基因工程所需的基本条件34.ppt

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,第十二章 基因工程的基本条件,第三节、,用于基因转移的受体菌或细胞,第二节、用于,基因克隆的载体,第一节、,用于核酸操作的工具酶,第一节、,用于核酸操作的工具酶,限制性核酸内切酶,DNA,连接酶,DNA,聚合酶,核酸酶,核酸修饰酶,一、限制性核酸内切酶,1.,限制性核酸内切酶的发现及其生物功能,识别双链,DNA,分子中的特定序列，并切割,DNA,双链主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来,DNA,的入侵细菌的限制与修饰作用,hsd,R：,编码限制性核酸内切酶,hsd,M：,编码限制性甲基化酶,hsd,S：,编码限制性酶和甲基化酶的协同表达,1968年，,Smith,等人首先从,流感嗜血杆菌,d,株中分离出,Hind II,和,Hind III,一、限制性核酸内切酶,4.II,型限制性核酸内切酶的基本特性,识别双链,DNA,分子中4-8对碱基的特定序列大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构,5,G C T,G A A T T C,G A G 3,3,C G A,C T T A A G,C T C 5,EcoR I,的识别序列,EcoR I,的切割位点,EcoRI,等产生的5粘性末端,5,G-C-T-,G-A-A-T-T-C,-G-A-G 3,3,C-G-A-,C-T-T-A-A-G,-C-T-C 5,EcoRI 37,5,G-C-T-,G,-,OH,P,-A-A-T-T-C,-G-A-G 3,3,C-G-A-,C-T-T-A-A,-,P,OH,-,G,-,C-T-C 5,退火 4-7,5,G-C-T-,G,A-A-T-T-C,-G-A-G 3,3,C-G-A-,C-T-T-A-A,G,-C-T-C 5,OH,P,OH,P,PstI,等产生的3粘性末端,5,G-C-T-,C,-T-G-C-A-,G,-G-A-G 3,3,C-G-A-,G,-A-C-G-T-,C,-C-T-C 5,PstI 37,5,G-C-T-,C,-T-G-C-A,-,OH,P,-,G,-G-A-G 3,3,C-G-A-,G,-,P,OH,-,A-C-G-T-,C,-C-T-C 5,退火 4-7,5,G-C-T-,C,-T-G-C-A,G,-G-A-G 3,3,C-G-A-,G,A-C-G-T-,C,-C-T-C 5,OH,P,OH,P,PvuII,等产生的平头末端,5,G-C-T-,C-A-G-C-T-G,-G-A-G 3,3,C-G-A-,G-T-C-G-A-C,-C-T-C 5,PvuII 37,5,G-C-T-,C-A-G,-,OH,P,-,C-T-G,-G-A-G 33,C-G-A-,G-T-C-,P,OH,-,G-A-C,-C-T-C 5,一、限制性核酸内切酶,5.II,型限制性核酸内切酶酶解反应的操作,（,1,）大部分,II,型核酸内切酶需要相似的反应条件：,Tris-HCl,50 mM pH 7.5,MgCl,2,10 mM,NaCl,0-150 mM,DTT,1 mM,0-50 mM,低盐酶,100 mM,中盐酶,150 mM,高盐酶,Volume,20-100,m,l,T T,37,1-1.5,hr,1,U,核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应 1 小时，完全,水解 1,m,g,标准,DNA,所需的酶量,一、限制性核酸内切酶,5.II,型限制性核酸内切酶酶解反应的操作,（,2,）,II,型核酸内切酶的多酶联合酶解：,对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，但应注意：,5,GCTACAT,GGATCCCGGG,TTCGCAT3,3,CGATGTA,CCTAGGGCCC,AAGCGTA5,BamHI SmaI,5,GCTACAT,G,GATCCCGGG,TTCGCAT3,3,CGATGTA,CCTAG,GGCCC,AAGCGTA5,5,GCTACAT,GGATCCC,GGG,TTCGCAT3,3,CGATGTA,CCTAGGG,CCC,AAGCGTA5,一、限制性核酸内切酶,5.II,型限制性核酸内切酶酶解反应的操作,（,2,）,II,型核酸内切酶的多酶联合酶解：,对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：,使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解,低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切,一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切,0.1,倍体积的 