微生物的分类与鉴定.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,微生物分类学,（Microbial taxonomy）,按微生物的亲缘关系把它们安排成条理清楚的各种分类单元或分类群（taxon）的科学。,微生物分类学的任务,分类、鉴定、命名,。,分类：,从个别到一般，通过收集大量有关个体描述的资料，经过科学的归纳，整理成一个科学的,分类系统,。,鉴定：,从一般到个别，通过详细观察和描述一个未知名称纯种微生物的各种性状特征，然后查找现成的分类系统，以达到知类、辨名的目的。,命名：,为一个新发现的微生物按国际命名法规给以一个新的学名。,因此，分类是一项宏观的战略性工作，鉴定是一项微观的战术性工作，而命名则是一项创新的开拓性工作。,微生物分类学的发展,经典分类学,微生物系统学（Microbial Systematics）,（二）种的概念,种：最基本的分类单位,微生物的种：是一个基本分类单位，它是一大群表型特征高度相似、亲缘关系极其接近、与同属内其他种有着明显差异的菌株的总称。,因为大多数原核生物的细胞形态过于简单，在高等生物中可用于定义种的几个主要性状，在微生物中是无法使用的。因此，在微生物尤其在原核生物中，种的定义极其难定，至今还找不到一个公认的、明确的种的定义。,模式种,（type species,模式活标本,）,在微生物中，一个种只能用该种内的一个典型菌株来作具体标本，这一典型菌株就是该种的模式种。,必须是一个种的具体活标本，是该菌种的活培养物，它应保持着纯培养状态，在性状上必须与原初描述密切相符。,模式菌株可用多种方式指定，例如可由原始作者指定，如原始菌株已丧失则可再提一个新的模式等等。,新种,权威性的分类、鉴定手册中从未记载过的一种新分类并鉴定过的微生物。,当按“法规”命名并进行发表时，应在其学名后附“spnov”或“novsp”（species nova的缩写）。,在新种发表前，其模式菌株的培养物就应存放在一个永久性的菌种保藏机构中，并允许人们能从中取得。,种的分类地位举例,分别列举细菌、放线菌和真菌各一种。,常用的几种分类概念,种,：亲缘关系较近的微生物有机体的集合，它们在进化发育阶段上有一定的共同形态和生理特征。现代分类学上规定种内菌株的DNA同源性70%,变种,：从自然界分离到的微生物纯种，如果与典型种之间存在某些特征的差别，而这些特征又是稳定遗传的，则可将这一纯种称为典型种的变种。如枯草芽孢杆菌的黑色变种。,小种（亚种）,：实验室中获得的微生物变异型称为小种或亚种。,型：,自然界存在的差异较小的同种微生物的不同类型，称为型。如结核分支杆菌依其寄主的不同可分为人型、牛型和禽型。,菌株（品系）,：来源不同的同种微生物的纯培养，均可称为菌株。,群：,有些微生物的特征介于两种微生物之间，我们把这两种微生物及其中间类型统称为一个群二、微生物的学名,每一种微生物都有自己的名字，包括俗名和学名两种。,（一）俗名,普通的、通俗的、地区性的名字，具有简明和大众化的优点，但往往涵义不够确切，易于重复，使用范围局限。例如：,“结核杆菌”,Mycobacterium tuberculosis,（结核分枝杆菌）；,“绿脓杆菌”,Pseudomonas aeruginosa,（铜绿假单胞菌）；,“白色念珠菌”,Candida albicans,（白色假丝酵母）；,“金葡菌”,Staphylococcus aureus,（金黄色葡萄球菌）；,“丙丁菌”,Clostridium acetobutylicum,（丙酮丁醇梭菌）；,“红色面包霉”,Neurospora crassa,（粗糙脉孢菌）。,（二）学名,一个菌种的科学名称，用拉丁词或拉丁化的词组成。在出版物中应排成斜体字，在书写或打字时，应在学名之下划一横线，以表示它应是斜体字母。,（三）学名的表示方法,林奈的双名法通常由一个属名加一个种名加词构成。属名词首需大写，种名加词字首需小写。,出现在分类学文献中的学名，在此两者之后往往还加上首次定名人（用括号括住）、现名定名人和现名定名年份，但在一般使用时，这几个部分总是省略的。