fz第五章-分子生物学研究(上).ppt

单击此处编辑母版标题样式,级,*,内容提要：,重组,DNA,技术回顾,DNA,基本操作技术,RNA,基本操作技术,SNP,的理论与应用,基因克隆技术,蛋白质组与蛋白质组学技术,基因操作主要包括：,DNA,分子的切割与连接；,核酸分子杂交；,凝胶电泳；,细胞转化；,核酸序列分析以及基因人工合成；,定点突变和,PCR,扩增等。,基因工程：,指在,体外,将,核酸分子,插入病毒、质粒或其它载体分子，构成,遗传物质的新组合,，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行,持续稳定的繁殖和表达,。,基因工程技术强调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍与性状表达。,（,GMO,转基因生物）,2003美国科学家完成狗基因组全序列测定,中国科学家完成家蚕基因组全序列测定,2005,中、美、日科学家联合完成水稻基因组序列测定,美、德、日、意、以科学家完成黑猩猩基因组全序列测定,限制性核酸内切酶能够识别,DNA,上的特定碱基序列并从这个位点切开,DNA,分子。,第一个核酸内切酶,EcoRI,是,Boyer,实验室在,1972,年发现的，它能特异性识别,GAATTC,序列，将双链,DNA,分子在这个位点切开并产生具有粘性末端的小片段。,双酶切,在体外利用,限制性核酸内切酶,和,DNA,连接酶,进行,DNA,的切割和重组，还不能满足基因工程的要求，只有将它们,连接到具备自主复制能力的,DNA,分子上，才能在寄主细胞中进行繁殖。,具备,自主复制,能力的,DNA,分子就是,分子克隆的载体（,vector,）,。如：病毒、噬菌体和质粒等小分子量复制子都可以作为基因导入的载体。,获得了用外源,DNA,片段和载体分子重组而成的杂种分子后，将其重新导入到寄主细胞中，通过细菌（如：大肠杆菌）转化，选择转化子，通过筛选，获得,DNA,重组表达。,并可在宿主细胞中保持下来，也可以完整的形式从细胞中被分离纯化出来。,重组,DNA,操作过程：,重组,DNA,实验中常见的主要工具酶,5.2 DNA,操作技术,核酸的凝胶电泳,自从琼脂糖（,agarose,）和聚丙烯酰胺（,polyacrylamide,）凝胶被引入核酸研究以来，,按分子量大小分离,DNA,的凝胶电泳技术,，已经发展成为一种,分析鉴定重组,DNA,分子,及研究蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段。,琼脂糖是从琼脂中提纯到的。它由,-D-,半乳糖和,3,6-,脱水,-L-,半乳糖交替结合形成的线性多聚糖。利用琼脂糖热溶液冷却时能凝胶化的特点，采用不同浓度的琼脂糖溶液，成球后可得到不同孔径的球状凝胶，用于分离核苷酸类化合物。,凝胶电泳的基本原理：,一种分子被放置到电场中，就会以一定的速度移向适当的电极。把这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做,电泳的迁移率,。,电泳迁移率与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比，与片段大小成反比。生理条件下，核酸分子中的磷酸基团呈离子化状态，所以，,DNA,和,RNA,又被称为多聚阴离子，在电场中向正极的方向迁移。,由于糖,-,磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链,DNA,几乎具有等量的净电荷，因此都能以同样的速度向正电极方向迁移。,琼脂糖凝胶分辨,DNA,片段的范围为,0.250kb,之间。,聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围为,1,到,1000,个碱基对之间。,凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。,在凝胶电泳中，加入溴化乙锭（,ethidium bromide,，,EtBr,）染料对核酸分子进行染色，然后放置在紫外光下观察，可灵敏而快捷地检测出凝胶介质中,DNA,的谱带部位，即使每条,DNA,带中仅含有,0.05g,的微量，也可以被清晰地检测出来。