5,M NaAc pH 5.2,2.5,倍体积的冰冷乙醇,冰浴 5 分钟、高速冷冻离心10分钟、干燥,一、限制性核酸内切酶,6.,影响限制性核酸内切酶活性的因素,（,1,）,DNA,样品的纯度：,蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、,EDTA、SDS、NaCl,等,加大酶的用量，1,m,g DNA,用 10,U,酶,加大反应总体积,延长反应时间,一、限制性核酸内切酶,6.,影响限制性核酸内切酶活性的因素,DNA,样品的甲基化程度：,大肠杆菌中的,dam,甲基化酶在5,GATC,3,序列中的腺,嘌呤,N,6,位,引入甲基，受其影响的酶有,Bcl I、MboI,等，但,BamH I、,Bgl II、Sau3A I,不受影响,大肠杆菌中的,dcm,甲基化酶在5,CCAGG3,或5,CCTGG3,序列,中的,胞嘧啶,C,5,位,上引入甲基，,受其影响的酶有,EcoR II,等,哺乳动物中的甲基化酶在5,CG3,序列中的,C,5,位,上引入甲基,一、限制性核酸内切酶,6.,影响限制性核酸内切酶活性的因素,（,3,）核酸内切酶的缓冲液性质：,高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端,pH,值等，,会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即,所谓的,Star activity,现象,EcoR I,在正常条件下识别并切割5,GAATTC3,序列，但在甘,油浓度超过5%（,v/v）,时，也可切割5,PuPuATPyPy3,或者,5,AATT3,二、,DNA,连接酶,1.DNA,连接酶的,基本性质,（,1,）修复双链,DNA,上缺口处的磷酸二酯键,DNA,连接酶,5,G-C-T,-C-T-G-C-A,G,-G-A-G 3,3,C-G-A-,G,A-C-G-T-C,-C-T-C 5,OH,P,OH,P,5,G-C-T-,C-T-G-C-A-G,-G-A-G 3,3,C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5,nick,nick,二、,DNA,连接酶,1.DNA,连接酶的,基本性质,（,2,）修复与,RNA,链结合的,DNA,链上缺口处的磷酸二酯键,T4-DNA,连接酶,5,G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G 3,3,C-G-A-,G A,-C-G-G-C-C-T-C,5,OH,P,nick,5,G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G 3,3,C-G-A-G-A-C-G-G-C-C-T-C,5,二、,DNA,连接酶,1.DNA,连接酶的,基本性质,（,3,）连接多个平头双链,DNA,分子：,5,G-C-T-C-A-G,-,C,-,T,-G,-,G,-,A,-,G,3,3,C-G-A-G-T-C,-,G,-,A,-,C,-,C,-,T,-,C,5,5,G-C-T-C-A-G,-,OH,P,-,C,-,T,-,G,-,G,-,A,-,G,3,3,C-G-A-G-T-C,-,P,OH,-,G,-,A,-,C,-,C,-,T,-,C,5,T4-DNA,连接酶,二、,DNA,连接酶,2.DNA,连接酶的,反应条件,Tris-HCl,50-100 mM pH 7.5,MgCl,2,10 mM,ATP,0.5-1 mM,DTT,5 mM,Volume,10-20,m,l,T T,4-15,4-16,hr,1,U DNA,连接酶的酶活性：在最佳反应条件下,15,反应 1 小时，,完全连接 1,m,g,l,-DNA（Hind III,片段）所需的酶量,二、,DNA,连接酶,3.,平头双链,DNA,片段的连接,操作,从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多,提高平头末端连接效率的方法包括：,加大连接酶用量（,10,倍大于粘性末端的连接）,加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会,加入,10%,PEG8000,，,促进大分子之间的有效作用,加入单价阳离子（,NaCl,），,最终浓度,150-200,mM,三、,DNA,聚合酶,1.,大肠杆菌,DNA,聚合酶,I（DNA pol I）,53的,DNA,聚合酶活性,53的核酸外切酶活性,35的核酸外切酶活性,(1),大肠杆菌,DNA,聚合酶,I,的基本性质,：,3,G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A 