免疫胶体金技术(3).ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,一.概述,(一)发展历史,1971年,Faulk,和,Taylon,用兔抗沙门氏菌抗血清与胶体金颗粒结合,制备成金标抗体,检测细菌表面抗原的分布,1975年,Horisberger,等 把胶体金技术推广应用于扫描电镜、透射电镜及冰冻蚀刻电镜的研究,1978年,Geoghegan,发表了胶体金标记物在光镜水平的应用,1981年,Danscher,建立了银显影液增强，光镜,下金颗粒可见性的方法,1983年,Moeremans,等 在蛋白质转移电泳中应用了免疫金银染色法,1986年,Fritz,等 在免疫金银法基础上成功进行了彩色免疫金银染色,免疫胶体金技术,以胶体金为标记物应用在免疫组织化学研究中，对细胞表面或细胞内的多糖、糖蛋白、蛋白质、多肽、激素和核酸等生物大分子进行定位研究,化学还原法,【基本原理】,在氯化金水溶液中加入一定量的还原剂，使金离子还原为金原子。在适当条件下，还原的金原子凝聚成一定大小的金颗粒，形成金溶胶。,【常用还原剂】,柠檬酸钠、鞣酸、白磷等,柠檬酸钠还原制备的金颗粒直径较大，,15150,nm,白磷还原制备的金颗粒直径较小，312,nm,【具体制备方法,】,（二）影响溶胶稳定性的因素,电解质,胶体金浓度,温度,大分子物质,（三）胶体金的鉴定,【鉴定方法】,在电镜下观察金颗粒的大小及金颗粒的均匀程度,【鉴定方法】,将胶体金滴在覆有,Formvar,膜或碳-,Formvar,膜的镍网上，空气干燥，透射电镜下观察，拍照，测量金颗粒的直径，并计算100个以上胶体金颗粒直径的平均值及标准差,（四）制备胶体金的注意事项,1.玻璃器皿的清洁,2.试剂配制,3.影响胶体金颗粒大小的因素,玻璃器皿清洗清洁液浸泡24,h,流水冲蒸馏水反复洗涤晾干,应尽量使用分析纯试剂,各种水溶液必须用三蒸水或去离子水配制,加入还原剂的速度,搅拌是否均匀,制备胶体金所用的烧瓶大小,三.胶体金探针的制备,(一)胶体金与蛋白质结合的原理,胶体金标记蛋白质的过程,实际上是蛋白质在等电点或稍偏碱时,被吸附于胶体金颗粒表面.,（,二）胶体金的预处理,标记之前将胶体金的,PH,值调至待标蛋白质的等电点或略偏碱,调节,PH,的方法：,当需要提高胶体金的,PH,值时，用0.2,mol/L K2CO3,或0.1,mol/L KOH,当需要降低胶体金的,PH,值时,用0.1,M HCL,或醋酸,(三)待标记蛋白质的处理,1.透析除盐:将蛋白质溶液装入透析袋中,放,在蒸馏水中透析,4过夜,2.离心:10000,r/min,4,1h,去除蛋白质聚,合物等沉淀,(四)胶体金蛋白质最佳结合率测定,不同直径的金颗粒,及不同分子量大小的蛋白质,其结合的比例是不同的,常用的检测二者结合量的方法有,目测法,和,光电比色法,1.目测法,先将待标记蛋白质逐级稀释,取一批小试管，编号，每管内加已调好,PH,的胶体金,100,ul,按从低高的浓度，将已稀释好的蛋白溶液，分别加入已编号的试管中，对照管只加不含蛋白的稀释液，混匀，静置5 10,min,各管分别加,10%,NaCl,10l，,混匀，静置2,hr，,观察结果,1,2,3,4,5,7,6,胶体金,(,ml)1 1 1 1 1 1 1,蛋白质(,ug)5 10 15 20 25 30 35,10%NaCl 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1,结果判断:对照管或加入蛋白量不足，胶体金出现由红变蓝的凝聚现象；加入蛋白质量达到或超过稳定量，则胶体金保持红色不变,2.