实验六金黄色葡萄球菌的检验.ppt

Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,Click to edit Master title style,实验六 金黄色葡萄球菌的检验,Contents,革兰氏阳性球菌，直径为0.8-1.0微米，镜检时呈单个、成对、四联或不规则的簇群；,1,无芽孢，不运动,2,兼性厌氧菌，在好氧条件下生长最好,3,可在15%氯化钠和40%胆汁中生长,4,生物学特性-菌体形态及培养特征,2,广东科贸职业学院,3,广东科贸职业学院,电镜照片,4,广东科贸职业学院,5,、大多数菌株能生长在6.5-46之间（最适温度30-37）能在pH4.2-9.3之间生长（最适pH为7.0-7.5）；,6、大多数菌株产生类胡萝卜素，使细胞团呈现出深橙色到浅黄色，色素的产生取决于生长的条件，而且在单个菌株中可能也有变化,5,广东科贸职业学院,7,、好氧生长的细胞产生接触酶；,8、产生蛋白酶、脂肪酶、磷脂酶、脂酶和溶菌酶，大多数菌株可水解天然的动物蛋白，例如血红蛋白、纤维蛋白、卵白、酪朊和多肽类如明胶，水解脂类、吐温类和磷脂蛋白质，并释放脂肪酸,9、所有的毒株产生,凝固酶,，人和动物来源的菌株通常可凝固兔、人、马和猪的血浆。,6,广东科贸职业学院,致病性,金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，临床表现多种多样，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。,9,广东科贸职业学院,致病性,葡萄球菌性食物中毒是葡萄球菌肠毒素所引起的疾病，可引发不同程度的急性胃肠炎症状，恶心、呕吐最为突出而且普遍，腹痛、腹泻次之。,当金黄色葡萄球菌污染了含淀粉及水分较多的食品，如牛奶和奶制品、肉、蛋等，在温度条件适宜时，经8-10小时即可产生相当数量的肠毒素。,10,广东科贸职业学院,1,、目的要求,了解食品和食物中毒样品中金黄色葡萄球菌及肠毒素的检测方法,观察金黄色葡萄球菌的革兰氏染色镜检形态以及在血平板和Baird-Parker琼脂平板上生长的菌落特征,观察金黄色葡萄球菌产生血浆凝固酶现象,11,广东科贸职业学院,2,、基本原理,金黄色葡萄球菌可产生多种毒素和酶。,在血平板上生长可金黄色色素使菌落呈现金黄色；由于产生溶血素使菌落周围形成大而透明的溶血圈,在B-P平板上生长时，因将亚碲酸钾还原成碲酸钾使菌落呈灰黑色；因产生脂酶使菌落周围有一混浊带，而在其外层因产生蛋白水解酶有一透明带。,金黄色葡萄球菌型溶血,金黄色葡萄球菌在BP平板上的菌落形态,12,广东科贸职业学院,在肉汤中培养时，菌体可生成血浆凝固酶并释放于培养基中，此酶类似凝血酶原物质，不直接作用到血浆纤维蛋白原上，而是被血浆中的致活剂激活后，变成耐热的凝血酶样物质，此物质可使血浆中的液态纤维蛋白原变成纤维蛋白，血浆因而成凝固状态,13,广东科贸职业学院,葡萄球菌在自然界分布极广，空气、土壤、水、饲料、食品(剩饭、糕点、牛奶、肉品等)以及人和动物的体表粘膜等处均有存在，大部分不致病，也有一些致病的球菌。金黄色葡萄球菌是葡萄球菌属一个种。可引起皮肤组织炎症，还能产生肠毒素。如果在食品中大量生长繁殖，产生毒素，人误食了含有毒素的食品，就会发生食物中毒，故食品中存在金黄色葡萄球菌对人的健康是一种潜在危险,金黄色葡萄球菌能产生凝固酶，使血浆凝固，,多数致病菌株能产生溶血毒素，使血琼脂平板菌落周围出现溶血环，在试管中出现溶血反应。,这些是鉴定致病性金黄色葡萄球菌的重要指标。,14,广东科贸职业学院,肠毒素形成条件,：,存放温度，在37C内，温度越高，产毒时间越短；,存放地点，通风不良氧分压低易形成肠毒素；,食物种类，含蛋白质丰富，水分多，同时含一定量淀粉的食物，肠毒素易生成。,15,广东科贸职业学院,实验材料,仪器材料：显微镜、恒温箱、无菌吸管、无菌试管、无菌平皿、载玻片、L型涂布棒、酒精灯、接种环等,培养基及试剂：10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤、,7.5%,氯化钠肉汤,、血琼脂平板、Baird-parker培养基、无菌盐水、BHI肉汤、兔血浆、革兰氏染色液,16,广东科贸职业学院,B,P,平板,主要成分及作用,：,氯化锂、甘氨酸:抑制非制病性葡萄球的生长,丙酮酸钠:促进葡萄球菌生长,亚碲酸钾:抑制G,-,杆菌生长，可被金黄色葡萄球菌还原为碲盐呈黑色,卵黄:含蛋白质、卵磷、脂肪,17,广东科贸职业学院,检验程序,检验处理：取,25g,固体样品或吸取,25ml,液体样品，加入,225ml,灭菌生理盐水，固体制成混浊液,吸取5ml 上述混悬液，接种于50ml 7.5氯化钠肉汤或胰酪胨大豆肉汤50ml培养基内，置361培养24h,转种血平板和B-P 平板，置361培养24h，挑取血平板上金黄色（有时为白色）菌落时行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验,血浆凝固酶试验：取新鲜兔血浆，再加入培养24h的金黄色葡萄球菌肉浸液肉汤培养物0.5ml，振荡摇匀，置361温箱或水浴内，每半小时观察一次，观察6h，如呈现凝固，即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块者，被认为阳性。