基因工程1.2.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因工程的基本操作程序,陕西师大附中,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因工程的基本操作程序,陕西师大附中,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因工程的基本操作程序,陕西师大附中,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因工程的基本操作程序,陕西师大附中,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因工程的基本操作流程,基因工程的基本操作程序,获取目的基因,构建表达载体,导入受体细胞,目的基因检测与鉴定,第一步,第二步,第三步,第四步,一、目的基因的获取,目的基因：主要指的是编码蛋白质的结构基因,获取方法：,（1）从基因文库中获取目的基因。,（2）PCR技术扩增目的基因,（3）人工合成,基因文库的构建模式图,通过对受体菌的培养而储存基因,3.基因文库的构建,（1）基因组文库的构建,提取某生物,全部DNA,用适当,限制酶切割,许 多,DNA片段,与载体连接,导入受体菌群,该生物基,因组文库,（每个受体菌含有一段不同的DNA片段）,（2）cDNA文库的构建mRNA反转录形成,mRNA,反转录酶,杂交双链,核酸酶H,单链DNA,DNA聚合酶,双链DNA,与载体连接,导入受体菌群,该生物,cDNA文库,（二）利用PCR技术扩增目的基因,1.原理,PCR是聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）,它是利,用DNA 双链复制的原理,，将基因的核苷酸序列不断的加以复制，使其数量呈指数方式增加。因为整个过程是在体外进行，所以又叫做,体外DNA扩增技术,。,前提：必须对目的基因有一定的了解，需要设计引物。,2.过程,双链DNA是在高温条件下解链为单链DNA的，因此整个过程不需要解旋酶。,多次重复,3.特点：指数形式扩增，2,n,目的基因,DNA,受热变性，解链,引物与单链互补结合,在,DNA,聚合酶作用下延伸,重复循环完成扩增,高温变性（9095）,低温退火（5560）,中温延伸（7075）,PCR扩增仪,PCR(多聚酶链式反应),（三）通过DNA合成仪直接合成目的基因,DNA合成仪,推测,推测,合成,当基因比较小、蛋白质的氨基酸序列可以测得或核苷酸序列已知时，可采用此种方法。,蛋白质的氨基酸顺序,mRNA,核苷酸序列,基因DNA的核苷酸序列,目的,基因,二、基因表达载体的构建,用限制酶切割质粒使之出现一个切口，将目的基因插入切口处，让目的基因的黏性末端与切口上的,黏性末端互补配对后，在连接酶的作用下连接形成重组DNA分子，即基因表达载体。,质粒,目的基因,限制酶,DNA连接酶,重组,DNA,（一）构建目的,使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。,（二）构建零件及其作用,1.目的基因,2.启动子 位于基因的首端，RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动基因转录出mRNA，进而获得需要的蛋白质。,3.终止子 位于基因的尾端，终止转录。,4.标记基因 鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。,三、将目的基因导入受体细胞,将目的基因导入受体细胞并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程称为,转化,。,基因工程中常用的受体细胞有,大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌和动植物细胞,等。,导入受体细胞的方法,主要,是借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径，且因受体细胞的不同而不同。,1.农杆菌转化法,（一）导入植物细胞,2.