卫生监测-食品微生物检验.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,洁净工作台（超净工作台、无菌台）,是一种供人操作的通用型局部净化设备，通过风机将空气吸入，经由静压箱通过高效过滤器过滤，将过滤后的洁净空气以垂直或水平气流的状态送出，使操作区域持续在洁净空气的控制下达到百级洁净度它可造就局部高清洁度空气环境。,生物安全柜,是为操作原代培养物、菌毒株以及诊断性标本等具有感染性的实验材料时，用来保护操作者本人、实验室环境以及实验材料，使其避免暴露于上述操作过程中可能产生的感染性气溶胶和溅出物而设计的。,高压灭菌锅,水浴锅,显微镜,普通光学显微镜,显微镜被用来放大微小物体的图像。一般应用于对生物、医药、微观粒子等观测。,分光光度计,分光光度计已经成为现代分子生物实验室常规仪器。常用于核酸，蛋白定量以及细菌生长浓度的定量,pH计,离心机,PCR仪,原理：,采用实时荧光PCR技术检测食品中是否有致病菌；,灵敏度：,对目标菌检测灵敏度为1个/g,效率：,检测过程用时2-4H,主要耗材：,各菌种试剂盒,真空泵,冰箱,纯水机,振荡器/均质机,移液器,其它仪器,食品微生物检验技术,主要内容,1.微生物检测作业规范,2.微生物检验流程,3.常见卫生指标及致病菌,4.测定微生物的大小,5.测定微生物的数量,6.菌落总数的测定,7.大肠菌群的测定,8.生产环境检测,无菌操作基本技术,用于防止,微生物,进入人体组织或其它无菌范围的操作技术称为,无菌操作。,如外科手术需防止,细菌,进入伤口及各种微生物实验中,为了防止其它微生物影响实验的进行,也要在无菌的环境下进行。,无菌操作的要求是:,1 操作前将界面上的细菌和,病毒,等微生物杀灭,2 操作过程中是界面与外界隔离,避免微生物的侵入,一、在执行无菌操作时，必须明确物品的无菌区和非无菌区。,二、执行无菌操作前，,先戴帽子、口罩、洗手，并将手擦干,，注意空气和环境清洁。,三、夹取无菌物品，必须,使用无菌持物钳,。,四、进行无菌操作时，凡未经消毒的手、臂、均不可直接接触无菌物品或超过无菌区取物。,五、在操作前2030分钟要先启动超净台和紫外灯，并认真洗手和消毒。在操作时，严禁喧哗，,严禁用手直接拿无菌物品,，如瓶塞等，而必须用消毒的钳、镊子等。,倾倒平板应在超净台内操作，并且在开启和加盖瓶塞时需反复用酒精灯烧。对于吸管应先用手拿后1/3处，并用酒精灯烧烤之后再吸液体。,无菌操作原则,1、液体样品采样方法,充分混匀后，无菌操作打开包装，用100mL无菌注射器抽取,注入无菌盛样容器.,2、半固体样品采样方法,无菌操作打开包装，用无菌勺子从几个部位挖取样品，放入无菌容器。,3、固体样品采样方法,大块整体食品用无菌刀具和镊子从不同的部位割取，并注意其代表性；,小块大包装食品应从不同部位的小块上切取样品，放入无菌容器。,若为检验食品的污染情况，可取表层样品；若为检验食品品质的情况，应从深部取样。,常见卫生指标及致病菌,细菌总数,大肠菌群,霉菌和酵母菌,大肠杆菌,（肉制品）,沙门氏菌,（禽、畜肉）,副溶血性弧菌（水产品）,金黄色葡萄球菌,（剩饭）,单增李斯特氏菌,（乳制品、冷藏食品）,肉毒梭菌,（发酵制品、肉制品）,菌落总数的测定,菌落的定义：,将细菌接种在固体培养,基上经1824小时培养，长出肉眼可见的,来源于一个细胞的,细菌集团。,菌落总数：,食品样品经过处理，在一定条件下培养后，所得1ml（g）样品中所含菌落的总数。,检测意义：,菌落总数,常作为评价食品被污染程度的一个重要指标。预测保质期。,菌落总数的检验程序,25g(ml)样品+225ml生理,盐水（0.85%）(1:10的稀释液),作几个适当倍数的稀释液,(例如1:100，1:1000),选择23个适宜稀释度,各取1ml分别加入灭菌培养皿中,平皿中加1520ml,营养琼脂,（46），,于361培养,48h,菌落记数/报告,GB 4789.2-2010,（1）以,无菌操作,，将样品25g（或,25mL,）剪碎以后，放于含有,225mL灭菌生理盐水三角瓶,内，经充分振摇做成1：10的均匀稀释液。固体样品在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以8000r/min-100000r/min的速度处理1min，做成1：10的均匀稀释液。,（2）用,1mL灭菌吸管,吸取1：10稀释液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水的试管内（,注意吸管尖端不要触及管内稀释液,，下同），振摇试管混合均匀，做成1：100的稀释液。,（3）另取1mL的灭菌吸管，按上项操作顺序作10倍递增稀释液，如此,每递增稀释一次，即换用1支1mL灭菌吸管,。,样品稀释及培养1,（4）对检样污染情况的估计，选择2-3个适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，即,以吸取该稀释度的吸管移1mL稀释液于灭菌平皿内,，每个稀释度作两个平皿。,（5）稀释液移入平皿后，应及时将凉至46,营养琼脂培养基注入平皿15mL-20mL,，并转动平皿使混合均匀，同时将营养琼脂培养基倾入加有1mL生理盐水的灭菌平皿内作,空白对照,。,（6）等琼脂凝固后，,翻转平板,，置（361）恒温箱内培养（482）h取出，计算平板内菌落数目乘以倍数，即得1g（1mL）样品所含菌落总数。,检样稀释及培养2,样品稀释程序,流程图,菌落计算方法,可用肉眼观查，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（,CFU),表示。