5,5,C-G-A-G-T-,OH,5,ppp dN,Mg,2+,3,G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A 5,5,C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-,OH,DNA pol I,三、,DNA,聚合酶,1.,大肠杆菌,DNA,聚合酶,I（DNA pol I）,缺口平移标记法,(2),大肠杆菌,DNA,聚合酶,I,的基本用途,5,G-C-T-C-AG-C-T-G-G-A-G-T 3,3,C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A,5,Mg,2+,5,dNTP,5,pp,p,d,A,（,a,-,32,P,-dATP）,5,G-C-T-C,A-G-C-T-G-G-A-G-T,3,3,C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A,5,5,G-C-T-C-,A,-G-C-T-G-G-,A,-G-T,3,3,C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A,5,Nick translation,制备,32,P,标记的探针,DNase I,DNA pol I,三、,DNA,聚合酶,2.,大肠杆菌,DNA,聚合酶,I,大片段（,Klenow）,(1)Klenow,酶的基本性质,：,大肠杆菌,DNA,聚合酶,I,经枯草杆菌蛋白酶处理，获得,N,端,三分之二的大肽段，即为,Klenow,酶,Klenow,酶仍拥有,53的,DNA,聚合酶活性和35的核,核酸外切酶活性，但失去了53的核酸外切酶活性,三、,DNA,聚合酶,2.,大肠杆菌,DNA,聚合酶,I,大片段（,Klenow）,(2)Klenow,酶的基本用途,：,a.,补平由核酸内切酶产生的5粘性末端,5,G-C-T-,G,-,OH,P,-,A-A-T-T-C-,G-A-G 3,3,C-G-A-,C-T-T-A-A,-,P,OH,-,G,-C-T-C 5,Klenow,dATP dTTP,5,G-C-T-,G,-,A-A-T-T,-,OH,P,-,A-A-T-T-C,-G-A-G 3,3,C-G-A-,C-T-T-A-A,-,P,OH-,T-T-A-A,-,G,-C-T-C 5,(2)Klenow,酶的基本用途,：,b.DNA,片段的同位素末端标记,5,G-C-T-G-,OH,P,-A-A-T-T-C-G-A-G 3,3,C-G-A-C-T-T-A-A-,P,OH,-G-C-T-C 5,Klenow,a,-,32,P-pppdA dTTP,5,G-C-T-G-,A-A-T-T,-,OH,P,-A-A-T-T-C-G-A-G 3,3,C-G-A-C-T-T-A-A-,P,OH-,T-T-A-A,-G-C-T-C 5,c.cDNA,第二链的合成,d.,双脱氧末端终止法测定,DNA,序列,三、,DNA,聚合酶,3.T4-DNA,聚合酶,（,1,）,T4-DNA,酶的基本特性：,在无,dNTP,时，可以从任何3-,OH,端外切,在只有一种,dNTP,时，外切至互补核苷酸暴露时停止,在四种,dNTP,均存在时，聚合活性占主导地位,53的,DNA,聚合酶活性和35的核酸外切酶活性,三、,DNA,聚合酶,3.T4-DNA,聚合酶,（,2,）,T4-DNA,聚合酶的用途：,a.,切平由核酸内切酶产生的3,粘性末端,5,G-C-T-C-T-G-C-A-,OH,P,-G-G-A-G 3,3,C-G-A-G-,P,HO,-A-C-G-T-C-C-T-C 5,T4-DNA,聚合酶,5,G-C-T-C-,OH,P,-G-G-A-G 3,3,C-G-A-G-,P,HO,-C-C-T-C 5,注意,：,该酶也能降解双链,DNA，,只是其活性比单链降解活性低很多,三、,DNA,聚合酶,3.T4-DNA,聚合酶,（,2,）,T4-DNA,聚合酶的基本用途：,b.DNA,片段的同位素末端标记,5,G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 3,3,C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A,5,Mg,2+,5,ppp dN,5,pp,p,dA（,a,-,32,P-dATP）,5,G-C-T-C A-G-C-T-G-,OH,HO,-T-C-G-A-C-C-T-C-A,5,T4-DNA pol,T4-DNA pol,5,G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-,A,-G-T 