异染色质(,heterochromatin)。,异染色质,组成型异染色质：DNA序列从来不转录，如卫星DNA,机动性异染色质：常染色质 异染色质,哺乳动物两个X染色体中一个随机失活，没有转,录活性，这个作用叫异染色质化,Chromatin 染色质,Cell cycle,Interphase 间期,:G1+S+G2 (G0),M phase,(mitosis 有丝分裂):Prophase 前期,metaphase 中期,anaphase 后期 telophase 末期,Cell cycle,Easy to see chromosome 染色体,组蛋白(Histones),:,一种碱性蛋白质，等电点pH11以上，有5种主要的蛋白质，分别命名为,H1,H2A,H2B,H3,H4,核心组蛋白,(H2A,H2B,H3 and H4),:,10-20,kDa,located in the,nucleosome,(,核小体,)core,octamer,八聚体,core(H2A),2,(H2B),2,(H3),2,(H4),2,highly conserved in their sequences,H1,在不同物种或同种不同小种之间在序列上有较多的差异。,核小体,构成染色质的基本单位，包含200bp左右的DNA，一个组蛋白八聚体和一个分子的组蛋白H1。组蛋白八聚体由各两分子的,H2A,H2B,H3 和 H4,组成，称为核心组蛋白，其表面的DNA称核心DNA，两个核心颗粒之间的DNA称为连接DNA,Histone octamer 组蛋白八聚体,Top view,Side view,Nucleosome(核小体,)core(核心),Nucleosome core,146 bp,1.8 superhelical turn,Chromatosome,166 bp,2 superhelical turn,DNA,Histone octamer,Histone H1,连接DNA,连接,核小体核心颗粒之间的DNA分子，长度从几个bp到大于l00bp不等，平均约55bp。这样核小体重复的单位长约200bp。,Nucleosome(核小体)is the basic structural subunit of chromatin,consisting of 200 bp of DNA and an octamer of histone proteins.,DNA+Histone octamer(组蛋白 八聚体)Nucleosome core(核小体核心 146bp)+H1 Chromatosome(染色小体 166bp)+linker DNA=,Nucleosome,(核小体)(200 bp of DNA),Steps to make a,Nucleosome,(核小体),Nucleosomes and micrococcal nuclease treatment,Linker DNA,100 bp,average 55 bp,“Beads on a string”,structure,Nucleosome,Histone H1,Nucleosome repeat:,Core+linker DNA,Ca.200 bp,30纳米纤丝,（,The 30 nm fiber）,Higher,ordered,Left-handed helix,Six,nucloesomes,per turn,30 nm fiber,(30nm in diameter),Solenoid-like,Nucleosome repeat,Core+linker DNA,ca 200 bp,核小体被组装成高度有序的螺线管结构，直径30nm.,Nuclear matrix(,核基质),protein complex,30 nm fiber,300 nm,高级结构、Highest level of chromatin organization:,looped domain structure,100kb,Steps from DNA to chromosome,RNA的结构与功能,RNA的结构特征：,1,.RNA分子的碱基组成主要是A、G、C、U。此外，RNA分子中含有多种稀有碱基,2,.RNA多为单股多核苷酸链，局部可形成双链,3,.RNA分子比DNA分子小。按其在基因表达中的作用常分为三大类,转移RNA,转移RNA（transfer RNA，tRNA）：在多肽链的合成中起转运氨基酸的作用,特征：,1,.分子量小，常由70-90个核糖核苷酸残基组成（平均76），约占总RNA的,10-15,2,.稀有碱基及核苷含量丰富,3,.tRNA的5端大多为p,G,，3端为,CCA,（与氨基酸相连）,4,.tRNA均可以形成二级和三级结构,tRNA中稀有碱基很高，达20%；它们是在转录后,酶促修饰形成的。,tRNA的二级结构呈三叶草型，二级结构有四个螺旋区、,三个环,、和一个附加叉,第一个环:,DHU,环，含二氢尿嘧啶,第二个环:,反密码环,，与mRNA上的三联密码互补配对，在蛋白质合成中解读密码子，把正确的氨基酸引入合成位点,第三个环:,T环,，含有稀有碱基胸腺核苷T和假尿苷,tRNA的三级结构为倒L型,tRNA二级结构示意图,tRNA三级结构示意图,信使RNA(mRNA),信使mRNA是蛋白合成的模板。mRNA种类多，含量少，占RNA总量的,5-10,。,mRNA的T1/2短，代谢率高。