荧光和化学发光分析法.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,嘉兴学院,仪器分析,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,第二章 荧光和化学发光分析法,1/60,*,2/60,*,Stokes,用分光计观察到：,荧光波长比入射光波长稍微长些,五颜六色雨后路面上水珠油膜展现,3/60,*,基态分子吸收,能量,(,电能、热能、化学能或光能等,),，电子由基态,跃迁,到激发态，当电子由激发态,返回,基态时，以发射,电磁辐射,(,即光,),形式释放能量。,分子发光：,分子,+,电能,化学能,光能,生物活性参,与化学发光,电致发光,化学发光,光致发光,生物发光,荧光,磷光,4/60,*,分子发光：,光致发光：,光,5/60,*,2.1,荧光分析法,2.1.1,荧光分析法基本概念,2.1.2,荧光强度及影响原因,2.1.3,仪器装置,2.1.4,定量分析方法,2.1.5,荧光分析测定方法、特点和应用,6/60,*,A,分子激发态,分子激发态和三线激发态,激发态：,基态分子吸收能量后，价层电子跃迁到,高能级,分子轨道上称为电子激发态,。是分子,亚稳定状态,。,基态：,在正常状态下，分子处于,最低能级,分子轨道上称为基态。是分子,稳定状态,。,2.1.1,荧光分析法基本概念,2.1.1.1,荧光及其产生,7/60,*电子自旋多重度,电子从基态跃迁到激发态，分子中电子能够处于不一样自旋状态,惯用,电子自旋多重度,来描述,。,M=2S+1,S,是电子总自旋量子数，各电子自旋量子数代数和。,2.1.1.1,荧光及其产生,8/60,*,单重态（,M=1,）：,电子自旋都配正确分子电子态称为单重态，,用“,S”,表示。,三重态（,M=3,）：,分子中电子正确电子自旋平行电子态称为三重态，,用“,T”,表示。,S,2,T,2,S,1,T,1,S,0,(,洪特规则,),M=2S+1,M,自旋多重度,S,总自旋量子数,2.1.1.1,荧光及其产生,9/60,*,2025/11/17 周一,S,2,S,1,S,0,T,1吸,收,发,射,荧,光,发,射,磷,光,系间跨越,内转换,振动弛豫,能,量,l,2,l,1,l,3,外转换,l,2,T,2,内转换,振动弛豫,分子荧光和磷光发射过程,10/60,*,电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，经过,辐射跃迁,(,发光,),和,非辐射跃迁,(,热,),等方式失去能量。,传递路径,辐射跃迁,荧光,磷光,内转换,系间跨越,振动弛豫,非辐射跃迁,延迟荧光,外转换,返回速度快路径，发生几率大,!,B,分子去激发过程及荧光产生,2.1.1.1,荧光及其产生,11/60,*,e,（,1,）,.,振动弛豫：,同一电子能级,内以,热能量交换,形式由高振动能级至低相邻振动能级间跃迁发生振动时间,10,-11,10,-13,s,。,1,、非辐射跃迁,2.1.1.1,荧光及其产生,12/60,*,e,（,2,）,.,内转换,：,相同多重度,电子能级中,相等能级,间非辐射能级交换。发生内转换时间,10,-12,s,。,2.1.1.1,荧光及其产生,13/60,*,e,（,3,）,.,系间跨越,：,不一样,多重态在有重合,转动能级,间非辐射跃迁。电子自旋改变，跃迁禁阻，经过自旋,-,轨道耦合等跃迁。,2.1.1.1,荧光及其产生,14/60,*,（,4,）,.,外转换,：,激发态分子与溶剂或其它分子之间产生相互作用而损失能量回到基态非辐射跃迁。,外转换使荧光或磷光减弱或,“,猝灭,”,。