3,3,C-G-,A,-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A,5,三、,DNA,聚合酶,4.,依赖于,RNA,的,DNA,聚合酶（反转录酶）,（,1,）反转录酶的基本特性,：,a.,以,RNA,为模板聚合,cDNA,链,3AAAAAAAAAAAAAA,5,mRNA,反转录酶,Mg,2+,dNTP,5TTTTTTTTTTTT,oligo(dT),12-18,3AAAAAAAAAAAAAA,5,mRNA,5TTTTTTTTTTTTTT,3,cDNA,三、,DNA,聚合酶,4.,依赖于,RNA,的,DNA,聚合酶（反转录酶）,（,1,）反转录酶的基本特性：,b.,双向外切,DNA-RNA,杂合链中的,RNA,链,反转录酶,3 RNA,5,DNA,3,5,3 RNA,5,DNA,3,5,反转录酶,5,DNA,3,四、核酸酶,1.,单链核酸外切酶：核酸外切酶,VII（ExoVII）,大肠杆菌的核酸外切酶,VII,不需要,Mg,2+,ExoVII,3,5,3,5,3,5,3,5,四、核酸酶,2.,双链核酸外切酶：核酸外切酶,III（ExoIII）,ExoIII,3,5,3,5Mg,2+,3,5,3,5,大肠杆菌的核酸外切酶,III,特异性地从3 端外切,四、核酸酶,3.,双链核酸外切酶：,l,核酸外切酶,（,l,Exo）,l,Exo,3,5,3,5,Mg,2+,l,核酸外切酶特异性地从5 端外切,3,5,3,5,四、核酸酶,4.,单链核酸内切酶：,S1,核酸酶,（,1,）,S1,核酸酶的基本特性,：来自稻谷曲霉菌（,Aspergillus oryzae,）,Zn,2+,必需,最适,pH,范围为4.0-4.3,需要,NaCl 10-300 mM,降解单链,DNA,的速度比降解双链,DNA,快,75000,倍,降解单链,DNA,的速度比降解单链,RNA,快,7,倍,四、核酸酶,4.,单链核酸内切酶：,S1,核酸酶,（,2,）,S1,核酸酶的基本反应：,a.,内切单链,DNA,或,RNA,5,G-C-T-C-A-G-C-T-C-T-T-G-A-G-G-A-G-T 3,S1,Zn,2+,5,G-C-T-C-A-G-C-T-C T-T-G-A-G-G-A-G-T 3,5,G-C-T-C A-G-C-T-C T-T-G-A-G G-A-G-T 3,5,dNMPs,或 5,NMPs,四、核酸酶,4.,单链核酸内切酶：,S1,核酸酶,（,2,）,S1,核酸酶的基本反应：,b.,内切带缺口或缺刻的双链,DNA,或,RNA,5,G-C-T-C-A-,G C,-T-G-GA-G-T 3,3,C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A,5,5,G-C-T-C-A-G-,C,-T-G-G-A-G-T 3,3,C-G-A-G-T-C A-C-C-T-C-A,5,nick,gap,S1,Zn,2+,5,G-C-T-C-A-G,3,C-G-A-G-T-C,T-G-G-A-G-T 3,A-C-C-T-C-A,5,四、核酸酶,4.,单链核酸内切酶：,S1,核酸酶,（,3,）,S1,核酸酶的重要用途：,在,DNA,上定位,RNA（S1 mapping）,DNA,mRNA,杂交,S1,EcoRI,四、核酸酶,5.,单链内切双链外切的核酸酶：,Bal31,核酸酶,Bal31,核酸酶的基本特性：来自艾氏交替单胞菌（,A.espejiana,）,Ca,2+,5,dNMPs,或,5,NMPs,ssDNA or RNA,Ca,2+,Ca,2+,四、核酸酶,5.,单链内切双链外切的核酸酶：,Bal31,核酸酶,Bal31,核酸酶的基本用途：诱发,DNA,突变,EcoRI,EcoRI,EcoRI,Bal31,环化,A,B,C,B,C,A,B,C,A,A,C,五、核酸修饰酶,1.,末端脱氧核苷酰转移酶（,TdT）,TdT,的基本特性：来自小牛胸腺,不需要模板的,DNA,聚合酶，,随机掺入,dNTPs,AAAAAAAAAAAA,OH,3,5,p,3,HO,OH,3,p,5,TdT,Mg,2+,dATP,5,p,3,HO,p,5,TdT,的基本特性：,5,p,3,HO,OH 3,p,5,TdT,Co,2+,dATP,5,p,3,HO,AAAAAAAAAAA,AAAAAAAAAA,OH 3,p,5,5,p,3,HO,OH 3,p,5,TdT,Co,2+,dATP,5,p,3,HO,AAAAAAAAAAAAAA,OH 3,p,5,AAAAAAAAAAA,五、核酸修饰酶,2.,碱性磷酸单酯酶,来自小牛胸腺的碱性磷酸单酯酶（,CIP）,来自大肠杆菌的碱性磷酸单酯酶（,BAP）,5,p,OH,3,DNA or RNA,5,ppp