,EB,（,Ethidium bromide,，溴化乙锭），分子式：,C,21,H,2,0BrN,3,，熔点：,260-262C,，是一种高度灵敏的荧光染色剂，用于观察琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中的,DNA,。,溴化乙锭用标准,302nm,紫外光透射仪激发并放射出橙红色信号，可用,Polaroid,底片或带,CCD,成像头的凝胶成像处理系统拍摄。溴化乙锭可以嵌入碱基分子中,导致错配。溴化乙锭是强诱变剂,具有高致癌性,!,EB,可以被皮肤吸收。做实验时一定要带手套。,1,严禁随便丢弃。因为,EB是强致癌性，而且易挥发，挥发至空气中，危害很大。,2,废,EB,溶液的处理方法,(1),对于,EB,含量大于,0.5mg/ml,的溶液，可如下处理：,a.,将,EB,溶液用水稀释至浓度低于,0.5mg/ml,；,b.,加入一倍体积的,0.5mol/L KMnO,4,，混匀，再加入等量的,25mol/L HCl,，混匀，置室温数小时；,c.,加入一倍体积的,2.5mol/L NaOH,，混匀并废弃。,(2)EB,含量小于,0.5mg/ml,的溶液可如下处理：,a.,按,1mg/ml,的量加入活性炭，不时轻摇混匀，室温放置,1,小时；,b.,用滤纸过滤并将活性碳与滤纸密封后丢弃。,3,废,EB,接触物，如抹布，枪头。一般回收至黑色的玻璃瓶中，定期进行焚烧处理。,分离超大片段的,DNA,5.2.2,细菌转化与目标,DNA,分子的增殖,细菌转化：一种细菌菌株由于捕获了另一种细菌菌株的,DNA,而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。,提供转化,DNA,的菌株叫作供体菌株；,接受转化,DNA,的细菌菌株称为受体菌株。,大多数细菌，正常条件下转化效率很低。,为了高效转化这些细菌，必需对受体细菌进行一些理化处理，以增加它们获取,DNA,的能力。经历了这种处理的细胞被称作感受态细胞（,competent cells,）。,细菌转化常用的方法：,CaCl,2,法和电击法,CaCl,2,法：,将快速生长中的大肠杆菌置于经,0,预处理的低渗,CaCl,2,溶液中，使细胞膨胀形成原生质球，与外源,DNA,形成粘附在细胞表面的复合物。,42,下做短暂热刺激，复合物便会被细胞所吸收。在培养基中生长一段时间使转化基因实现表达，就可涂布于选择性培养基中分离转化子。,电击法是细菌转化的另一种高效法：,由于转化载体上一般带有,LacZ,基因（大肠杆菌编码,-,半乳糖基酶），实验室常用带有不同抗生素的选择性培养基结合,-,互补蓝白斑筛选法鉴定转化细胞。,感受态细胞转化频率的计算方法为：,转化体总数,=,菌落数,（转化反应原液总体积,/,涂板菌液体积）,插入频率,=,白色菌落数,/(,白色菌落数,+,蓝色菌落数）,转化频率（每,gDNA,转化菌落数）,=,转化体总数,/,加入质粒,DNA,总量,(,g,）。,噬菌体作为克隆载体构建基因文库流程图,细菌转化及蓝白斑筛选,蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法：,含空载体的菌落为蓝斑；,含外源,DNA,的菌落为白斑；,未转化的细菌不能在抗性培养基上生长。,5.2.3,聚合酶链反应技术,聚合酶链式反应,(Polymerase Chain Reaction,，,PCR),是,1985,年问世的一种体外扩增,DNA,片段的技术。,首先将双链,DNA,分子加热分离成两条单链，,DNA,聚合酶以单链,DNA,为模板并利用反应混合物中的四种,dNTP,合成新生的,DNA互补链。,因为,DNA,聚合酶需要有一小段双链,DNA,来启动（,“,引导,”,）新链的合成，所以，新生,DNA,链的起点由一小段寡核苷酸引物在模板,DNA,链两端的退火位点所决定。,PCR,反应的全过程，即三步，可以被不断重复：,DNA,解链（变性），,引物与模板相结合（退火），,DNA,合成（链的延伸）。,经多次循环之后，反应混合物中所含有的双链,DNA,分子数，即两条引物结合位点之间的,DNA,区段的拷贝数，理论上的最高值应是,2,n,。,PCR,的主要步骤,将含有待扩增,DNA,样品的反应混合物放置在高温（,94,）环境下加热,1,分钟，使双链,DNA,变性，形成单链模板,DNA,。然后降低反应温度（约,50,），致冷,1,分钟，使寡核苷酸引物与两条单链模板,DNA,发生退火作用并结合在靶,DNA,区段两端的互补序列位置上。