,2.1.1.1,荧光及其产生,15/60,*,（,1,）,.,荧光发射：,电子由,第一激发单重态最低振动能级基态各振动能级,，,发射时间约为,10,-7,10,-9,s,。,发射荧光能量比分子吸收能量小,，,波长长,。,e,2,、辐射跃迁,2.1.1.1,荧光及其产生,16/60,*,（,2,）,.,磷光发射,：,电子由,第一激发三重态最低振动能级基态各振动能级,。发光时间：,10,-4,10s,。,e,S,0,激发态振动弛豫内转换系间跨越振动弛豫,T,1,S,0,2.1.1.1,荧光及其产生,17/60,*,1,、荧光激发光谱,固定荧光测量波长，改变激发光波长，测量不一样波长,ex,激发光照射下荧光强度改变，统计荧光强度,F,与激发光波长关系曲线。,2.1.1.2,荧光激发光谱曲线和发射光谱曲线,18/60,*,2,、,荧光发射光谱,固定激发光波长和强度，统计在不一样波长,em,下所发射荧光强度所得关系曲线即不一样波长下荧光强度分布。,发射光谱形状与激发波长无关。,2.1.1.2,荧光激发光谱曲线和发射光谱曲线,19/60,*,荧光发射光谱与吸收光谱成镜像关系,2.1.1.2,荧光激发光谱曲线和发射光谱曲线,吸收光谱形状表明了分子,第一激发单重态,振动能级；发射光谱表明分子,基态,振动能级结构。,基态与激发态二者振动能级结构,相同，激发与去激发组成相反两个过程。,S0,3,2,1,0,S,1,3,2,1,0,20/60,*,分子产生荧光必须具备条件,1.,含有适当结构：通常是含有苯环和稠环刚性结构有机分子；,2.,含有一定荧光量子产率。,2.1.1.3,荧光效率,21/60,*,=,发射,荧光分子数,激发分子,总,数,2.1.1.3,荧光效率,荧光量子产率（,）：,衡量荧光物质发光能力。,它表示激发分子发射出荧光,(,或磷光,),百分比。,22/60,*,荧光量子产率与激发态能量释放各过程速率常数相关，可用各过程速率常数来表示荧光量子产率：,荧光发射过程速率常数，取决于分子结构。,各种非辐射跃迁过程速率常数之和。取决于分子所处化学环境，同时也与化学结构相关。,2.1.1.3,荧光效率,23/60,*,荧光分子与其它分子相互作用引发荧光强度降低甚至荧光消失现象为,荧光猝灭,，又称荧光熄灭。,（,1,）、碰撞猝灭,-,动态猝灭,M*+Q M +Q +,热量,激发态分子,猝灭剂,2.1.1.4,猝灭,24/60,*,（,2,）、生成化合物猝灭,-,静态猝灭,M +Q M Q,基态荧光物质与猝灭剂反应生成非荧光化合物，造成荧光猝灭。,2.1.1.4,猝灭,（,3,）、能量转移,M*+Q M,+,Q,*,激发态分子与猝灭剂作用，能量发生转移，猝灭剂被激发。,25/60,*,（,5,）、自猝灭,荧光物质浓度较大时，激发态分子之间碰撞较多，在碰撞中引发能量损失，产生自熄，使荧光强度减小。,2.1.1.4,猝灭,（,4,）、氧猝灭,氧对溶液荧光产生猝灭作用原因比较复杂，可能包含着各种机理。,26/60,*,2.1.2,荧光强度及影响原因,2.1.2.1,荧光强度与溶液浓度关系,2.1.2.2,有机物荧光与其结构关系,2.1.2.3,金属离子螯合物荧光,2.1.2.4,试验条件对荧光强度影响,27/60,*,Epsilon,（大写,，小写,），是第五个,希腊字母,。,汉字读音：艾普西龙,朗伯,-,比尔定律,P15,28/60,*,A,跃迁类型,n,*,max,100,平均寿命,10,-5,10,-7,s,；,*,max,10,4,平均寿命,10,7,10,-8,s,*,是有机化合物产生荧光主要跃迁类型，含有,*,共轭双键分子才能发射较强荧光。