dN,5,pppN,BAP/CIP,OH,35,HO,5,HO,dN,5,HO,N,五、核酸修饰酶,3.T4-,多核苷酸磷酸激酶（,T4-PNP）,T4-PNP,的基本特性：在,DNA、RNA、dNR、NR,的5-,OH,上加磷,5,HO,3,HO,OH,3,OH,5,T4-PNP,Mg,2+,p,ppATP（,g,-,32,P-ATP）,5,p,3,HO,OH,3,p,5,用于探针的末端同位素标记：,第二节、,用于基因克隆的载体,第二章 基因工程的基本条件,二、质粒（,plasmid）,三、噬菌体或病毒,DNA,四、考斯质粒（,cosmid）,与噬菌粒,五、人造染色体载体,一、载体的功能及特征,一、载体的功能及特征,（一）载体的功能1.,运送外源基因高效转入受体细胞,2.,为外源基因提供复制能力或整合能力,3.,为外源基因的扩增或表达提供必要的条件,一、载体的功能及特征,（二）载体应具备的条件,1.,具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）,5.,具有合适的筛选标记,3.,具有较,高的外源,DNA,的载装能力,4.,具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点,2.,具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点,二、质粒,（一）质粒的基本特征,质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而,自主复制,、,并被稳定遗传的一类核酸分子,质粒常见于原核细菌和真菌中,绝大多数的质粒是,DNA,型的,绝大多数的天然,DNA,质粒具有,共价、封闭、环状,的分子结构，,即,cccDNA,质粒,DNA,的分子量范围：1-300,kb,二、质粒,（一）质粒的基本特征,1.,质粒的自主复制性,质粒能利用寄主细胞的,DNA,复制系统进行自主复制,质粒,DNA,上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系,根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为,两大复制类型：,严紧型复制控制的质粒 1-3 拷贝,stringent plasmid,松弛型复制控制的质粒 10-60 拷贝,stringent plasmid,二、质粒,（一）质粒的基本特征,1.,质粒的自主复制性：,拷贝数的控制机制 质粒,DNA,复制启动控制,控制复制引物与模板的结合,ori,E.coli,ColE1,plasmid,复制方向,rop,（+）,Rop,RNA II,RNA I,3,5,5,3,二、质粒,（一）质粒的基本特征,1.,质粒的自主复制性：,拷贝数的控制机制 质粒,DNA,复制启动控制,控制复制起始因子与复制起始位点（,ori,）,的结合,Pcop,cop,P/Orep,rep,ori,Cop,Rep,二、质粒,（一）质粒的基本特征,2.,质粒的不相容性,任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于,一个细胞中，这种现象称为,质粒的不相容性,，不相容性的质,以大肠杆菌的质粒为例：,ColE1、pMB1,拥有相似的复制子结构，彼此不相容,pSC101、F、RP4,拥有相似的复制子结构，彼此不相容,p15A,及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容,粒组成不相容性群,二、质粒,（一）质粒的基本特征,2.,质粒的不相容性：分子机制,两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种,拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，,两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的,拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，,因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一,细胞内,其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势,二、质粒,（一）质粒的基本特征,3.,质粒的可转移性,革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类：,接合型质粒,能在天然条件下自发地从一个细胞转移到,另一个细胞（接合作用），如,F、Col、R,质粒等,如,Col、R,的其它成员,非接合型质粒,不能在天然条件下独立地发生接合作用,值得注意的是，某些非接合型质粒（,ColE1）,在接合型质粒,的存在和协助下，也能发生,DNA,转移，这个过程由,bom,和,mob,基因决定,二、质粒,（一）质粒的基本特征,4.,携带特殊的遗传标记,野生型的质粒,DNA,上往往携带一个或多个遗传标记基因，这,使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：,物质抗性,抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物,物质合成,抗生素、细菌毒素、有机碱,这些标记基因对,DNA,重组分子的筛选具有重要意义,二、质粒,（二）质粒的构建,天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。