,最后，将反应混合物的温度上升到,72,度左右保温,1-,数分钟，在,DNA,聚合酶的作用下，从引物的,3-,端加入脱氧核苷三磷酸，并沿着模板分子按,5,3,方向延伸，合成新生,DNA,互补链。,PCR,的基本原理,变性、复性、半保留复制,PCR,三步曲,变性,90,97,退火,45,55,延伸,72,左右,PCR,指数扩增时循环次数与,DNA,产物数量的比较。,PCR,的基本原理,DNA,模板,DNA,引物,dNTP,TaqDNA,聚合酶,1,2,3,4,5,22,55,72,94,时间（,min,）,温度,（）,适温延伸,3,高温变性,1,低温退火,2,重复,1,3,步,25,30,轮,目的,DNA,片段,扩增,100,万倍以上,DNA,双螺旋,DNA,单链,与引物复性,DNA,变性,形成,2,条单链,子链延伸,DNA,加倍,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,1,2,3,4,5,22,55,72,94,时间（,min,）,温度,（）,适温延伸,3,高温变性,1,低温退火,2,重复,1,3,步,25,30,轮,目的,DNA,片段,扩增,100,万倍以上,DNA,双螺旋,DNA,单链,与引物复性,子链延伸DNA,加倍,DNA,变性,形成,2,条单链,模板,DNA,95,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,95,50,引物,1,引物,2,DNA,引物,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,50,引物,1,引物,2,DNA,引物,72,Taq,酶,Taq,酶,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,72,第,1,轮结束,95,第,2,轮开始,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,95,50,72,Taq,Taq,Taq,Taq,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,72,第,2,轮结束,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,重复,30,轮后,2,30,=1,073,741,824,模板,DNA,第,1,轮扩增,第,2,轮扩增,第,3,轮扩增,第,4,轮扩增,第,5,轮扩增,第,6,轮扩增,理想拷贝数,=2,n,n,循环次数,实际拷贝数,=(1+x),n,X,平均效率,约为,0.85,n,循环次数,PCR,引物设计,一对引物，与,3,端互补,长度：,15,30,个核苷酸,碱基分布随机,引物内、引物间不应有互补序列,引物与非特异扩增区无同源性,3,端必须互补,5,端可游离,5.2.4,实时定量,PCR,（,Real-time Quantitative PCR,）,实时定量,PCR,是,20,世纪,90,年代中期发展起来的基于,PCR,技术的利用不同的荧光检测来给核酸定量的技术。具备了传统,PCR,的优点，又克服了传统,PCR,的许多缺点。,所谓实时荧光定量,PCR,技术，是指在,PCR,反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个,PCR,进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。,在荧光定量,PCR,技术中，有一个很重要的概念,Ct,值。,Ct,值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。,实时定量,PCR,反应在带透明盖的塑料小管中进行，激发光可以直接透过管盖，使其中的荧光探针被激发。荧光探针事先混合在,PCR,反应液中，只有与,DNA,结合后，才能被激发出荧光。,例如，荧光染料,SYBR Green,，激发光波长,520nm,，这种荧光染料只能与双链,DNA,结合，并且只有在与,DNA,结合时，才能被激发产生荧光。,荧光染料,SYBR Green,探针的实时定量,PCR,利用荧光染料,SYBR Green,可以检测,PCR,反应中获得的全部双链,DNA,，但不能区分不同的双链,DNA,。