(12)(13细胞生物学.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,张岸平 教授,细胞生物学,Medicai molecular biology,CELL CYCLE,第十二章,细胞分裂与细胞周期,细胞增殖是生命的基本特征，种族繁衍、个体发育、机体修复等都离不开细胞增殖。,初生婴儿有10,12,个细胞，成人10,14,个，约200种类型。,成人体内每秒钟,有数百万新细胞,产生，以补偿衰老和死亡的细胞。,一个大肠杆菌若按20分钟分裂一次，并保持这一速度，则两天即可超过地球的重量。,第一节 细 胞 分 裂,细胞分裂的类型：,无丝分裂(amitosis),又称直接分裂，由Remark（1841）发现于鸡胚血细胞，不涉及纺锤体形成及染色体变化。,有丝分裂(mitosis),又称为间接分裂，由Fleming(1882)年首次发现于动物，Strasburger(1880)发现于植物。,减数分裂(meiosis）,染色体复制一次，细胞连续分裂两次。,一、无丝分裂的过程较简单,又称（直接分裂）,直接进行细胞核与细胞质的分裂方式。分裂过程中既无染色体、纺锤体的形成，也无核膜、核仁的解体。,Two centrosomes,and their forming radial arrays of astral microtubules separating on the surface of an early prophase newt lung cell nucleus.,图片来自www.wadsworth.org/,S期中心粒,已完成复制，在前期移向两极，两对中心粒之间形成纺锤体微管，核膜解体时，中心粒已到达两极，并形成纺锤体。,中心粒,星体微管,中心体,纺锤体微管,极微管（连续丝）,横桥,染色体微管,着丝点,极微管,染色体微管,区间微管,极体微管（polar mt）、分子马达,。,着丝点微管（kinetochore mt）,；,星体微管（astral mt,植物没有中心粒和星体，其纺锤体称无星纺锤体。,（二）前中期,核膜破裂，,纺锤体的形成、,染色体向赤道面,(equatorial plane),运动。,（三）中期,高度凝聚的染色体排列到细胞的赤道面上。,有丝分裂器：,染色体、星体、中心粒和纺锤体。,图片来自www.wadsworth.org/,（四）后期,指姊妹染色体单体分开并移向两极的时期。分为后期,A,、,后期,B,两个过程。,Anaphase A:,separation of the sister chromatids.,Microtubules and Motors in the spindle,从子染色体到达两极，至形成两个新细胞核为止的时期。,大体经历了与前期相反的过程，即染色体解聚缩，核仁出现和核膜重新形成。,核纤层蛋白B,去磷酸化，介导核膜重新装配。,（五）末期子细胞核又重新组装,（六）在收缩环作用下胞质发生,（cytokinesis）,分裂,子核的形成,与,胞质分裂,是相继发生的，属于两个,分离,的过程。,如：大多数昆虫的卵，核可进行多次分裂而无胞质分裂，某些藻类的多核细胞可长达数尺，以后胞质才分裂形成单核细胞。,胞质分裂通过胞质,收缩环,的收缩实现，是由大量平行排列的,肌动蛋白,组成。,Dividing Muscle Myoblast(primative muscle cell)(SEM x8,000),有丝分裂过程,间 期,核 膜,核 仁,染色质,中心粒,前 期,中 期,后 期,末 期,赤道板,收缩环造成的分裂沟,动物细胞的有丝分裂,植物细胞末期近两极处纺锤丝消失，中间微管保留，并数量增加，形成,成膜体,。,来自高尔基体囊泡沿微管转运到,成膜体,中间。融合形成,细胞板,(cell plate),，,囊泡的内含物形成初生壁和中胶层，囊泡膜形成质膜，融合留下的管道形成,胞间连丝,。,间期,前期,中期,后期,末期,微管解聚学说：,染色体向两极运动的机理：,微管滑动学说：,植物细胞的有丝分裂,三、减数分裂（Meiosis）是一种特殊的有丝分裂,由连续两次分裂构成：,通常,减数分裂I分离的是同源染色体,，所以称为异型分裂（heterotypic division）或减数分裂（reductional division）。,减数分裂II分离的是姊妹染色体,，类似于有丝分裂，所以称为同型分裂（homotypic division）或均等分裂（equational division）。