,目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型质粒构建的：,pSC101,8.8 kb,拷贝数 5 四环素抗性标记基因,Tc,r,ColE1,6.5 kb,拷贝数 20-30 大肠杆菌内毒素标记基因,E1,RSF2124,ColE1,衍生质粒 氨苄青霉素抗性标记基因,Ap,r,二、质粒,（三）质粒的分类,人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类：,高拷贝质粒,突变拷贝数控制基因 拷贝数1000-3000 扩增基因,低拷贝质粒,来自,pSC101,拷贝数小于10,表达某些毒性基因,温敏质粒,在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质,测序质粒,含有测序通用引物互补序列和多酶接头,polylinker,整合质粒,装有整合促进基因及位点 便于外源基因的整合,穿梭质粒,装有针对两种不同受体的复制子 便于基因克隆,表达质粒,装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件,探针质粒,装有报告基因 便于启动子等元件的克隆筛选,二、质粒,（四）重要的大肠杆菌质粒载体,松弛型复制,pBR322：,氯霉素可扩增,拷贝数 50-100/,cell,用于基因克隆,pBR322,4363 bp,Origin of Replication,ROP,ROI,Sal I,BamH I,Tc,r,Pvu I,Pst I,Pst I,EcoR I,Cla I,Hind III,Hind II,Bal I,Ap,r,二、质粒,（四）重要的大肠杆菌质粒载体,pUC18,/19：,拷贝数 2000-3000/,cell,用于基因克隆和测序,装有多克隆位点（,MCS）,正选择颜色标记,lacZ,二、质粒,（四）重要的大肠杆菌质粒载体,pUC18,/19：,正选择标记,lacZ,的显色原理,pUC18,/19,Plac,lacZ,MCS,b,-,半乳糖苷酶的,a,-,肽段,a,b,5-,溴-4-氯-3-吲哚基-,b,-D-,半乳糖苷,X-gal,二、质粒,（四）重要的大肠杆菌质粒载体,pGEM-3Z,：,多拷贝,装有两个噬菌体的强启动子,装有多克隆位点（,MCS）,正选择颜色标记,lacZ,用于外源基因的高效表达,注意：,T7,和,SP6,启动子特异性地由噬菌体,DNA,编码的,RNA,聚合,2743 bp,MCS,lacZ,P,T7,ori,Ap,r,pGEM-3E,P,SP6,酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体,RNA,聚合酶，如：,E.coli,BL21（DE3）,等,二、质粒,（五）质粒,DNA,的分离纯化,实验室一般使用下列三种方法制备质粒,DNA：,氯化铯密度梯度离心法,质粒,DNA,纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染,碱溶法,质粒,DNA,纯度底、快速、操作简便,沸水浴法,质粒,DNA,纯度、操作周期介于氯化铯法和碱溶法之间,二、质粒,（五）质粒,DNA,的分离纯化,氯化铯密度梯度离心法,：,用含有,EDTA,的缓冲液悬浮菌体,加溶菌酶裂解细菌细胞壁,加,CsCl,和溴乙锭,超速离心过夜,在紫外灯下吸取,cccDNA,稀释沉淀,cccDNA,proteins,ocDNA,L-DNA,cccDNA,RNAs,cccDNA,L-DNA,ocDNA,D-DNA,T-DNA,二、质粒,（五）质粒,DNA,的分离纯化,碱溶法：,用含有,EDTA,的缓冲液悬浮菌体,加溶菌酶裂解细菌细胞壁,加,NaOH,和,SDS,的混合溶液，去膜释放内含物,加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除染色体,DNA,及大部分蛋白质,离心取上清液，用苯酚-氯仿萃取，去除痕量的蛋白质,乙醇或异丙醇沉淀水相质粒,DNA,用无,DNase,的,RNase,去除残余的,RNA,二、质粒,（五）质粒,DNA,的分离纯化,沸水浴法：,用含有,EDTA,和,Triton X-100,的缓冲液悬浮菌体,加溶菌酶裂解细菌细胞壁,沸水浴40秒钟,离心，用无菌牙签挑去沉淀物,乙醇或异丙醇沉淀质粒,DNA,三、噬菌体或病毒,DNA,噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染,宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏,起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。