即：,例1：大肠埃希氏菌（简称大肠杆菌）,Escherichia coli,（Migula）Castellani et Chalmers 1919,例2枯草芽孢杆菌（简称枯草杆菌）,Bacillus subtilis,（Ehrenberg）Cohn 1872,例3：结核分枝杆菌,Mycobacterium tuberculosis,（Zopf）Lehmann et Newmann 1896,例4：丙酮丁醇梭菌,Clostridium acetobutylicum,McCoy，Fred，Peterson et Hastings 1926,例5：铜绿假单胞菌,Pseudomonas aeruginosa,（Schroeter）Migula 1920,例6：金黄色葡萄球菌,Staphylococcus aureus,Rosenbach 1884,2、三名法,当该种是一个亚种（subspecies，简称“subsp”，排正体字）或变种（variety，简称“var”，排正体字）时（在少数情况下），学名就应按“三名法”构成，即：,例1：苏云金芽孢杆菌蜡螟亚种,Bacillus thuringiensis,subsp,galleria,例2：椭圆酿酒酵母（或酿酒酵母椭圆变种）,Saccharomyces cerevisiae,var,ellipsoideus,例3：脆弱拟杆菌卵形亚种,Bacteroides fragilis,subsp,ovatus,（三）有关学名的其他知识,是一个表示该种微生物主要特征的名词或用作名词的形容词，单数，其第一个字母应大写。其词源可来自拉丁词、希腊词或其他拉丁化的外来词，也可以组合方式形成。例如：,由单个希腊词干组成的,Clostridium,（梭菌属）；,由两个拉丁词干组成的,Lactobacillus,（乳杆菌属）；,由拉丁和希腊词干混合组成的,Flavobacterium,（黄杆菌属）；,由拉丁化的人名组成的,Shigella,（志贺氏菌属）等。,1、属（或亚属）名,在前后有两个或数个学名排在一起，且在其属名相同的情况下，后一学名中的属名可缩写成一个、两个或三个字母，其后加一点。如：,Bacillus,（芽孢杆菌属）可写成“B”或“Bac”；,Pseudomonas,（假单胞菌属）可缩写成“P”或“Ps”；,Aspergillus,（曲霉属）可写成“A”或“Asp”等。,3、学名的发音,按规定，学名均应按拉丁字母发音规则发音。事实上，英、美等国学者经常按自己的文种来对学名发音，且影响颇大。,2、种名加词（种加词）,代表一个种的次要特征，由拉丁词、希腊词或拉丁化的外来词所组成。,字首一律小写（即使它是由某一人名衍化而来，首字母也不应大写）。,可以是一个形容词或名词。如果是形容词，其性必须与其形容的属名的性相一致，例如在,Staphylococcus aureus,（金黄色葡萄球菌）中的属名与种名均为阳性词。,在实际工作中，有时筛选到一个有用的菌种，其属名很易确定，但种名还未确定。在这种情况下，当发表论文或进行学术交流时，其种的加词暂时可以用“sp”（正体字）代替。例如：,“,Bacillus,sp”即表示一个尚未定出种名的芽孢杆菌，可译为“一种芽孢杆菌”；,“,Bacillus,spp”（spp为species复数的简写）表示一批尚未定种名的芽孢杆菌，故可译为“若干芽孢杆菌”。,第二节 微生物在生物界的地位,一、生物的界级分类学说,二、三域学说及其发展,一、生物的界级分类学说,对生物究竟分几界的问题，在人类发展历史上存在着一个由浅入深、由简至繁、由低级至高级的认识过程。,二、三域学说及其发展,三域：细菌域（真细菌域）、古生菌域（古细菌域）、真核生物域。,古生菌域的微生物都是一些极端微生物。包括：嗜热菌、嗜热嗜酸菌、嗜盐菌、嗜压菌以及产甲烷菌。,第三节 各大类微生物的分类系统纲要,一、Bergey氏原核生物分类系统纲要,二、真菌的分类系统纲要,一、Bergey氏原核生物分类系统纲要,伯杰氏系统细菌学手册（简称系统手册）,包括古细菌在内的所有细菌放在原核生物界，,细菌分类鉴定的依据。,（一）系统手册（1984）中的高级分类单元,原核生物界各门中的微生物,薄壁菌门,：指革兰氏阴性、薄壁类型的原核生物。