基因工程ppt04.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,表4-1 5种常见高容量克隆载体及其基本特性,载体,容量（kb）,复制子,宿主,拷贝数,重组DNA导入宿主的方式,筛选标记,克隆DNA获取方法,黏粒,30-45,ColE1,大肠杆菌,高,转导,碱抽提,P1,70-100,P1,大肠杆菌,1,转导,sacB,PAC,130-150,P1,大肠杆菌,1,电转化,sacB,BAC,120-300,F,大肠杆菌,1,电转化,-互补,YAC,250-400,ARS,酵母菌,1,转化,ade2,脉冲场电泳,4.1 黏粒载体,4.1.1 黏粒的结构特征和用途,黏粒（cosmid）是质粒的衍生物，是带有,cos,序列的质粒。,cos,序列是,噬菌体DNA中将DNA包装到噬菌体颗粒中所需的DNA序列。,黏粒的组成包括质粒复制起点（ColE1）、抗性标记（,ampr,）、,cos,位点，能像质粒一样转化和增殖。,它的大小:,5-7kb,，用来克隆大片段DNA，克隆的最大DNA片段可达,45kb,。,4.1.2 黏粒载体的工作原理,图4-1,黏粒载体克隆DNA的一般原理和步骤,图4-4 Supercos-1克隆的原理和步骤,Supercos-1大小为7.94kb，含有在真核细胞中起作用的来自猿猴病毒,SV40的复制起点,ori,-SV40,和新霉素抗性基因（,neor,）。,4.2 酵母人工染色体载体,YAC:酵母人工染色体载体是利用酿酒酵母（,Saccharomyces cerevisiae,）的染色体的复制元件构建的载体，其工作环境也是在酿酒酵母中。,YAC:Yeast Artificial Chromosome,4.2.1 YAC载体的复制元件和标记基因,最常用的是pYAC4。,工作状态:线状的。,为了方便制备YAC载体，YAC载体以环状的方式存在，并增加了普通大肠杆菌质粒载体的复制元件和选择标记。,YAC载体必须含有元件,YAC载体为能够满足自主复制、染色体在子代细胞间的分离及保持染色体稳定的需要，必须含有以下元件：,端粒重复序列,（telomeric repeat，TEL）,，,定位于染色体末端一段序列，用于保护线状的DNA不被胞内的核酸酶降解，以形成稳定的结构。,着丝粒,（centromere，CEN）,，,有丝分裂过程中纺锤丝的结合位点，使染色体在分裂过程中能正确分配到子细胞中。在YAC中起到保证一个细胞内只有一个人工染色体的作用。如pYAC4使用的是酵母第四条染色体的着丝粒。,自主复制序列,（autonomously replication sequences，ARS）一段特殊的序列，含有酵母菌中DNA进行双向复制所必须的信号。,YAC载体的选择标记,采用营养缺陷型基因，如色氨酸、亮氨酸和组氨酸合成缺陷型基因,trp,1、,leu,2和,his,3、尿嘧啶合成缺陷型基因,ura,3等，以及赭石突变抑制基因,sup,4。,与YAC载体配套工作的,宿主酵母菌,（如AB1380）的胸腺嘧啶合成基因带有一个赭石突变,ade,2-1。带有这个突变的,酵母菌在基本培养基上形成红色菌落,，当带有赭石突变抑制基因,sup,4的载体存在于细胞中时，可抑制,ade,2-1基因的突变效应，,形成正常的白色菌落,。,利用这一菌落颜色转变的现象，可用于筛选载体中含有外源DNA片段插入的重组子。,宿主菌：赭石突变:,突变为 UAA，红色菌落,载体上：赭石突变抑制基因,sup,4,4.2.2 YAC载体的工作原理,YAC载体主要是用来构建大片段DNA文库，特别用来构建高等真核生物的基因组文库。,图4-5 酵母人工染色体载体,图4-6 pYAC4载体工作原理图,外源DNA片段的装载导致抑制基因sup4插入失活，使重组菌形成红色菌落；,载体自身连接转入到酵母细胞后形成白色菌落。,4.3 细菌人工染色体载体,细菌人工染色体是基于大肠杆菌的,F质粒,构建的高通量低拷贝的质粒载体。,F质粒是一个约100kb的质粒，编码60多种参与复制、分配和接合过程的蛋白质。,虽然F质粒通常以双链闭环DNA（1-2拷贝/细胞）的形式存在，但它可以在大肠杆菌染色体中至少30个位点处进行,随机整合,。,携带F质粒的细胞（以游离状态或以整合状态）可表达发样状的性菌毛，通过性菌毛F质粒可以转移给受体细胞。,4.3.1 BAC载体及其结构组成,约7.5kb，其本质实际上是一个质粒克隆载体。,复制单元的特殊性:来自F质粒，包括,严谨型,控制的复制区,oriS,，启动DNA复制的由ATP驱动的,解旋酶,（RepE）以及3个确保,低拷贝质粒,精确分配至子代细胞的,基因座,（,parA,、,parB,和,parC,）。