,噬菌体或病毒的上述特性使得它们的,DNA,能被开发成为基因工,程的有用载体，因为：,高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞,自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增,三、噬菌体或病毒,DNA,（一）大肠杆菌的,l,噬菌体,DNA,1.l,噬菌体的生物学特性：,a,生物结构,l,噬菌体是,大肠杆菌的温和型噬菌体,l,噬菌体,由外壳包装蛋白和,l,-DNA,组成,l,-DNA,全长,48502,个核苷酸,l,-DNA,上,至少有61个基因,1.l,噬菌体生物学特性：,生物结构,5 TCCAGCGGCGGGG,3,3,CCCGCCGCTGGA 5,COS,COS,cos,头部合成基因,尾部合成基因,溶菌控制基因,晚期控制基因,DNA,合成控制,基因,阻遏基因,早期控制基因,阻遏基因,重组基因,删除与整合基因,l,-DNA,三、噬菌体或病毒,DNA,（一）大肠杆菌的,l,噬菌体,DNA,1.l,噬菌体生物学特性：,b,感染周期,E.coli,吸附,LamB,受体,注入,复制,包装,裂解,三、噬菌体或病毒,DNA,（一）大肠杆菌的,l,噬菌体,DNA,1.l,噬菌体生物学特性：,b,感染周期,体内包装,100个左右的拷贝,包装范围为原,DNA,的,75-105%,即,36-51,kb,D,A,三、噬菌体或病毒,DNA,（一）大肠杆菌的,l,噬菌体,DNA,1.l,噬菌体生物学特性：,c,溶原状态,l,噬菌体感染大肠杆菌后，除能裂解细胞外，也可能将其,DNA,直接整合到宿主细胞的染色体,DNA,上，并不产生子代噬菌体颗粒，这种情况为,溶原状态,。整合主要由,l,-DNA,上的,cI,和,int,两基因的产物所激活，而这两个基因的开放与关闭又取决于宿主细胞本身的性质。人们可以根据需要改变,l,-DNA,或宿主细胞的性质，使噬菌体或处于,溶原状态,，或处于,溶菌状态,DNA,重组技术一般需要,l,噬菌体进入溶菌状态,三、噬菌体或病毒,DNA,（一）大肠杆菌的,l,噬菌体DNA,2.l,-DNA,载体的构建：,a,缩短长度,野生型,l,-DNA,包装的上限为,51,kb,，,本身长度为,48.5,kb,，,只有当插入的外源,DNA,片段不大于,2.5,kb,时,，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。因此缩短野生型,l,-DNA,的长度，可以提高装载量。其实野生型,l,-DNA,上约有,40-50%,的片段是复制和裂解所非必需的。根据切除的多少，可将,l,-DNA,分成两大类载体：,插入型载体,取代型载体,三、噬菌体或病毒,DNA,（一）大肠杆菌的,l,噬菌体,DNA,2.l,-DNA,载体的构建：,缩短长度,插入型载体,体外包装,插入位点,体外包装,插入片段,载体长度,37,kb,插入片段大小：,0-14,kb,（51 37）,三、噬菌体或病毒,DNA,（一）大肠杆菌的,l,噬菌体,DNA,2.l,-DNA,载体的构建：,缩短长度,取代型载体,体外包装,体外包装,插入片段,最小装载长度,10,kb,（51 26）,载体长度,26,kb,插入片段,最大装载长度,25,kb,（36 26）,三、噬菌体或病毒,DNA,（一）大肠杆菌的,l,噬菌体,DNA,2.l,-DNA,载体的构建：,b,删除重复的酶切位点,野生型的,l,-DNA,链上有5个,EcoRI,位点和7个,HindIII,位点，不,利于重组操作，必须删除至1-2个,同时，为了便于各种来源的,DNA,片段的克隆，还需要增加一,些单一的酶切位点,除了简单的切割外，还需要采用定点突变技术去除或增添酶,位点,三、噬菌体或病毒,DNA,（一）大肠杆菌的,l,噬菌体,DNA,2.l,-DNA,载体的构建：,c,加装选择标记,与质粒不同，野生型,l,-DNA,上缺少合适的选择标记，因此,加装,选择标记是,l,-DNA,克隆载体构建的重要内容,l,-DNA,克隆载体上的选择标记主要有下列两类：,免疫功能类标记,颜色反应类标记,三、噬菌体或病毒,DNA,（一）大肠杆菌的,l,噬菌体,DNA,2.l,-DNA,载体的构建：,c,加装选择标记,imm434,imm434,基因编码一种阻止,l,-,噬菌体,进入溶菌循环的阻遏物。