,Meiosis,Concepts:,Gametic,meiosis,Sporic,meiosis,Zygotic meiosis,间期,称前减数分裂间期或前减数分裂期(premeiosis)。,间期也可分为,G1,期、,S,期和,G2,期。,G2期是有丝分裂向减数分裂转化的关键时期。,减数分裂的S期时间较长，部分DNA（约0.3%左右）是在,合线期,合成的。,（一）第一次减数分裂过程中细胞变化复杂,1、前期I,减数分裂的特殊过程主要发生在前期I，通常分为5个时期：,细线期（leptotene），,合线期（zygotene），,粗线期（pachytene），,双线期（diplotene），,终变期（diakinesis）。,1）细线期：,染色体呈细线状，具有念珠状的染色粒。,2）合线期：,亦称,偶线期,，是同源染色体配对的时期。,概念：联会复合体(synaptonemal complex，SC）二价体（bivalent）四分体（tetrad）。,这一时期合成约0.3%左右的DNA，称为Z-DNA。,Chromosome recombination 1,3）粗线期：,同源染色体的非姊妹染色单体间发生交换的时期。,同源染色体,4双线期：,联会的同源染色体相互排斥、开始分离，交叉开始端化(terminalization)；联会复合体消失。,补充,：,植物细胞双线期一般较短，许多动物卵细胞中双线期停留的时间非常长。人的卵母细胞在五个月胎儿中已达,双线期,，而一直到排卵都停在双线期，排卵年龄大约在12-50岁之间。鱼类、两栖类、爬行类、鸟类以及无脊椎动物的昆虫中，双线期的二阶体解螺旋而形成灯刷染色体，这一时期是卵黄积累的时期。,5）终变期：,二阶体显著变短。由于交叉端化过程的进一步发展，故交叉数目减少，通常只有一至二个交叉。核仁此时开始消失，核被膜解体。,前期I(双线期),前期I(终变期),2.中期I:,两个动粒,、,单侧动粒微管、染色体排列于赤道面,3.后期I:,二价体的,两条同源染色体分开,，分别向两极移动;同源染色体随机分向两极，染色体重组，人类染色体重组概率有2,23,个。,4.末期I:,染色体去凝缩，核膜、核仁重新出现，胞质分裂，两个子细胞形成，遗传物质减半（2nn）。,5.减数分裂的间期:,两次分裂之间的短暂休整时期,（二）减数分裂II,可分为,前、中、后、末,四个四期，与有丝分裂相似。,一个精母细胞形成,4个精子,；一个卵母细胞形成,一个卵子,及2-3个极体。,Minimum,number of gamete types=2,n,In humans,n=23,Chromosome recombination 2,（二）减数分裂II,与有丝分裂过程相似。,可分为前、中、后、末四个四期，一个精母细胞形成4个精子；一个卵母细胞形成一个卵子及2-3个极体。,SC由两条同源染色体沿纵轴形成，外观呈梯子状。,SC帮助交换的完成，SC上有,重组节,(recombination nodules)，是交换发生的部位。,SC主要由,碱性蛋白质和RNA,组成，并含有少量DNA。,SC形成合线期，成熟于粗线期，消失于双线期,。,在细线期或合线期加入DNA合成抑制剂，则抑制SC的形成。,三、联会复合体SC,联会复合体（SC）,侧生成分,：电子密度较高，宽约10nm的纤维组成，,主要成分为DNA，还有RNA和组蛋白。,中央组分,：电子密度较低，主要成分为非组蛋白。,synaptonemal complex,2.减数分裂 II,前期 II,中期 II,后期 II,1.姐妹染色单体分离（二分体,单分体）,2.非姐妹染色单体随机组合。,末期 II,中期I,后期I,1.同源染色体分离（四分体,二分体）,2.非同源染色体随机组合,末期I,间期,间期,前期I,(细线期),前期I,(偶线期),前期I,(粗线期),前期I,(双线期),前期I,(终变期),中期 I,后期 I,末期 I,间期,前期 II,中期 II,后期 II,末期 II,Eucaryotic Cell Cycle,A typical mammalian cell has a cell cycle time of 24 hours,with 12 hr G,1,6-8 hr S,3-4 hr G,2,and 1 hr M,指从有丝分裂完成到期DNA复制之前的间隙时间。,指DNA复制的时期。,DNA复制完成到有丝分裂开始之前的一段时间。,第二节 细胞周期及其进程,一、定义：,。