,低拷贝性可以减小外源基因的表达产物对宿主细胞的毒副作用。,标记基因,:氯霉素抗性基因,图4-7 BAC载体pBeloBAC11图谱,BAC与YAC和PAC相似，没有包装限制，因此可接受的基因组DNA大小也没有固定的限制。,大多数BAC文库中克隆的平均大小约,120kb,，个别的BAC重组子中含有的基因组DNA最大可达,300kb,。,4.3.2 BAC载体工作原理,BAC文库的构建关键步骤有两步,（1）大片段DNA的制备,（2）高质量BAC载体的制备和处理。,目的细胞用琼脂糖凝胶包埋，包埋块作破细胞处理，并对其总DNA作原位限制性酶切，经脉冲场凝胶电泳分离出目的大小的酶切DNA片段。,载体与目的DNA片段连接，电转化导入大肠杆菌（常使用的是DH10B菌株）中，在氯霉素抗性和IPTG诱导平板上挑选白色菌落。,白色菌落构成了目的生物基因组的BAC文库。,4.4 P1噬菌体载体和P1人工染色体载体,4.4.1 P1噬菌体载体的分子遗传特征,P1噬菌体感染性颗粒中的噬菌体基因组为,双链线状,DNA，大小约为110 kb，两端各有约,10 kb,的末端,冗余,序列。,当噬菌体基因组进入宿主细胞后，在冗余序列之间,发生重组,，形成环状基因组。,其后噬菌体由,c,基因,调节进入溶原或裂解状态。,裂解生长和噬菌体的包装,当C阻遏物浓度不足以维持溶原状态时，噬菌体进入裂解生长状态。此时噬菌体基因组通过,裂解性复制子,进行,复制，继而转为滚环复制，产生头尾相连的基因组多联体。,该多联体可作为噬菌体颗粒包装的底物。,由于基因组的大小是,90,kb，多联体的重复间距是90 kb，而包装的大小却为,100 kb,，因此，被包装的DNA中除了基因组DNA外还有末端冗余，而且在同一个多联体中被包装的DNA片段的末端都是不一样的，在噬菌体颗粒中基因组的基因是循环排列的。,包装从多联体一端的,pac,位点开始，每100 kb被包装到噬菌体颗粒中去，,一个多联体可供包装大约4个噬菌体,。,图4-8 P1噬菌体DNA多联体的包装,P1噬菌体的溶原状态,P1噬菌体DNA在环化以后进入溶原状态，但其前噬菌体的存在与,前噬菌体的存在状态完全不同。,前噬菌体是整合到宿主的基因组中，而P1前噬菌体却是以,附加体,的形式，就像质粒一样游离于宿主的染色体之外，以单拷贝质粒的形式进行复制并分配到子细胞中去。,此时，除控制溶原状态的,c,等少数基因表达外，P1噬菌体中的绝大多数处于,沉默状态,。,4.4.2 P1噬菌体载体,与黏粒载体工作原理比较相似的一种高容量载体。,它含有很多P1噬菌体的顺式作用元件，能容纳,70-100kb,大小的基因组DNA片段。,P1噬菌体载体的组成,P1噬菌体载体与黏粒载体一样是以质粒的形式提供的,pAd10sacBII,是常用的P1噬菌体载体（,图4-9,），大小为30.3kb。,组成可分为以下几个部分：,复制元件：质粒复制子和裂解性复制子,环化和包装信号：2个loxP重组位点和包装识别位点,pac,用于,体外包装,标记基因：kan,r,;果聚糖蔗糖酶基因sacB，含sacB的大肠杆菌在蔗糖培养基上不能存活，用于插入失活筛选重组子。,克隆位点：sacB内部,填充片段：11kb腺病毒，作为填充物弥补外源DNA片段长度。,图4-9 P1噬菌体载体pAd10sacBII图谱,P1噬菌体载体的工作原理,用,Sca,将P1噬菌体载体切成线状，再用,Bam,H消化，同时基因组DNA用,Sau,3A或,Mob,部分酶切，回收,70-100 kb,的酶切片段。,将酶切片段与酶切后的载体连接，然后用P1噬菌体包装蛋白进行包装，再感染大肠杆菌。,重组DNA注射到Cre重组酶的大肠杆菌中，线状DNA分子通过重组于载体的两个,loxP,位点之间的重组而,发生环化,。,将感染的细胞置于含卡那霉素和5%,蔗糖,的培养基上筛选，只有含载体分子且sacB,基因,中插入了外源片段的细胞才能生长。,(插入失活）,图4-10 P1噬菌体载体构建DNA文库的流程图,4.4.3 P1人工染色体载体,P1人工染色体载体结合了,P1载体和BAC载体,的最佳特性，相当于P1噬菌体载体的改进载体。,PAC载体,pCYPAC1,（,图4-11,），与pAd10sacBII相比，去掉了填充片段和,pac,位点，而且,loxP,重组位点只保留一个。,用这样的载体构建基因文库时，重组分子不能通过体外包装来感染宿主细胞，而只能通过,电转化,来将重组分子导入宿主细胞。,图4-11 PAC载体pCYPAC1遗传结构图,思考题,1.大容量克隆载体有哪些种类，各有何特点？,2.什么是YAC和BAC？,3.区别：plasmid phagemid cosmid,