为了进一步确保荧光检测确实是靶,DNA,序列，人们又设计了只能与目的,DNA,序列特异结合的荧光探针，如,TaqMan,探针。,这种探针是一小段被设计成可以与靶,DNA,序列中间部位结合的单链,DNA,（,50-150bp,）。随着,PCR,反应进行，这种探针结合到目的,DNA,序列上，并且会被具有外切酶活性的,TaqDNA,聚合酶逐个切除而降解。被切下的荧光基团会在激发光下发出荧光，荧光强度直接反映了扩增靶,DNA,的总量。,应用,TaqMan,探针实时定量,PCR,技术,5.25,基因组,DNA,文库构建,把某种生物的基因组,DNA,切成适当大小，分别与载体结合，导入微生物细胞，形成克隆。,汇集包含基因组中所有,DNA,序列的克隆（理论上每个序列至少有一份代表）。这样的克隆片段的总汇，称为基因组,DNA,文库。,定义：指将某生物的全部基因组,DNA,用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度的,DNA,片段，再与适合的载体在体外重组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳性菌落。,代表性是指文库中所有克隆所携带的,DNA,片段重新组合起来可以覆盖整个基因组，即可以从该文库中分离任何一段,DNA,。,代表性是衡量文库质量的一个很重要的指标。文库构建采用两个策略：,一是采用部分酶切或随机切割的方法来消化染色体,DNA,，以保证克隆的随机性，保证每段,DNA,在文库中出现的频率均等；,二是提高文库所含基因组,DNA,的总容量，通常用覆盖基因组的倍数来衡量。,代表性和随机性,为预测一个完整基因组文库应包含克隆的数目，,Clark,和,Carbon,于,1975,年提出如下的计算公式：,N=ln,（,1-p,）,/ln,（,1-f,）,N,：代表一个完全基因组文库所应该包含的重组克隆个数；,p,：表示所期望的目的基因在文库中出现的几率；,f,：表示重组克隆平均插入片段的大小和基因组,DNA,大小的比值；,为了获得整个基因簇或一个基因及其两翼延伸序列，实验中所制备的,DNA,随机片段一般约,20kb,或更大。,以人为例，其基因组大小为,310,9,bp,。若,p=99%,，平均插入片段大小为,20kb,，则,N=6.910,5,。,构建大片段基因组,DNA,文库使用的载体主要有：,噬菌体（,phage,）；,粘粒载体（,cosmid,）；,细菌人工染色体（,Bacterial Artificial Chromosomes,BAC,）；,酵母人工染色体,YAC,（,Yeast Artificial Chromosomes,YACs,）；,P1,源人工染色体,PAC,。,载体的选择,基因组,DNA,文库的构建流程,基因组,DNA,文库的构建程序包含,5,个部分：,载体的制备；,高纯度大分子量基因组,DNA,的提取；,高分子量,HMW DNA,的部分酶切与脉冲电泳分级分离（,PFGE size selection,）；,载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞；,重组克隆的挑取和保存。,5.3 RNA,基本操作技术,真核生物基因组,DNA,非常庞大，而且含有大量重复序列，无论用电泳分离技术还是杂交方法都难以直接分离到靶基因片段。,而,cDNA,来自反转录的,mRNA,，不含冗余序列，通过特异性的探针筛选,cDNA,文库，可以较快的分离到相关基因。,由于,RNA,分子敏感脆弱，自然状态下难以扩增，为了研究,mRNA,所包含的功能基因信息，一般将其反转录成稳定,cDNA,，再插入到可以自我复制的载体中。,逆转录过程中,cDNA,的合成,逆转录酶,核糖核酸酶,DNA,聚合酶,cDNA,：指,以生物体,的,mRNA,为模板，用逆转录酶和聚合酶在体外,反转录合成,双链,DNA,分子。,绿色：第一链,蓝色：第二链,5.3.1,总,RNA,的提取,一个典型动物细胞约含,10,-5gRNA,，特别是,rRNA,电泳后的,3,条特征条带,28S,、,18S,和,5S rRNA,是鉴定总,RNA,纯度和完整性的重要参数。,由于,mRNA,呈单链，容易受核酸酶的攻击，所以,RNA,的操作比,DNA,操作更严格。操作要保证实验环境、所用的器皿及溶液均没有,RNA,酶的污染。,总,RNA,抽提方法很多，实验室常用异硫氰酸胍,-,苯酚抽提法。