同时以已知阳性金黄色葡萄球菌株作为对照。,18,广东科贸职业学院,取2 5ml 样品，接种于225ml 7.5氯化钠肉汤培养基内，置361培养24h,转种血平板和B-P 平板，置361培养24h，挑取血平板上金黄色（有时为白色）菌落时行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验,血浆凝固酶试验：吸取1：4 新鲜兔血浆0.5ml，放入小试管中，再加入培养24h的金黄色葡萄球菌肉浸液肉汤培养物0.5ml，振荡摇匀，置361温箱或水浴内，每半小时观察一次，观察6h，如呈现凝固，即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块者，被认为阳性结果。同时以已知阳性和阴性葡萄球菌株及肉汤作为对照。,检验程序,直接计数法,19,广东科贸职业学院,25 mL样品+225mL 7.5%氯化钠肉汤,血平板,36,1,24h,镜 检,营养肉汤,血浆凝固酶,实验,报告结果,定性,检测,36,1,24h,36,1,24h,36,1,6,h,BP,平板,20,广东科贸职业学院,25g,样品+225ml 生理盐水,选三个连续梯度，每个梯度各取3mL加入3管胰酪胨大豆肉汤,将有生长的管划线接种,36,1,48h,镜 检,营养肉汤,血浆凝固酶,实验,报告结果 MPN/g(mL),定量,检测,（MPN法）,36,1,48h,36,1,24h,36,1,6h,适用于检测可能含有少量金黄色葡萄球菌，却带有大量竞争菌的样品,梯度稀释,21,广东科贸职业学院,25g,样品+225ml 生理盐水,选三个连续梯度，每个梯度分别取1mL接种之至表面干燥的B-P平板（如0.4mL，0.3mL，0.3mL）,平板计数（分别记录每种类型的菌落数）,36,1,48h,镜 检,营养肉汤,血浆凝固酶实验,报告结果,金葡菌数/g(mL),定量,检测,（平板法）,每种类型至少选取一个菌落,36,1,24h,36,1,6h,适用于检测金黄色葡萄球菌数,不小于10/g（mL）,的食品,梯度稀释,22,广东科贸职业学院,形态：金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，排列呈葡萄球状，无芽胞，无荚膜，致病性葡萄球菌，菌体较小，直径约为0.51um。,培养特征：在肉汤中呈混浊生长，在胰酪胨大豆肉汤内有时液体澄清，菌量多时呈混浊生长，血平板上菌落呈,金黄色,，有时也为白色，大而突起、圆形、不透明、表面光滑，周围有溶血圈。在B-P平板上为圆形、光滑凸起、湿润、直径为23mm，颜色呈,灰色到黑色,，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落似有奶油树胶的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落；但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。,23,广东科贸职业学院,24,广东科贸职业学院,25,广东科贸职业学院,直接计数法吸取上述1：10 混悬液，进行10倍递次稀释，根据样品污染情况，选择不同浓度的稀释液1ml，分别加入三块B-P 平板，每个平板接种量分别为0.3ml、0.3ml、0.4ml，然后用灭菌L 棒涂布整个平板。如水分多不易吸收，可将平板放在36,1,温箱1h，等水分蒸发后反转平皿置36,1,温箱培养。,在三个平板上点数周围有混浊带的黑色菌落，并从中任选五个菌落，分别接种血平板，36,1 24h,培养后进行染色镜检、血浆凝固酶试验，步骤同增菌培养法,菌落计数：将三十平板中疑似金黄色葡萄球菌黑色菌落数相加，乘以血浆凝固酶阳性数，除以5，再乘以稀释倍数，即可求出每克样品中金黄色葡萄球菌数。,26,广东科贸职业学院,结果,金黄色葡萄球菌革兰氏染色镜检阳性，致病菌较非致病菌小，大小排列整齐。细菌繁殖时多呈多个平面的不规则分裂，堆挤成葡萄串状。在中毒食品、脓汁或液体培养基中常呈单个或环状球短链排列，易误认为是链球菌,血平板上菌落呈金黄色，周围有溶血圈。在B-P平板上呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。,致病性葡萄球菌血浆凝固酶为阳性,27,广东科贸职业学院,注意事项,样品中金黄色葡萄球菌计数进行10倍稀释时要注意，每个稀释度要更换吸管,实验中操作者须注意生物安全防护，实验结束后要消毒环境，把实验室材料高压灭菌后方可清洗或弃之。,28,广东科贸职业学院,思考题,金黄色葡萄球菌引起食物中毒的机理是什么？,为什么要采用血浆凝固酶实验来决定葡萄球菌的致病和不致病？,29,广东科贸职业学院,金黄色葡萄球菌在血琼脂平板上（1824h）,金黄色葡萄球菌在B-P平板上的菌落形态,30,广东科贸职业学院,金黄色葡萄球菌凝固酶实验（玻片法）,金黄色葡萄球菌凝固酶实验（试管法）,31,广东科贸职业学院,Thank You!,