包括两个阶段，分为4个期：,细胞分裂开始到分裂结束。,从增殖的角度来看，可将高等动物的细胞分为三类：,连续分裂细胞,，如表皮生发层细胞、部分骨髓细胞。,休眠细胞,暂不分裂，但在适当的刺激下可重新进入细胞周期，称G,0,期细胞，如淋巴细胞、肝、肾细胞等。,不分裂细胞,，指不可逆地脱离细胞周期，不再分裂的细胞，又称终端细胞，如神经、肌肉、多形核细胞等。,二、细胞周期各期主要的动态变化,（一）,G1,期,(gap1),是,DNA,复制的准备期,G1,期：,-,主要合成,RNA,和蛋白质、脂类和糖类；,-,细胞迅速增长，体积显著增大；,-,触发蛋白,（不稳定蛋白、,unstable,protein,简称,U,蛋白）；,-,多种蛋白质的磷酸化（,H,1,Ser-COOH,）；,-,细胞对物质的转运作用加强,-,胆固醇合成显著增加,（二）,S,期,(synthesis phase),是,DNA,复制时期,S,期：,-,主要进行,DNA,的复制，早复制,GC,含量高的,DNA,序列，晚复制,AT,含量高的,DNA,序列，常,染色质复制在先，异染色质复制在后；,-,组蛋白的合成以及,组蛋白的持续磷酸化；,-,中心粒的复制；,（三）,G2,期,(gap2),是细胞分裂的准备期,-,G2,期：,主要合成,RNA,、,ATP,、蛋白质等。,（四）,-,M,期又称,D,期,(mitosis or division),：,核分裂和胞质分裂（前、中、后、末等时期）,细胞周期的时间长短与物种的细胞类型有关。通常,G,1,期持续时间差异较大,，M期最短约0.54.5小时。,标记有丝分裂百分率法,（percentage labeled mitoses，PLM）：对测定细胞进行,脉冲,标记、定时取材、利用,放射自显影技术,显示标记细胞，通过统计标记有丝分裂细胞百分数的办法来测定细胞周期。放射标记物为,3,H,或者,14,C,标记的,TDR,。,三、细胞周期时间的测定,M,G,2,G,1,S,M期细胞所占的%,50,100,T,G2,0,T,M,T,s,T,c,T,G2,+1/2T,M,T,PLM,标记有丝分裂百分率法,（常以（T,G2,+1/2T,M,）-T,G2,的方式求出T,M,）,细胞同步化(synchronization),是指在自然过程中发生或经人为处理造成的细胞周期同步化。,（一）自然同步化,1.多核体：如：粘菌、疟原虫。,2.某些水生动物的受精卵：如海胆、海参、两栖类。,3.增殖抑制解除后的同步分裂：如真菌的休眠孢子移入适宜环境后，它们一起发芽，同步分裂。,四、细胞同步化,1.选择同步化,1）有丝分裂选择法,：M期细胞与培养皿的附着性低，振荡脱离器壁收集。,优点：操作简单，同步化程度高，细胞不受药物伤害。,缺点：获得的细胞数量较少（分裂细胞约占1%2%）。,（二）人工同步化,2）细胞沉降分离法,：M期细胞体积大，可用离心分离。,优点：可用于任何悬浮培养的细胞。,缺点：同步化程度较低。,2.诱导同步化,1）DNA合成阻断法：,选用DNA合成的抑制剂，可逆地抑制DNA合成。常用TDR双阻断法：,在细胞处于对数生长期的培养基中加入,过量TDR,（Hela 2mol/L；CHO 7.5mol/L）。,S期细胞被抑制，停在G,1,/S交界处。,移去TDR，释放时间大于T,S,时，再次加入,过量TDR,。,优点：同步化程度高,缺点：产生非均衡生长，个别细胞体积增大。,2,）中期阻断法：,用秋水仙素等细胞分裂抑制剂将细胞阻断在中期。优点是无非均衡生长现象，缺点是可逆性较差。,第三节 细胞周期的调控,一、研究背景,1970s Rao和Johnson发现与M期细胞(Hela)融合的,间期细胞染色体发生凝缩，称为早熟凝集染色体(prematurely,condensed chromosome，,PCC,)。,甚至不同类的M期细胞也可诱导PCC产生，说明M期细胞具有促进间期细胞进行分裂的因子，即,成熟促进因子(maturation promoting factor，,MPF,),。,PCC,G1期PCC为,单线状,，因DNA未复制。,S期PCC为,粉末状,，因DNA由多个部位开始复制。,G2期PCC为,双线染色体,，说明DNA复制已完成。,1960s LelandHartwell,1970s Paul Nurse 以裂殖酵母和芽殖酵母为实验材料，利用,温度敏感突变株,，发现许多,与细胞分裂有关的基因(cell division cycle gene,CDC)。