,报 告,平板菌落数的选择,选取菌落数在30300之间,无蔓延菌落生长的平板作为菌落总数。300的记录多不可计；,每个稀释度应采用两个平板平均数,；,其中,一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用,，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平板的一半，而其余的一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘2以代表全皿菌落数；,平皿内如有菌落之间无明显界线，可视为一个菌落数；,报告,菌落总数计算方法,若只有一个稀释度菌落在适宜计数范围内，,计算平均值*稀释倍数,作为结果；若两个连续稀释度的菌落都在适宜计数范围内时按公式计算：,报告,若所有稀释度平均菌落数均,300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。,若所有稀释度的平均菌落数均,300或,30时，则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。,报告,菌落数的报告,菌落数,100内时，按四舍五入修约，以整数报告，,100时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，第三位数以四舍五入方法修约；取前两位数字，后面用0代替，也可用10的指数表示；,若平板上为蔓延菌落无法计数，则报告菌落蔓延；,若空白上长菌，则实验失败；,称重以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/ml为单位报告。,报告,2食品中大肠菌群的测定,大肠菌群的定义:,大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及,血清,学方面并非完全一致，其,定义为：,需氧及兼性厌氧、在3724 h能分解乳糖产酸、产气、需氧和兼性厌的革兰氏阴性无芽胞杆菌。,一般认为该菌群细菌可,包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。,国标法,国家标准：国家标准采用三步法，即：乳糖发酵试验、分离培养和证实试验。,乳糖发酵试验：,样品稀释后，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管乳糖胆盐发酵管。361培养242h，观察是否产气。,分离培养：,将产气发酵管培养物转种于伊红美蓝琼脂平板上，361培养18-24h，观察菌落形态。,证实试验：,挑取平板上的可疑菌落，进行革兰氏染色观察。同时接种乳糖发酵管361培养242h，观察产气情况。,报告：,根据证实为大肠杆菌阳性的管数，查MPN表，报告每100ml（g）大肠菌群的MPN值。,三、实验方法与,步骤,1、采样及稀释,以无菌操作将检样25g（或25ml）放于含有225ml灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1：10的均匀稀释液。固体检样最好用无菌均质器，以8000r/min10000r/min的速度处理1min，做成1：10的稀释液。,用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml，注入含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇混匀，做成1：100的稀释液，换用1支1ml灭菌吸管，按上述操作依次作10倍递增稀释液,根据食品卫生要求或对检验样品污染情况估计，选择三个稀释度，每个稀释度接种3管。也可直接用样品接种。,2.乳糖初发酵试验,即通常所说的假定试验。其目的在于检查样品中有无发酵乳糖产生气体的细菌。,将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1ml以上者，用双料乳糖胆盐发酵管；1ml及1ml以下者，用单料乳糖发酵管。每一个稀释度接种3管，置（361）,0,C温箱内，培养（242）h，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产生者，则按下列程续进行,3.分离培养,将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂板或麦康凯琼脂平板上，置（361）,0,C温箱内，培养18h 24h，然后取出，观察菌落形态并作革兰氏染色镜检和复发酵试验。,4.乳糖复发酵试验,即通常所说的证实试验，其目的在于证明从乳糖初酵管试验呈阳性反应的试管内分离到的革兰氏阴性无芽胞杆菌，确能发酵乳糖产生气体。,在上述的选择性培养基上，挑取可疑大肠菌群1 2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置（361）,0,C的温箱内培养（242）h，观察产气情况。,凡乳糖发酵管产气，革兰氏染色为阴性无芽胞杆菌，即报告为大肠杆菌阳性；凡乳糖发酵管不产气或革兰氏染色为阳性，则报告为大肠杆菌为阴性。,5.,报告,根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100ml（g）食品中大肠菌群的最可能数。,