,RNA,的浓度和纯度可以通过测定其,OD,260,和,OD,280,来判断。,OD,260,=1,相当于浓度为,40,g,；,OD,260,/OD,280,=1.8-2.0,，表示提取的纯度较好；,低于,1.8,，表明样品中有蛋白质或酚污染琼脂糖凝胶电泳检测,RNA,与检测,DNA,不同的是，,RNA,呈单链，易降解或形成二级结构，需在变性剂如甲醛、尿素或加热等条件下进行。,聚丙烯酰胺凝胶电泳主要用来分析小相对分子质量,RNA,。电泳后如果,rRNA,大小完整，且,28SrRNA,和,18SrRNA,亮度接近,2,：,1,，,mRNA,分布均匀，则认为,RNA,质量较好,5.3.2 mRNA,的纯化,mRNA,分子最显著的结构特征：,5-m7G,帽子，,3-poly,尾巴；实验中常用寡聚,(dT)-,纤维素柱色谱法纯化,mRNA,。,1,、利用,mRNA,含有,3-poly,尾巴，当,RNA,流经寡聚,(dT)-,纤维素柱时mRNA,被特异性的结合在柱上；,2,、然后用低盐溶液或蒸馏水洗脱,mRNA,；,Promega,公司的,polyAT Tract mRNA,分离系统：将生物素标记的寡聚,dT,与细胞总,RNA,温育，再加入微磁球相连的抗生物素蛋白以结合,polyA mRNA,通过磁场吸附作用将,polyA mRNA,从总,RNA,中分离。,PolyATtract mRNA,的分离纯化过程简图。,5.3.3 cDNA,的合成,cDNA,文库：以,mRNA,为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成,cDNA,，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后，通过受体菌转化，则每个受体菌含有一段,cDNA,，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部,mRNA,信息的,cDNA,克隆集合称为该组织细胞的,cDNA,文库。,从真核生物的组织或细胞中提取,mRNA,，通过酶促反应逆转录合成,cDNA,的第一链和第二链，将双链,cDNA,和载体连接，然后转化扩增，即可获得,cDNA,文库，构建的,cDNA,文库可用于真核生物基因的结构、表达和调控的分析；,比较,cDNA,和相应基因组,DNA,序列差异可确定内含子存在和了解转录后加工等一系列问题。,总之,cDNA,的合成和克隆已成为当今真核分子生物学的基本手段。,cDNA,的合成包括第一链和第二链,cDNA,的合成。第一链,cDNA,的合成是以,mRNA,为模板，反转录成,cDNA,。,反转录由反转录酶催化，该酶合成,DNA,时需要引物引导，常用的引物是,oligo dT,（寡核苷酸,dT,），包含,12-20,个脱氧胸腺嘧啶核苷酸，后面加一个连接引物（通常为,Xho,等酶切位点）以便于克隆构建。,cDNA,的合成包括第一链和第二链,cDNA,的合成。,cDNA,合成中的分子修饰。,在,cDNA,合成过程中，应选用活性较高的反转录酶及,甲基化,dCTP,；,cDNA,两端应加上,不同内切酶所识别的接头序列,，保证所获得双链,cDNA,的方向性。,甲基化,dCTP,是为了保证,cDNA,链被甲基化修饰，防止构建克隆时被限制性内切酶切割。,第二链,cDNA,的合成由,DNA,聚合酶催化：,常用,RNaseH,切割,mRNA-,cDNA,杂合链中的,mRNA,序列所产生的小片段为,引物,合成第二条,cDNA,片段，再通过,连接酶,连成完整的,DNA,链。,加入另一个酶切位点的,粘性接头（,EcoRI,），,与,cDNA,相连接后用,XhoI,酶切,，使,cDNA,双链两端分别具有,EcoRI,和,XhoI,粘性末端,，保证它与载体相连时有方向性,5.3.4 cDNA,文库（,cDNA Library,）的构建,真核生物基因组,DNA,十分庞大，其复杂程度是蛋白质和,mRNA,的,100,倍左右，且含有大量的重复序列。采用电泳分离和杂交的方法，都难以直接分离到目的基因。,高等生物一般具有,10,5,种左右不同的基因，但在一定时间阶段的单个细胞或个体中，仅有,15%,左右的基因得以表达，产生约,15000,种不同的,mRNA,分子。可见，由,mRNA,出发的,cDNA,克隆，其复杂程度要比直接从基因组克隆简单得多。