含有完整标记,基因的,l,-,载体进入受体细胞后，建立溶,原状态，细菌生长缓慢，形成浑浊斑；,当外源,DNA,插入到标记基因中，基因灭,活，,l,-,重组分子便进入溶菌循环，形成,透明斑,三、噬菌体或病毒,DNA,2.l,-DNA,载体的构建：,c,加装选择标记,lacZ,lacZ,基因编码,b,-,半乳糖苷酶，能催化,无色的,X-gal,生成蓝色化合物。当外源基,因插入到,lacZ,基因中，基因灭活，不能,合成蓝色化合物；而空载体,l,-DNA,则产,生蓝色透明斑,（一）大肠杆菌的,l,噬菌体,DNA,三、噬菌体或病毒,DNA,2.l,-DNA,载体的构建：,d,构建琥珀密码子的突变体,琥珀型突变（,sup,),是指由,CAG,（,Gln,）,向,UAG,（,stop,）,的突变。大肠杆菌的某些菌株含有特异性的校正基因，其编码产物校正,tRNA,能专一性地纠正这一突变。,将野生型,l,-DNA,上,D,和,E,两个头部包装蛋白的基因中的,CAG,密码子突变成,UAG,。,当这种,l,-DNA,进入一般的大肠杆菌菌株后，不能合成有活性的头部蛋白，也就不能被包装和裂解细菌，这样就可以阻止有害重组体的生物污染及扩散，而基因工程实验中使用的受体则是具有琥珀型突变体校正功能的菌株,（一）大肠杆菌的,l,噬菌体,DNA,三、噬菌体或病毒,DNA,3.l,-DNA,载体的主要类型：,插入灭活型载体,Charon,2、,Charon,6、,l,gt11,取代型载体,l,EMBL4、,l,gt,l,c、,l,NM762、Charon,40,正选择型载体,l,EMBL1、,l,L47、,l,1059,野生型的,l,噬菌体不能在,P2,噬菌体溶源性的细菌,中繁殖（,Spi,+,），,这种生长抑制表型受,l,-DNA,上的,red,和,gam,两个基因控制。若将外,源,DNA,取代,red,和,gam,，,重组,噬菌体便拥有,Spi,-,表型，能在,P2,噬菌,体,溶源性的大肠杆菌受体菌中繁殖，并形成透明斑。,（一）大肠杆菌的,l,噬菌体,DNA,三、噬菌体或病毒,DNA,4.l,-DNA,重组分子的体外包装：,l,-DNA,重组分子需在体外人工包装成有感染力的噬菌体重组颗粒，方可高效导入受体细胞,用于体外包装的蛋白质可直接从感染了,l,噬菌体的大肠杆菌中提取，现已商品化。这些包装蛋白通常分为相互互补的两部分：一部分缺少,E,组份，另一部分则缺少,D,组份。包装时，当且仅当这两部分包装蛋白与重组,l,-DNA,分子混合后，包装才能有效进行，任何一种蛋白包装液被重组,l,-DNA,污染后，均不能被包装成有感染力的噬菌体颗粒，这也是基于安全而设计的,（一）大肠杆菌的,l,噬菌体,DNA,三、噬菌体或病毒,DNA,5.l,-DNA,及其重组分子的分离纯化：,将大肠杆菌在含有麦芽糖的培养基中培养至对数生长期,加入,l,噬菌体或重组,l,噬菌体的悬浮液，,37,培养,1,小时,用新鲜培养基稀释，继续培养,4-12,小时。这时噬菌体颗粒,密度已达,10,13,-10,14,/,L,，,大肠杆菌细胞已完全裂解,超速离心，沉淀噬菌体,苯酚抽提，释放,l,-DNA,乙醇或异丙醇沉淀,l,-DNA,（一）大肠杆菌的,l,噬菌体,DNA,三、噬菌体或病毒,DNA,6.l,-DNA,作为载体的优点：,l,-DNA,可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌,l,-DNA,载体的装载能力为,25,kb,，,远远大于质粒的装载量,重组,l,-DNA,分子,的筛选较为方便,重组,l,-DNA,分子的提取较为简便,l,-DNA,载体适合克隆和扩增外源,DNA,片段，但不适合表达,外源基因,（一）大肠杆菌的,l,噬菌体,DNA,三、噬菌体或病毒,DNA,（二）大肠杆菌的,M13,单链噬菌体,DNA,1.M13,噬菌体的生物学特性：,a,生物结构,M13,噬菌体的外型呈丝状,M13,噬菌体,由外壳包装蛋白和,正,链,DNA,组成,M13,DNA,全长,6407,个核苷酸,M13 DNA,上,至少有10个基因,2700个外壳蛋白分子,M13,噬菌体,不裂解宿主细胞，但抑制其生长,三、噬菌体或病毒,DNA,1.M13,噬菌体的生物学特性：,b,感染周期,+DNA,（+DNA,RFDNA,RFDNA,RFDNA,-DNA,II,V,（二）大肠杆菌的,M13,单链噬菌体,DNA,三、噬菌体或病毒,DNA,（二）大肠杆菌的,M13,单链噬菌体,DNA,2.M13 DNA,载体的构建：,III VI I IV II X V VII IX VIII,野生型,M13RF-DNA,III VI I IV II X V VII IX VIII,M13mp,系列载体,lacZ,polylinker,三、噬菌体或病毒,DNA,（二）大肠杆菌的,M13,单链噬菌体,DNA,3.M13 DNA,载体的特点：,使克隆的,DNA,片段以特定单链的形式输出受体细胞外,这在,DNA,定