噬菌体及其研究进展.ppt

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万人因食用了受污染的食物而患病，其中91%是由于细菌污染造成。,现存的检测方法包括传统的细菌分离培养法、多聚酶链式反应(PCR)法、生物芯片技术和免疫学方法等。,缺点,：费时费力、价格昂贵、特异性或灵敏度低、国内试剂供应不配套等，很难适应公共卫生事件应急处理快速反应的需要。,有必要寻找一种简捷、快速、灵敏度高的检测食源性病原微生物的方法以及技术平台。,检测方法,报告基因检测,荧光,染料标记,噬菌斑,检测,3.1.1噬菌斑检测,原理,：用噬菌体截获某种病原菌，随后病原菌被噬菌体感染，用杀毒剂将胞外的剩余噬菌体杀死，然后将噬菌体与被感染细胞混合并在装有软琼脂的双层培养基上培养，被感染的细胞破裂释放出子代噬菌休，在培养基中就会形成空斑。,实验方法,标本采集后置于SC 增菌管中37 增菌18 h左右,SS 平板分离培养37 过夜,然后挑出具有,沙门氏菌,特征的单个菌落划线接种于普通琼脂平皿上,每块平板划格后可接种8 个菌落左右。,在每格中央用灭菌的毛细滴管滴上O-I噬菌体,待溶液干后置37 6-8 h 培养或过夜,观察噬菌体裂解情况。,发现被O-I 噬菌体裂解的菌株,马上挑取噬斑周围菌苔直接做沙门氏菌A-F 多价血清凝集试验,凝集阳性者即可初步报告结果,然后转种克氏双糖铁管作进一步鉴定分型。,简例,O-I,噬菌体是作用于沙门氏菌属特异性噬菌体,染色体为双链,DNA,受体是宿主细胞壁上核心多糖的乙酰氨基葡萄糖。应用,O-I,噬菌体进行饮食行业及公共场所从业人员带菌调查结果表明,沙门氏菌检出率为,0.131%,与广东省报道的,0.134%,检出率相近,说明,O-I,噬菌体应用对沙门氏菌的诊断具有较高的特异性和敏感性,不失为大量从业人员沙门氏菌调查的较为理想快速诊断方法。,3.1.2荧光染料标记法,原理,：,选用一种合适的染色剂，噬菌体的核酸染色标记，然后用标记过的噬菌体侵染相应的宿主菌，噬菌体吸附在宿主菌表面后，随即将标记过的核酸注入宿主细胞，随着越来越多的噬菌体核酸的注入，细胞内荧光随着荧光素的增多而增强，借助荧光显微镜便能判定宿主菌的存在，从而实现病原菌的检测。,简介,A图只有细菌,荧光视野里不见任何发光物质;B图中只有荧光标记O-I噬菌体,视野下偶尔可见少量圆点状的荧光物质,不见菌形;C图是荧光标记O-I噬菌体和沙门氏菌混合,可见大量杆状物,少量点状物,极少数彗星状杆状物,将杆状物质与沙门氏菌的革兰氏染色形态进行比较,两者一致。,由此可推知,C,图中杆形物是侵有荧光噬菌体的沙门氏菌,点状物是标记的O-I噬菌体,结合,B图,可知彗星状杆形物是即将裂解的宿主菌。,简例,蒋鲁岩等用此方法快速检测食品源沙门氏菌，检测灵敏度达10 CFU/100L;120份食品样品中沙门氏菌的O-I噬菌体检测与生化鉴定结果的阳性率分别为9.17%和10%,符合率为91.7%。表明用荧光标记的O-I噬菌体可以快速、直观、准确、大量地检测食品中沙门氏菌。,3.1.3报告基因检测技术,该技术中，将一个报告基因通过噬菌体插入到目标菌体的D N A 中，随着报告基因的表达，目标菌体便可快速得到检测。,应用在这一技术的报告系统主要有原核生物和真核生物的荧光素酶(lux,luc)基因，细菌冰核蛋白(inaW)基因，,E.coli-,半乳糖苷酶(lacZ)基因和生物素亲和蛋白。报告噬菌体已经能够成功检测许多菌种，如,E.coli,Salmonella.spp,等。,简介,利用荧光素酶基因作为报告基因的快速检测技术,对于细菌来说，发光机理可用下式表述：,F M N H,2,+R C H O+O,2,F M N+H,2,O+R C O O H+h(490nm),反应是在荧光素酶的催化下进行的。