,如：,cdc2和cdc28都编码一个34KD的蛋白激酶，促进细胞周期的进行，wee1和cdc25分别表现为,抑制,和,促进,CDC2的活性。,Cdc 25&Wee1 mutant,裂殖酵母,cdc2,、芽殖酵母,cdc28,突变型在限制温度下无法分裂；,wee1,突变型则提早分裂，,cdc25,突变型细胞体积增大而不分裂；,Fission yeast,budding yeast,1980s Timothy Hunt发现,海胆的卵裂,过程中两种蛋白质的含量随细胞周期振荡，命名为,周期蛋白(cyclin A和B),。后来发现各类动物来源的,细胞周期蛋白的mRNA,均能诱导蛙卵的成熟。,1988年Lohka将非洲爪蟾的,MPF,纯化。经鉴定,MPF由32KD和45KD两种蛋白组成是一种丝氨酸/苏氨酸激酶。,进一步的研究发现,MPF=CDC2蛋白+clyclin B,Leland H.Hartwell,R.Timothy(Tim)Hunt,Sir Paul M.Nurse,2001,年,10,月,8,日美国人,LelandHartwell,、,英国人,Paul Nurse,、,TimothyHunt,因对细胞周期调控机理的研究而获诺贝尔生理医学奖。,（一）细胞周期蛋白出现于细胞周期进程中,共同特点,：在细胞周期中呈,周期性变化,。均含有一段约,100,个氨基酸的保守序列，称为,周期蛋白框,，介导周期蛋白与,CDK,结合,。,二、细胞周期蛋白cyclin,不同类型的CDK/cyclin复合体,*包括D1-3，各亚型cyclin D在不同细胞中的表达量不同，但具有相同的功效。,已知30余种。酵母中是:Cln、Clb、Cig。,在脊椎动物中为:A1-2、B1-3、C、D1-3、E1-2、F、G、H等。,分为4类：,G1型、G1/S型、S型、M型。,作用：,激活CDK，引导CDK作用于不同底物。,cell cycle regulation,在中期当MPF活性达到最高时，激活后期促进因子,APC,，将,泛素,连接在cyclinB上，cyclinB被蛋白酶体(proteasome)降解，完成一个细胞周期。,分裂期周期蛋白N端有一段序列与其降解有关，称降解盒(destruction box)。,泛素由76个氨基酸组成，高度保守。共价结合泛素的蛋白质能被蛋白酶体识别和降解，这是细胞内短寿命蛋白和一些异常蛋白降解的普遍途径,。,在中期当MPF活性达到最高时，cyclinB被蛋白酶体(proteasome)降解，完成一个细胞周期。,26S蛋白酶体,是一个大型的蛋白酶，可将泛素化的蛋白质分解成,短肽,。,Destruction Box in Cyclins,E1,SH,+,Ub,+,ATP,E1,S C,O=,Ub,AMP，PPi,E2,E1-SH,E3,+,靶蛋白,Lys-NH,2,+,E2,S C,O=,Ub,S C,O=,Ub,靶蛋白,Lys-,Ub,Ub,Ub,E3,E2,S C,O=,Ub,靶蛋白,Lys-,Ub,Ub,Ub,E3,E2,-SH,E3,+,Ub,Ub,Ub,Ub,+,26S蛋白酶体,降解的靶蛋白,泛素分子,APC（后期促进因子）,cyclosome,有八种成分组成Cdc16、Cdc23、Cdc27、,BimE；APC2、APC4、APC5和APC8。,作用：,通过泛素化途径降解,周期蛋白B/A,（二）细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）,CDC2蛋白,与,细胞周期蛋白,结合才具有激酶的活性，故名,细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase，CDK),P,322,表12-3。,在动物中已知,7种CDK,。均含有一段相似的激酶结构域，这一区域有一段保守序列，即,PSTAIRE,，与,周期蛋白的结合有关。,CDC2蛋白（CDC2）又被称为CDK1,，,CDC2蛋白,与,细胞周期蛋白,结合成,MPF,可将特定,蛋白磷酸化,，促进细胞周期运行，又称作细胞周期引擎。,如将,核纤层蛋白磷酸化,导致核纤层解体、核膜消失；,将,H1磷酸化,导致染色体的凝缩，启动期；,使降解周期蛋白的酶磷酸化，周期蛋白浓度降低。,M,期,CDK,的激活,Myt,细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子（,CKI,）,CDK inhibitor,CKI,对细胞周期起,负调控,作用，分为：,Ink4(Inhibitor of cdk 4):P16,ink4a,P15,ink4b,P18,ink4c,P19,ink4d,。