其他方法（见教材P,12,“生物技术资料卡”）,（1）基因枪法,（2）花粉管通道法,（二）导入动物细胞,显微注射技术,含目的基因的表达载体,动 物 的,受 精 卵,含目的基因的受精卵,早 期,胚 胎,雌性动物输卵管或子宫,转基因,动 物,显微,注射,分裂,分化,移 植,发,育,问题,为什么将目的基因导入动物细胞常用的受体细胞是受精卵？,（三）导入微生物细胞,2.优点,繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少、操作简单、价格低廉。,3.常用受体细胞,大肠杆菌（,E.coli,）,1.过程1）制备,感受态细胞,：用,Ca,2+,（CaCl,2,）,处理细菌，使细菌易于接受外源DNA分子。,（2）重组DNA分子与感受态细胞混合，,在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，,完成转化。,Ca,2+,处理法,四、目的基因的检测与鉴定,目的基因是否真正插入受体细胞的DNA中，是否能够在受体细胞中稳定遗传和正确表达，只有通过检测、鉴定才能得知。,常用的检测手段主要从,分子水平,和,个体水平,进行。,（一）分子水平,1.检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因,提取受体生,物全部DNA,适当限制,酶切割,DNA片段,用同位素标记的,目的基因片段杂交,显 出,杂交带,（表明目的基因已插入）,DNA分子杂交技术DNA与DNA杂交,2.检测目的基因是否转录出了mRNA,提取受体生,物的mRNA,用同位素标记的,目的基因片段杂交,显 出,杂交带,（表明目的基因已转录出了mRNA）,检测DNA利用的是DNA与DNA杂交，检测mRNA利用的是,DNA与mRNA杂交。,分子杂交技术DNA与RNA杂交,3.检测目的基因是否翻译出蛋白质,蛋白质分子（抗原抗体）间的杂交技术,提取受体生,物的蛋白质,与相应抗体杂交,显 出,杂交带,（表明目的基因已形成蛋白质产品）,（二）个体水平,例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。,功能活性鉴定、抗性鉴定,归纳:基因工程的基本操作程序,获取目的基因,从基因文库,利用,PCR,化学方法人工合成,构建基因表达载体,目的基因、启动子、终止子、标记基因,将目的基因导入受体细胞,农杆菌转化法、显微注射法、,Ca,2+,处理法,目的基因的检测与鉴定,检测：是否插入、转录、翻译,例：如图为利用生物技术获得生物新品种的过程，据图回答：,（1）在基因工程中，AB为,技术，利用的原理是,，其中为,过程。,（2）加热至94的目的是使DNA中的,键断裂，这一过程在细胞内是通过,的作用来完成的。,（3）当温度降低时，引物与模板末端结合，在DNA聚合酶的作用下，引物沿模板链延伸，最终合成两条DNA分子，此过程中的原料是,，遵循的原则是,。,（4）目的基因导入绵羊受体细胞常用,技术,（5）BD为抗虫棉的培育过程，其中过程常用的方法是,，要确定目的基因（抗虫基因）导入受体细胞后，是否能稳定遗传并表达，需进行检测和鉴定工作，请写出在个体生物学水平上的鉴定过程：_,例：如图为利用生物技术获得生物新品种的过程，据图回答：,原核细胞的基因结构,原核细胞基因,编码区（编码序列）：能指导有关蛋白质的合成，即能够编码蛋白质,非编码区（调控序列）：位于编码区上游和编码区下游的DNA序列，虽不能指导有关蛋白质的合成，但有调控遗传信息表达的核苷酸序列，如启动子、终止子等,原核细胞的基因结构,RNA,聚合酶的作用是催化DNA转录为RNA。它能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并与DNA分子的一条链为模板合成RNA。,真核细胞的基因结构,与原核细胞比较，真核细胞基因结构的主要特点是：,编码区是间隔的、不连续的。也就是说，能够编码蛋白质的序列被不能够编码蛋白质的序列分隔开来，成为一种断裂的形式。,其中，能够编码蛋白质的序列叫做,外显子,，一般不能够编码蛋白质的序列叫做,内含子,。,真核细胞的基因结构,真核细胞基因,编码区,（间隔、不连续）,外显子：能编码蛋白质的DNA序列,内含子：不能编码蛋白质的DNA序列,非编码区：与原核生物具有相似功能的启动子、终止子,原核细胞与真核细胞的基因结构比较,原核细胞,真核细胞,不同点,编码区是,连续的,编码区是间隔的、不连续的,相同点,都由能够编码蛋白质的编码区和具有调控作用的非编码区组成的,