,厚壁菌门,：指革兰氏阳性、细胞壁厚而硬型的原核,生物。,柔膜菌门,：指无细胞壁、细胞柔软的原核生物。,疵壁菌门,：指细胞壁中缺乏常规肽聚糖成分的原核,生物。,（二系统手册（2000）对原核生物的分类,将至今已记载的4 935种原核生物分为：,1、,古生菌域,，包括：2门、5组、8纲、11目、17科、63属，共208 个种。,2、,细菌域，,包括：16门、26组、27纲、62目、163科、814属，共4 727个种。,二、真菌的分类系统纲要,菌物与真菌两者之间的关系,：,地球上真菌有150万种以上，已记载的只有8万-9万种。广泛采用,Ainsworth第七版分类系统,Ainsworth分类系统第八版（1995年）,把菌物列入真核生物域的3个界中，即：,第四节 微生物分类鉴定的方法,一、微生物分类鉴定中的经典方法,微生物分类鉴定技术的四个不同水平,不同的微生物往往有自己不同的重点鉴定指标。,1、,细胞的形态和习性水平,观察细胞的形态特征、运动性、酶反应、营养要求和生长条件等。,2、,细胞组分水平,细胞组成成分例如细胞壁成分，细胞氨基酸库，脂类，醌类，光合色素等的分析。,3、,蛋白质水平,氨基酸序列分析、凝胶电泳和各种免疫标记技术。,4、,核酸水平,核酸分子杂交，G+Cmol值的测定，遗传信息的转化和转导，16S或18S rRNA寡核苷酸序列分析，重要基因序列分析和全基因组测序等。,微生物分类鉴定理论和方法的发展,经典的分类方法,在微生物分类学发展的早期，主要的分类鉴定指标尚为细胞的形态和习性，这类方法称作经典的分类鉴定方法。是相对于现代的分类鉴定方法而言的。,微生物分类鉴定的经典方法局限于利用常规的方法来鉴定微生物细胞的形态、习性和构造，主要是在第一个水平上进行的。,微生物分类鉴定理论和方法的发展：后三个水平,化学分类学,数值分类学,鉴定工作步骤：,1、获得该微生物的纯种培养物；,2、测定一系列必要的鉴定指标；,3、查找权威性的鉴定手册。,一、微生物分类鉴定中的经典方法,指长期以来在微生物常规鉴定中普遍采用的一些形态、生理、生化、生态、生活史、血清学反应等指标。,（一）经典的鉴定指标,不同微生物的不同重点鉴定指标,霉菌等形体较大的真菌以形态特征为主,放线菌和酵母菌形态和生理特征并用,细菌形态、生理、生化遗传等指标,病毒电子显微镜、生化、免疫、致病性,（二）微生物的微型、简便、快速 或自动化鉴定技术,1、API细菌数值鉴定系统,2、“Enterotube”系统,3、“Biolog”全自动和手动细菌鉴定系统,4、“XK-3401”半自动微生物鉴定仪,对各种菌群设计了15个鉴定系列，能同时测定20项以上生化指标,1、API细菌数值鉴定系统,2、“Enterotube”系统,肠道管系统，带12个分割室的一根塑料管组成，每个分割室装有不同的琼脂培养基，能检验微生物的15种生理生化反应。,3、,“Biolog”全自动和手动细菌鉴定系统,以碳源利用率为基础，用于鉴定的碳源数量达95种，可鉴定包括细菌、酵母和丝状真菌在内近2000种微生物，其中革兰氏阴性菌524种(106个属）、革兰氏阳性菌341种(55个属）、厌氧菌361种(73个属）、酵母267种(52个属）、丝状真菌619种(106个属）。还提供专门用于群落分析和生态研究的微孔板，便于用户进行更针对性的研究。如SF-N2用于革兰氏阴性产孢子和分生孢子的微生物代谢研究；SF-P2用于革兰氏阳性产孢子和分生孢子的微生物代谢研究；ECO用于微生物特性和群落分析研究；MT2用于微生物代谢研究（不含碳源）；ES用于埃希氏大肠杆菌沙门氏菌的研究（95种碳源）。,4、XK-3401半自动微生物鉴定仪,可鉴定肠杆菌、非发酵菌、葡萄球菌、链球菌、肠球菌、微球菌、李斯特菌、嗜血杆菌、奈瑟菌、弯曲菌等750多种细菌，1824h可报告结果。,二、微生物分类鉴定中的现代方法,（一）通过核酸分析鉴定微生物遗传型,（二）细胞化学成分用作鉴定指标,（三）数值分类法（统计分类法）,（一）通过核酸分析鉴定微生物遗传型,每一种微生物均有其自己特有的、稳定的DNA成分和结构，不同微生物间DNA成分和结构的差异程度代表着它们间亲缘关系的远近。