,2.1.2.2,有机物荧光与其结构关系,荧光产生是分子先经历,*,或,n*,激发，然后经振动弛豫或其它非辐射跃迁再发生,*,或,*n,而得到荧光,。,29/60,*,B,共轭效应,产生荧光有机物质，都含有共轭双键体系，,共轭体系越大，荧光量子产率越高，向长波方向移动,。,化合物,量子产率,F,ex,（,nm,）,em,（,nm,）,苯,萘,蒽,丁省,205,286,365,390,2.1.2.2,有机物荧光与其结构关系,0.11,0.28,0.36,0.52,278,321,404,480,30/60,*,C,分子共平面效应,芴,=,1,联苯,=,0.2,荧光分子共平面性增加，则共轭体系大，有利于,*,跃迁。,2.1.2.2,有机物荧光与其结构关系,31/60,*,荧光黄,=,0.92,酚酞,=,0,2.1.2.2,有机物荧光与其结构关系,32/60,*,D,取代基效应,1.,给电子取代基加强荧光,-NH,2,，,-NHR,，,-NR,2,，,-OH,，,-OR,，,-CN,产生,p,共轭,2.,吸电子取代基减弱荧光,-C=O,，,-COOH,，,-NO,2,摩尔吸光系数小，荧光发射弱，系间跨跃较大，一样使荧光减弱。,2.1.2.2,有机物荧光与其结构关系,33/60,*,D,取代基效应,2.1.2.2,有机物荧光与其结构关系,A,跃迁类型,B,共轭效应,C,分子共平面效应,34/60,*,2.1.2.3,金属离子螯合物荧光,（,2,）螯合物中金属离子发光,（,1,）螯合物中配位体发光,35/60,*,2.1.2.3,金属离子螯合物荧光,（,1,）螯合物中配位体发光,不少有机化合物即使含有共轭双键，但因为不是刚性结构，分子处于非同一平面，因而不发生荧光。若这些,化合物和金属离子形成螯合物，伴随分子刚性增强，平面结构增大，常会发生荧光,。,如,8-,羟基喹啉本身有很弱荧光，但其金属螯合物含有很强荧光。,36/60,*,2.1.2.3,金属离子螯合物荧光,这类发光过程通常是螯合物首先经过,配位体,跃迁激发,，接着,配位体把能量转给金属离子,，造成,dd,跃迁和,f,f,跃迁，最终发射是,dd,跃迁和,f,f,跃迁光谱,。,（,2,）螯合物中金属离子发光,37/60,*,2,、溶剂,3,、溶液黏度和,温度,4,、溶液,PH,值,2.1.2.4,试验条件对荧光强度影响,1,、激发光源,38/60,*,2.1.2.4,试验条件对荧光强度影响,1,、激发光源,激发光强度,I,0,大，荧光强度增大，灵敏度增高。,2,、溶剂,主要表现为,溶剂极性、氢键、配位键,形成对化合物荧光发生改变。,*,跃迁类型：,溶剂极性增大,，,跃迁能量降低,，发生红移，,荧光增强,。,氢键、配位键形成主要影响荧光分子,存在型体、电离状态,，荧光强度和形状均发生很大改变。,39/60,*,3,、溶液黏度和,温度,黏度大，温度低，可减小碰撞引发荧光熄灭，荧光强度增大。,温度升高，外转换几率增加，荧光强度降低。,4,、溶液,PH,值,不一样,PH,值下，荧光分子存在形式不一样。,2.1.2.4,试验条件对荧光强度影响,40/60,*,2.1.3,仪器装置,Cary Eclipse,荧光分光光度计,荧光、磷光化学,/,生物发光,美国瓦里安技术中国有限企业,41/60,*,一、,荧光分光光度计结构流程,2.1.3,仪器装置,光源,样品池,激发,单色器,检测器,数据处理,仪器控制,发射,单色器,组成：,激发光源、样品池、双单色器、检测器、显示系统。,特殊点：,两个单色器,，光源与检测器通常成,直角,。,42/60,*,1,、,激发光源,汞灯、碘钨灯、氙弧灯、激光等。,2,、,样品池,I,0,I,t,I,f,样品池四面透光。