,特异性抑制,cdk4cyclin D1,cdk6cyclin D1。,Kip(Kinase inhibition protein)：P21,cip1,(cyclin inhibition protein 1）P27,kip1,、P57,kip2,，抑制大多数CDK的激酶活性。P21,cip1,还能与DNA聚合酶的辅助因子PCNA（proliferating cell nuclear antigen）结合，直接抑制DNA的合成。,CDK activating,1.G1期,，,在生长因子的刺激下，,cyclin D表达，并与CDK4、CDK6结合,，使下游的蛋白质如,Rb磷酸化,，Rb释放出转录因子E2F，促进许多基因的转录，如编码,cyclinE、A,和CDK1的基因。,2.G1-S期,，,cyclinE与CDK2结合,，促进细胞进入S期。CyclinE的抗体能使细胞停滞于G1期。,3.在G2-M期,，,cyclinA、cyclinB,与CDK1结合，,CDK1,使底物蛋白磷酸化、如将组蛋白H1磷酸化导致染色体凝缩，核纤层蛋白磷酸化使核膜解体。,（三）cyclin-CDK对细胞周期运转的全面调控,G1/S调控点,M期CDK的激活起始于分裂期cyclin的积累。,结合,cyclinB,的CDK1被Wee1将Thr14和Tyr15磷酸化而不具有活性，使CDK/cyclin不断积累。,在M期，Wee1的活性下降，CDC25使CDK去磷酸化，去除了CDK活化的障碍。,CDK的激活需要Thr161的磷酸化,，它是在CDK激酶(CDK activating kinase CAK)的作用下完成的。,4.M期,cyclin,CDK复合物的作用,M,期,CDK,的激活,Myt,组成,：感受器、信号传导通路、效应器。,主要检验点：,G1/S,检验点,：,DNA,损伤检测点,，细胞外环境是否适宜？细胞体积是否足够大？在酵母中称,start,点，在哺乳动物中称,R,点,(restriction point),；,S期检验点,：,DNA,复制是否完成；,G2/M,检验点：,未复制,DNA,检测点；,M,(,中,-,后,),期检验点,：纺锤体组装检验点,(Mad2),；,M,(,末,),期检验点,：染色体分离检验点。,DNA损伤检测点,三种肿瘤抑制蛋白,ATM/ATR,Chk1/2,p53;,Chk2,使,Cdc25,磷酸化后失活,激活途径,Four checkpoints,ATM（ataxia telangiectasia-mutated gene）,最早发现于毛细血管扩张性,共济失调症,患者，人类中大约有1%的人是,ATM缺失的杂合子,，表现出对电离辐射敏感和易患癌症。,ATM编码一个,蛋白激酶,，结合在损伤的DNA上，其信号通路有两条。,激活Chk1（checkpoint kinase）,使CDC25的Ser216磷酸化失去活性，抑制M-CDK的活性，,中断细胞周期,。,激活Chk2，使P53被磷酸化而激活，然后P53作为转录因子，导致P21的表达，P21抑制G1-S期CDK的活性，,中断细胞周期。,四、多种其他因子与细胞周期调控相关,（一）生长因子通过信号传递途径影响细胞周期,单细胞,生物的增殖取决于营养，,多细胞生物,细胞的增殖与信号途径有关。,生长因子：,是与细胞增殖有关的信号物质，已知几十种，多数能促进细胞增殖，又称,有丝分裂原（mitogen），,如EGF、NGF。,作用方式：旁分泌。,如通过,ras,途径，激活,MAPK,，,MAPK,进入细胞核内，激活,c-myc,，,myc,作为转录因子,促进,cyclin,D,、,SCF,、,E2F,等,G1-S,有关的基因表达，细胞进入,G1,期。,信号通路：,ras途径，cAMP途径、磷脂酰肌醇途径,。,（二）,抑素,对细胞周期有负调节作用;,（三）,cAMP,与,cGMP,以相互拮抗的方式调节细胞分裂;,(四)RNA剪接因子（,SR蛋白,）及SR蛋白特异的,激酶（SRPK1）,是转录水平上与,细胞周期调节,相关的因子,通过,磷酸化和去磷酸化,方式发挥作用。,五、细胞周期调控的遗传基础,（一）Cdc基因,编码多种与细胞周期调控相关的蛋白激酶；,（二）癌基因,通过其多样的产物对细胞周期进行调节；,（三）,抑癌基因,从转录水平影响细胞周期；,G1期向S期转换,