因此，测定每种微生物DNA的若干重要数据，是微生物鉴定中极其重要的指标。,1DNA碱基比例的测定,DNA碱基比例指（G+C）mol值，简称“GC比”，即指鸟嘌呤（G）和胞嘧啶（C）在整个DNA中的摩尔百分比。,在不同细菌中，(G+C)mol值的变化幅度较大（3075），而脊椎动物的种间则较一致（4045）。,亲缘关系相近的种，其核苷酸的排列顺序也相近，因此其(G+C)mol值也接近。(G+C)mol值不同的两个种，它们的亲缘关系就必然较远。,一般地说，同一种微生物，其种内各菌株间的(G+C)mol值可相差2.54.0，相差过少（低于2），则没有分类学上的意义；若相差在5以上，可认为已是两个不同的种了；要是相差超过10，则可考虑它们是属于不同的属。,因此，(G+C)mol值的用途主要在于排除不确切的分类单元，而不是用它去建立一个新的分类单元。,2核酸分子杂交法,亲缘关系越近的微生物，其碱基顺序就越接近，反之亦然。一般地说，（G+C）mol值相差1，则DNA碱基序列的共同区域就约减少9；若（G+C）mol值的差异超过10，则DNA碱基序列的共同区就极少了。,若要确定它们确属同一个种，就必须通过核酸分子间的杂交。,从实验得知，各菌株DNA的同源性在,70以上,者，属于种的水平；在20以上者，则可能属于属的水平。,3rRNA寡核苷酸编目分析,通过分析原核或真核细胞中的rRNA寡核苷酸序列同源性程度，以确定不同生物间的亲缘关系和进化谱系的方法。,16SrRNA普遍存在于原核生物和真核生物细胞中，故可用以比较它们在进化上的相互联系。rRNA被称作细胞中的“活化石”。,M i c r o S e q,微生物鉴定系统,从菌落培养的制备样品中提取少量的标本，使用配套的提取DNA 试剂盒得到目的DNA，然后进行PCR 扩增反应和测序反应。测序反应的产物则在全自动的基因分析仪上完成测序，所得到的数据通过强大易用的MicroSeq,ID 软件自动分析和鉴定。软件将根据序列比对和种系发生树自动将位置鉴定样本与MicroSe q,ID 数据库进行比较，找到最匹配的细菌序列或百分比最匹配的菌株。整个鉴定过程在5 h内得到鉴定结果。采用该系统，可方便地鉴定数千种微生物，包括细菌、酵母和真菌。,4、微生物全基因组序列的测定,掌握某微生物全部遗传信息。,5、PCR技术应用,（1）,多重PCR技术(Multiplex PCR),：设计多对引物在同一个PCR反应体系中进行扩增。同时产生几个不同的特异性区域片段。,（2）,随意引物PCR(AP-PCR),：又称为随机扩增多态性分析(RAPD)，在低严格度条件下，用一种任意序列的寡核苷酸引物对细菌DNA做PCR扩增，允许引物退火时结合到基因组上的多位点处，产生一系列的扩增DNA片段，在凝胶电泳上做多态性分析。,（3）,PCR-限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP）,：通过分析微生物基因组DNA上多态性位点及新酶切位点的产生或原酶切位点的消失引起的酶切片段长度变化，比较微生物间的不同变化，从而对微生物进行分型和鉴定。,（4）,扩增片段长度多态性分析(AFLP),：通过PCR选择性地扩增整个基因组DNA的内切酶片段，在聚丙烯酰胺凝胶上电泳，产生一组特异的DNA限制性片段的指纹图。,（5）,PCR-核酸探针,：所用探针多为寡核苷酸探针。即利用待检细菌特异的基因序列，带上探针标记(如P,32,同位素等)，来识别与之互补的特异性核苷酸序列，从而对病原菌进行鉴定和分型。,（6）,定量PCR技术(Q-PCR),：利用PCR技术进行特异核酸定量分析。根据其定量所选择标准可分为外参标法和内参标法两大类。其中外参标法中主要有PCR产物的直接法和极限稀释法。内参标法中主要有同步扩增法和竞争性PCR等。目前应用于细菌测定最广泛的是数量竞争性（QC-PCR)，由于靶序列及竞争序列在同一反应中用同样的引物以相同的效率扩增，从而有效控制了不同试管间扩增效率的变异。,（二）细胞化学成分用作鉴定指标,1细胞壁的化学组分,2全细胞水解液的糖型,3磷酸类脂成分的分析,4枝菌酸的分析,5醌类的分析,6气相色谱技术用于微生物鉴定,7.