,2.1.3,仪器装置,43/60,*,4,、,检测器,普通采取硒光电池。,检测器方向与激发光方向成直角，以消除样品池中,透射光和杂散光干扰,。,3,、,单色器,激发单色器：,选择激发光波长，,用以分离出所需用激发光。,发射单色器：,选择荧光发射波长，,用以滤去杂散光、瑞利光、拉曼光和杂质所发射荧光。,2.1.3,仪器装置,44/60,*,二、,磷光分光光度计结构流程,光源,样品池,激发,单色器,检测器,数据处理,仪器控制,发射,单色器,斩波器（磷光镜）,利用荧光和磷光发射寿命差异,通常情况下，样品池需要放在盛液氮石英杜瓦瓶内，来测定低温磷光。,45/60,*,2,、,定量方法,1,、,定量依据,2.1.4,定量分析方法,46/60,*,1,、,定量依据,荧光强度,I,f,正比于,吸收光强度,I,a,和荧光量子产率,：,由朗伯,-,比耳定律得：,荧光强度,I,f,：,2.1.4,定量分析方法,47/60,*,对于稀溶液，当,2.303,bC,0.05,时：,I,f,-,荧光强度,I,0,-,入射光强度,f,-,荧光量子产率,b-,吸收光程,-,摩尔吸光系数,C-,物质浓度,2.1.4,定量分析方法,48/60,*,2,、,定量方法,标准曲线法：,F,C,s,F,x,C,x,2.1.4,定量分析方法,49/60,*,A,无机化合物荧光分析,如,Mg,、,Al,、,Ca,等，本身不发射荧光，但与有机试剂可形成荧光配合物进行定量测定；,直接法,：如,8-,羟基喹啉与,Al,离子反应生成荧光配合物,安息香，,水杨醛缩邻氨基苯酚，黄酮醇，,二苯乙醇酮,2.1.5,荧光分析测定方法、特点和应用,50/60,*,荧光熄灭法,51/60,*,B,有机化合物荧光分析,本身发射荧光，如罗丹明,B,、荧光素等可直接测定；,不发射荧光物质可经过处理后成为发射荧光物质进行测定；,52/60,*,C,：蛋白质荧光分析,蛋白质基本结构，有氨基酸本身能够发荧光，比如：酪氨酸，色氨酸，苯丙氨酸,53/60,*,2.,荧光胺和氨基反应生成,含有荧光产物,3.,邻苯二甲醛（,OPA,）在一定,条件下可与伯胺、多胺生成,含有荧光产物,54/60,*,D,核酸检测生命物质,常选取一些荧光分子作为探针，经过探针标识分子荧光改变来研究脱氧核糖酸,(DNA),与小分子及药品作用机理，从而探讨致病原因及筛选和设计新高效低毒药品。,55/60,化合物对,DNA,安全性,电泳后,点样处,a,b,c,d,pUC19(2686bp),质粒,DNA,琼脂糖凝胶电泳，,buffer:50mM Tris-HCl/50mM NaCl,(Ph 7.4),，化合物,2.0uM,浓度下损伤测试（,37,1h,）,a:DNA,空白对照,b:,巯基乙胺,(12.0uM)+DNA,c:DNA+2.0uM,化合物,d:,巯基乙胺,+DNA+2.0uM,化合物,56/60,*,分子磷光分析法,特点,发光速率慢 寿命比荧光长,10,-4,10s,辐射波长比荧光长,磷光发光寿命和辐射强度对重原子,及其敏感（使用含碘甲烷混合溶剂）,受温度影响大，低温强度大,57/60,*,稠环芳烃和杂环化合物,含有较大致癌性,58/60,*,DDT,等,52,种农药,植物生长激素（,0.001mg/mL,）,血液和尿中阿司匹林、苯巴比妥,可卡因、致幻剂、抗凝剂,59/60,*,作业,1.,激发态分子去激发过程有哪些,?,荧光发射和磷光发射经过哪些过程,?,为何磷光发射比荧光发射慢,?,2.,为何有分子能够发射荧光,有不能,?,有机物荧光与其结构关系是怎样,?,3.,依据所学知识，写出,2,个可能发出荧光化合物，并说明为何有可能发出荧光,60/60,