,由于,cDNA,的长度一般在,0.5-8Kb,，常用的质粒载体和噬菌体类载体都能满足要求。,cDNA,文库载体选择一般根据文库的用途来确定。,如：常用的,Uni-zapXR,载体是一种,噬菌粒载体，具备噬菌体的高效性和质粒载体系统可利用蓝白斑筛选的便利，可容纳,0-10kbDNA,插入片段。,该载体内部含有,pBluescript,载体的全部序列，重组后可通过体内剪切反应将,cDNA,插入片段转移到质粒系统中进行筛选、克隆和序列分析。,cDNA,文库载体的选择,含有,cDNA,插入片段的重组噬菌体只有经过体外蛋白质外壳包装反应，才能成为有侵染和复制能力的成熟的噬菌体。,包装反应的实验条件要求非常精准，,DNA,和蛋白质提取物浓度、两者的体积比、反应温度及时间等对包装都有很大的影响。,重组噬菌体如何变得有侵染和复制能力？,基因文库的筛选：指通过某种特殊方法从基因文库中鉴定出含有所需重组,DNA,分子的特定克隆的过程。,1,、核酸杂交法,基因文库筛选最常用的方法，用放射性标记的特异,DNA,探针适用于高密度的菌落杂交筛选；,2,、,PCR,筛选法,操作简便。但前提必须已知足够的序列信息并获得基因特异性引物。,3,、免疫筛选法,基于抗原抗体特异性结合原理，适用于对表达文库的筛选。,5.3.5,基因文库的筛选,将一张圆形硝酸纤维素膜放在一个装有琼脂培养基的培养皿表面，将待筛选菌落从其生长的平板上转移到硝酸纤维素膜上，适当温育。同时保留原来的菌落平板做对照。,取出已经长有菌落的膜，碱液处理，使菌落发生溶解，,DNA,随之变性。接着用蛋白酶,K,处理硝酸纤维素膜去除蛋白质，留下的便是同硝酸纤维素滤膜结合的变性,DNA,。因为变性,DNA,同硝酸纤维素滤膜有很强的亲和力，便在膜上形成,DNA,的印迹。,原位杂交,(in situ hybridization),亦称菌落杂交或噬菌体杂交。,80,烘烤滤膜，将,DNA,牢固的固定在膜上。带有,DNA,印迹的滤膜可以长期保存。,用放射性同位素标记的,RNA,或,DNA,作为探针，同滤膜上的菌落所释放的变性,DNA,杂交，并用放射自显影技术进行检测。凡是含有与探针互补序列的菌落,DNA,，就会在,X,光胶片上出现曝光点。根据曝光点（黑色斑点）的位置，即显黑色斑点就是目的克隆，可以通过对应于平板上的位置找到所需要的阳性菌落，即相应克隆。,该法也可用于杂交筛选法中进行重组噬菌斑的筛选。,2,、,PCR,筛选法,例如：要从一个基因组,DNA,文库筛选目的基因。首先将基因文库分装诸如,96,孔等多孔培养板，经液体培养一段时间后，分别从各孔中吸取少量培养物，并将同一行或列孔中的培养物合并，以此混合物为模板用设计好的目的基因探针对每个孔进行,PCR,筛选，最后根据凝胶电泳的结果判定相应行或列混合孔中是否含有阳性克隆；,把每个阳性孔中的克隆再稀释到次级多孔板中进行第二轮,PCR,筛选。,重复以上程序，直到鉴定出与目的基因对应的单个克隆为止。,3,、免疫筛选法,该法适用于对表达文库的筛选。对于用表达质粒或噬菌体（如,gt11,）构建的,cDNA,文库，可以用表达产物的特异抗体（如某种蛋白质）为探针进行目的基因的筛选。,如果实验中靶基因的序列完全未知，但是有针对该基因产物的特异性抗体，就可以用免疫筛选法进行筛选。,基因文库从功能上可分为：克隆文库及表达文库。克隆文库由克隆载体构建。载体中具复制子、多克隆位点及选择标记，可通过细菌培养使克隆片段大量增殖。,表达文库是用表达载体构建。载体中除上述元件外，还具有控制基因表达的序列,(,如启动子、,SD,序列、终止子等,),，可在宿主细胞中表达出克隆片段的编码产物。如某抗原蛋白。,5.4 SNP,的理论与应用,SNP,（单核苷酸多态性）是,Single Nucleotide Polymorphisms,的缩写。,指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的一种,DNA,序列多态性。单个核苷酸的变异，包括置换、颠换、缺失和插入SNP,最大限度地代表了不同个体之间的遗传差异，因而成为研究多基因疾病、药物遗传学及人类进化的重要遗传标记。,SNP,广泛存在于人类基因组中，发生频率在,1%,或更高。,基因编码区,SNP,、基因调控区,SNP,、基因间随机非编码区,SNP,CpG,二核苷酸上的胞嘧啶残基是人类基因组中最易发生突变的位点，其中大多数是甲基化的，可自发的脱去氨基而形成胸腺嘧啶。