质谱技术应用,1.细胞壁的化学组分,利用细胞壁组分进行细菌化学分类工作。,为用放线菌的形态特征和化学组分相结合的方法划分属提供了科学的依据。,2.全细胞水解液的糖型,现以放线菌为例，其糖型可分四类：,3.磷酸类脂成分的分析,位于细菌、放线菌的细胞膜上的磷酸类脂成分，在不同属中有所不同，故可用于鉴别放线菌属的重要指标之一。,脂肪酸甲酯(Fatty Acid Methyl Ester，FAME)谱图分析方法通过分析微生物细胞膜上磷脂脂肪酸(Phospholipid Fatty Acid，PLFA)的组分来,鉴定微生物,的种属、,分析微生物多样性,，是一种简便、可靠的分析方法。由于用于FAME谱图分析的脂肪酸多为磷脂脂肪酸，所以该方法又称为PLFA谱图分析方法。,4.枝菌酸的分析,枝菌酸存在于诺卡氏菌属、分枝杆菌属和棒杆菌属3属称作“诺卡氏菌型放线菌”中，它们在形态、结构和细胞壁上难以区分，但它们所含的枝菌酸却差别明显，分别含有80、50、30个碳原子，可对它们分属。,5.醌类的分析,在细菌和放线菌中所含有甲基萘醌（VK）和泛醌（辅酶Q）。在放线菌分类鉴定上有重要价值。,6.气相色谱技术用于微生物鉴定,气相色谱技术可分析微生物细胞组分和代谢产物中的脂肪酸和醇类等成分，对厌氧菌的鉴定十分有用。,7.质谱技术应用,应用质谱技术可以对微生物的多种成分进行分析，包括蛋白质、多肽、脂类、脂多糖和DNA分子。,质谱技术鉴定微生物的基本操作流程为：制备微生物样品、取微生物点MALDI靶或经液质联用的方式引入质谱仪、产生特征m/z峰、数据解析获得鉴定物种。,一般通过菌体内的特定化合物可以给出唯一的m/z峰作为生物标志特异地鉴定细菌。,8.微生物快速测量仪,阻抗测定仪(impedance),：微生物代谢中将培养基的电惰性底物代谢成电活性产物，从而导电性增大，电阻抗降低。不同微生物代谢活性各不相同，因而阻抗变化也不相同。用于微生物的快速鉴定，尤其是菌血症、菌尿症诊检，细菌的快速计数，药敏感性的快速测定。,放射测量仪(radiometric),：微生物生长繁殖过程中可利用培养基中加有,14,C标记的底物，代谢产生,14,CO,2,，测量,14,CO,2,的含量，确定微生物的状况。用于食物和水中微生物的快速检查，微生物代谢的研究，菌种鉴定。,微量量热计(microcalorimeter),：微生物生命活动过程中均能产生代谢热，不同的微生物或不同的底物产生可重复的特征性热“指纹图”。用于微生物的快速鉴定，临床标本的诊检，培养基最适成分的评价。,生物发光测量仪(bioluminescence),：荧光素酶与还原荧光素，在一定条件下，与微生物的ATP作用，则会产生光。光量的多少与各微生物的特性和数量有关。用于微生物数量的快速测定，环境污染生物量的测定，药敏检测。,药敏自动测定仪,：微生物悬液中所含菌量与照射光产生的光散射值成正比，可作为微生物群体对药物敏感性的特征指数。用于抗菌药物敏感性的快速测定，微生物的快速鉴定。,自动微生物检测仪(Auto Microbic System,AMS),：利用光电扫描装置测量微生物生理生化反应特性和药敏状况。根据数码分类鉴定法的原理，进行计算机处理，迅速全自动打印出检测的结果。用于快速、全自动对微生物同时或分别进行鉴定、计数和药敏试验，而且可以直接用样品检测，不用分离出微生物再用来鉴定。,（三）数值分类法（统计分类法）,是一种依据数值分析的原理、借助现代计算机技术对拟分类的微生物对象按大量表型性状的相似程度进行统计、归类的方法。,现代的数值分类学必须借助于电子计算机，因此又称电子计算机分类学。,在工作开始时，必须先准备好一批待研究菌株和有关典型菌种的菌株，它们被称作OTU（运筹分类单位，operational taxonomic units）。要用50个以上甚至几百个特征进行比较，且所用特征越多，其结果也就越精确。在比较不同菌株时，都要采用相同的可比特征，包括形态的、生理的、生化的、遗传的、生态的和免疫的特征等。,数值分类的基本步骤为：,1、计算两菌株间的相关系数,2、列出相似度矩阵,3、将矩阵图转换成树状谱,