一般不超过数小时或几天(原核5min,真核5h)。组成单位：A、G、C、U。,它们按一定顺序通过3，5磷酸二酯键相连形成一多核苷酸链。其残基数从几百到几万不等。,原核mRNA5UTR含有丰富的嘌呤序列参与翻译的起始；真核生物mRNA5UTR差异很大，通常与特异蛋白因子结合调控翻译的起始,成熟的mRNA,真核生物mRNA的一级结构特点,mRNA,的,3,端有一长约,200,个,A,的,polyA,尾,mRNA,的,5,端有一,7mG.5ppp5NpN,帽,真核细胞,mRNA,的二级结构没有发现有规律可循，但,mRNA,自身可以在局部折叠形成局部性双螺旋或发卡结构,真核细胞核内的,mRNA,的初级转录本含有内含子，再变为成熟的,mRNA,之前尚需一系列的剪切加工,mRNA结构示意图,核蛋白体RNA,核蛋白体RNA（ribosomal RNA，rRNA）与蛋白质组成核蛋白体,参与蛋白的合成,，,是蛋白合成的场所,。rRNA是细胞中RNA含量最多的一种，约占总RNA的,75-80,真核细胞中含4种rRNA，按其含氨基酸残基数目的多少，分为28S、5.8S（大亚基）；18S、5S（小亚基）,rRNA的结构特点,1.含量最丰富,约占总RNA的80%以上,2.与核蛋白体蛋白结合成核蛋白体,rRNA,与蛋白质既可分离,又可结合,3.核蛋白体由大小两个亚基构成,两亚基呈不 规则形状,聚合时中间有裂缝,可通过mRNA,rRNA的功能,是细胞内蛋白质合成的场所,其他RNA,小核RNA（SnRNA)、,小核仁RNA(SnoRNA)、,小胞质RNA（scRNA/7SL-RNA),功能,：参与HnRNA和rRNA的转运和加工,hnRNA：核内不均一RNA，mRNA的初始转录物。,原核生物核糖体的亚基组成,原核生物核蛋白体,真核生物核蛋白体,核酸的变性、复性和杂交,（一）变性：对DNA加热时，DNA双键之间的氢键断裂的过程，称DNA的变性或叫DNA的融解。DNA的变性发生在一个狭窄的温度范围，并伴随、许多物理性质的变化，粘度降低、生物学功能丧失，其中最有用的是增色效应。通常把,e,(p)吸收值到最高值的二分之一时的温度或吸收值增加的中点温度称“熔点温度”（melting temperature,Tm），Tm值一般在70-85之间。,Effect of,Alkali,Application,DNA,denaturation,at high pH,keto form,enolate form,keto form,enolate form,Base pairing is not stable anymore because of the change of,tautomeric(异构),states,of the bases,resulting in DNA denaturation,（酮式）,（烯醇式）,RNA,hydrolyzes,at higher pH because of 2-OH groups in RNA,Effect of,Alkali,&Application,RNA is unstable at higher pH,OH,free 5-OH,2,3-cyclic phosphodiester,alkali,Chemical,Denaturation,Urea,(H,2,NCONH,2,)(尿素）:,denaturing PAGE,Formamide,(HCONH,2,)（甲酰胺）,and formaldehide,(甲醛),:Northern blot,Disrupting the hydrogen bonding of the bulk water solution,Hydrophobic effect(aromatic bases)is reduced,Denaturation of strands in double helical structure,增色效应：DNA变性时其溶液OD260增高的现象。,影响Tm值的因素,1、DNA的均一性，均质的DNA熔解过程发生在较小的温度范围内，异质的DNA，则发生在熔解过程在较宽的温度范围内。,2、G-C含量：Tm与G-C含量成正比，测定Tm值，可以推算出DNA的碱基的百分组成，其公式为：,G-C%=（Tm-69.3）x 2.44,在pH7.0，0.165 M NaCl溶液中DNA的Tm值与G-C含量之间有正比关系，G-C含量越多，Tm值越高。,3,、介质中的离子强度离子强度较低的介质中，DN的熔解温度较低，离子强度较高的介质中，DNA的Tm值较高，且发生熔解的温度范围较小。因此，DNA制品不应保存在极稀的电解溶液中。一般1M NaCl中保存较为稳定。,DNA的复性：在适当的条件下，变性DNA分子又可彼此重新缔合成双螺旋结构，这一过程称复性或退火。复性后DNA的一系列物理化学性质得到恢复。,1、DNA变性后骤然冷至低温时，不能复性。,2、缓慢冷却时，可以复性,3、变性DNA的片段越大复性越慢。,4、变性DNA的浓度越高越容易复性,5、均质的较异质的变性DNA容易复性,6、真核细胞中的重复序列，复性最快。,分子杂交,由DNA复性研究发展而成的一种实验性技术，杂交可以发生在DNA之间，或RNA之间。可以用来估计DNA之间的同源序列，不同生物在进化过程中的相关性，DNA限制性片段的作用等，DNA：RNA杂交可通过RNA转录本检测DNA中特定基因的存在。,