光电比色法,利用分光光度计测各管,580,nm,的,OD,值,然后以,OD,值为纵坐标,蛋白质浓度为横坐标作一曲线,取曲线最先与横轴相接近的那一点的蛋白质浓度,即为最适稳定量.,(五）标记,1.计算所需待标记蛋白质的总量,根据用以标记的胶体金溶液总体积及所测定的最适蛋白质稳定量，计算出所需待标记蛋白质的总量,2.调节,PH：,根据所标记蛋白质的等电点来调节胶体金的,PH,常用几种蛋白质标记时胶体金的,PH,蛋白质,PH,抗体 9.0,SPA 6.0,过氧化物酶 8.0,低密度脂蛋白 5.5,3.,磁力搅拌下，逐滴加入蛋白质溶液，作用,515,min,4.,继续磁力搅拌，加入5牛血清白蛋白，使其终浓度为1，搅拌10,min；,也可加3聚乙二醇，使其终浓度为0.05,（六）标记探针的纯化,纯化的目的,去除溶液中未标记的 蛋白质，未充分稳定的胶体金，以及在标记过程中可能产生的各种聚合物,纯化的方法,超速离心法,和,凝胶过滤法,1.超速离心法,速度快，适合大样品的制备,离心,1500,r min，20min,弃沉淀,超速离心 4 1,h,弃上清,沉淀用,PBS,或,TBS,缓冲液（含0.1牛血清白蛋白重新悬浮至原体积的 1 101 20,离心,1500,r min，20min,弃沉淀,分装 4 保存,2.凝胶过滤法,将探针溶液装入透析袋内，,4，置于硅胶或聚乙二醇中浓缩至原体积的1 41 5,离心,1500,r min，20min,弃沉淀,经,Sephacryl,（,丙烯葡聚糖）,S400,层析柱分离纯化。用0.02,mol,/L TBS(0.1%BSA),洗脱,TBS,的,PH,根据蛋白质种类而定,按红色深浅分管收集洗脱液,(七)标记探针的鉴定,1.负染色检查:,将胶体金溶液滴在覆有,Formavar,膜(支持膜)的镍网上,空气中干燥,醋酸铀负染,透射电镜下观察,2.生物活性鉴定:,可用直接或间接法放射免疫测定,凝聚试验及免疫组化染色进行鉴定,四.免疫胶体金染色方法,(一)免疫金染色法,Immunogold staining,IGS,【基本原理】,1.直接法-将胶体金标记的一抗直接对标本进行染色,然后在光镜或电镜下观察,方法简单,但一种探针仅限于检测一种抗原,较局限,2.间接法-先将未标记的特异性一抗与标本中的抗原结合,然后加金标二抗或,SPA,与一抗结合,在光镜或电镜下对抗原的分布进行定位研究,【特点】,1.阳性部位显红色,2.染色程序简便,不需显色或显影过程,3.但一般要求金颗粒的直径20,nm,并要求用 高浓度的免疫金溶液,(二)免疫金银染色法,Immunogold silver staining,IGSS,1983年,Holgate,及其同事在,IGS,的基础上与银显影方法相结合,建立了免疫金银法,【基本原理】,经免疫反应沉积在抗原位点处的胶体金颗粒作为一种催化剂，在对苯二酚存在的情况下，将显影液中的银离子催化还原成银原子，可将抗原位点清楚显示出来,1.光镜免疫金银法,在免疫金染色的基础上增加物理显影的步骤,显影液的配制及显影过程应在暗处进行,阳性部位呈黑色颗粒状,2.电镜免疫金银法,包埋前染色,包埋后染色,【,IGSS,法优点,】,1.可被用于光镜和电镜观察,2.敏感性高,3.定位准确,4.背景清晰,对比度好,5.方法简便,安全,6.成本较低,标本可长期保存,(三)彩色免疫金银染色法,Coloured IGSS,CIGSS,【基本原理】,组织切片经,IGSS,染色后,抗原抗体反应部位生成的银颗粒通过铁氰化钾和溴化钾的作用,使银原子被氧化生成金属银;而彩色显影剂本身则被氧化,其氧化产物使彩色剂由无色变为有色染料,并沉积在银颗粒的部位,而银颗粒被溶解,【优点】,特异性高,彩色影象鲜明,应用范围广,五.免疫胶体金技术的特点,1.胶体金制备简便,2.标记简单,3.特异性强,4.敏感性高,5.定位准确,6.适应性广,7.易于双重和多重标记,