一个人类个体大约携带,300,万,-1000,万个,SNPs,。,在人类基因组中已有,700,多万个,SNP,位点被确认。,SNP,位点并不是独立遗传的，而是在染色体上成组遗传，即一组在,DNA,上位置比较接近的,SNP,位点，在一代又一代的遗传中绝少发生重组。,这样的每组,SNP,位点所代表的序列形成一个单倍域,(haplotype block),，单倍域内全部,SNP,的类型称之为单倍型,(,单倍型也就是指一条染色体上紧密连锁的多个等位基因的线性排列,),。,单倍域很可能是遗传的最小单位，在极端情况下，它可以是一个单独的,SNP,，或者是一整条染色体。,如果单倍域一旦被确认，可以精确地检查特定的,SNP,，以特异性区分常见单倍型。这些特定的,SNP,即为标签,SNP),。,通过其中极少数的几个标签,SNP,，就可以识别出不同的单倍域。,注：,SNP,：来自不同个体,4,条同一染色体的,DNA,序列大部分相同，但有,3,个位点存在差异；单倍型：一个单倍型由邻近的一系列,SNP,位点组成,不同人群中单倍域的差异，不仅可以解释其自身独特的历史迁徙情况，也可以解释人群间某些疾病易感性的差异。,复旦大学遗传学研究所的金力、卢大儒等科研人员，在世界上首次系统地利用,Y,染色体上的单核苷酸多态位点,(,SNP,),为遗传标记，调查了东亚人群,Y,染色体,单倍型,的类型及频率分布规律，探讨了东亚人群的起源、迁徙及其相互之间的遗传关系，并取得重大突破。科研人员通过,Y,染色体上的单核苷酸多态位点,(,SNP,),分析，发现这些东亚人群中无一例外地带有非洲人的遗传基因和标志，从而为东亚人群的“非洲起源”学说提供了强有力的遗传学证据。,5.5,基因克隆技术,克隆（,clone,）的概念,个体水平：表示由具有相同基因型的同一物种的两个或数个个体组成的群体。如：单卵双生。,细胞水平：指由同一个祖细胞分裂而来的一群带有完全相同遗传物质的子细胞。,分子水平：将外源,DNA,插入具有复制能力的载体,DNA,中，使之得以永久保存和复制的过程。,5.5.1 RACE,技术（,cDNA,末端快速扩增技术）,RACE,(rapid-amplificationofcDNAends),技术是基于,PCR,技术基础上由已知的一段,cDNA,片段，通过往两端延伸扩增从而获得完整的,3,端和,5,端的方法。,它根据已知序列,设计基因片段内部特异引物,，由该片段,向外侧进行,PCR,扩增,得到目的序列。,用于扩增,5,端的方法称为,5,RACE,；,用于扩增,3,端的称为,3,RACE,。,5.6,蛋白质与蛋白质组学技术,蛋白质组学（,Proteomics,）一词，源于蛋白质（,protein,）与 基因组学（,genomics,）两个词的组合。意指“,一种基因组所表达的全套蛋白质,”，即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。,蛋白质组本质上指的,是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋白相互作用等,，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面的认识。,双向电泳,（,twodimensional electrophoresis,）,是等电聚焦电泳和,SDS-PAGE,的组合，即先进行等电聚焦电泳，然后再进行,SDS-PAGE,（按照分子大小），经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。,（一）第一向等电聚焦；（二）第二向,SDS-PAGE,电泳；,SDS:,十二烷基硫酸钠,PAGE(Polyacrylamide gel electrophoresis):,聚丙烯酰胺凝胶电泳,western,印迹法,蛋白质印迹技术是,1975,年,Southern,建立了,Southern,印迹法后，人们用类似的方法对蛋白质进行印迹分析，称为,Western,印迹法。蛋白质经单向电泳后分离后被转移到硝酸纤维滤膜上，然后用放射性或酶标记的特异抗体来检测相应抗原的存在。,蛋白质的质谱分析技术,作业：,1,、简述,PCR,的基本原理。,2,、简述实时定量,PCR,的原理和过程。,3,、蛋白质组学的研究对象和目的是什么？主要有哪些技术和方法？,4,、名词解释,克隆、,cDNA,文库、,SNP,