细菌的荧光素酶是一个7 7 k D 的二聚体，其中包含亚基(4 0 3 7 k D)和亚基(37kD)。,目前生物发光基因(lux,luc)在报告噬菌体检测技术中应用最为广泛。,Waddell 等利用转座子致突变，将lucA和lucB基因插入到E.coli O157:H7的温和噬菌体 V 1 0 中，构建了一个荧光素酶转座噬菌体，这一噬菌体能够使E.coli O157:H7 在1h 内被成功检测，并报告出结果。,Masahito,等将绿荧光蛋白,(GFP),基因分别插入到,T,偶数型噬菌体,PP01,的外壳蛋白,(SOC),基因的,C,末端和,N,末端，构建成噬菌体,PP01-GFP/SOC,和,PP01-SOC/GFP,，这种对,E.coli O157:H7,特异的噬菌体能够成功检测菌体的可培养细胞，不可培养但可存活细胞,(VBNC),及经过巴氏消毒过的细胞，灵敏度高，检测时间仅为,20min,。,以-半乳糖苷酶作为报告基因的快速检测技术,-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.23)是一种催化-半乳糖苷水解反应的糖苷酶。,-半乳糖苷酶的作用特性是随着水解反应底物的不同而改变，邻硝基苯-D-半乳糖苷是检测中常用的灵敏基质，它被-半乳糖苷酶水解后产生,蓝色沉淀，,该技术可以使检测的灵敏度达到生物发光荧光素酶检测的水平。,Goodridge等设计了一个带有lacZ基因的T4噬菌体，用这种噬菌体感染待测样品，并用化学发光基质作为检测基质，研究人员成功检测了肉汤培养基中的E.coli，检测限仅为10,2,CFU/ml。然后，研究人员将最大概率数(most probable number，MPN)法应用到食源性病原菌检测中，检测水平可降至10CFU/ml，用时仅1h。,3、噬菌体在食品产业中的应用,食源性疾病病原的检测技术,作为食品添加剂,噬菌体展示技术检测真菌毒素,3.2作为食品添加剂,美国食品和药物管理局批准了一种由噬菌体病毒混合而成的产品，主要用于杀灭肉制品中的李氏杆菌。这是美国首次批准将病毒用作食品添加剂。,美药管局专家称，该产品在制备过程中可能留有残毒，但试验表明，这些微量的残毒不会引起任何健康问题。该产品包含6种噬菌体病毒，可在熟肉片和香肠等包装前喷洒在这些肉制品上，有效杀灭多种李氏杆菌，预防由这些细菌引起的食物中毒。产品中所包含的噬菌体只会攻击李氏杆菌，对人体和植物细胞都不会产生影响。,3、噬菌体在食品产业中的应用,食源性疾病病原的检测技术,作为食品添加剂,噬菌体展示技术检测真菌毒素,3.3 噬菌体展示技术检测真菌毒素,噬菌体展示技术,(Phage display technology),是,20,世纪,80,年代逐步建立并发展起来的一项分子生物学新技术。它以噬菌体或噬粒为载体,使外源肽或蛋白基因与噬菌体表面特定蛋白基因在其表面进行融合表达,进而通过亲和富集法筛选表达有特异肽或蛋白质的噬菌体。,真菌毒素作为天然毒素广泛存在于谷物等食品中，世界很多国家均有被污染的报告由于真菌毒素属于痕量污染物，因此检测技术主要有各类色谱法和利用抗体的免疫学方法。,其中,高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱和质谱联用（GC-MS）,优点,：灵敏度和可靠性都很高,缺点,：样品处理繁琐，仪器昂贵，现场快速检测中难以普及使用,酶联免疫吸附检测技术(ELISA),优点,：可以同时大批量检测样品，携带方便，操作简便和经济,常以试剂盒的形式出现且易商品化,缺点,:目前用于ELISA 检测试剂盒的各类毒素的单克隆抗体(McAb)主要来源于小鼠杂交瘤细胞，在筛选单克隆抗体生产杂交瘤细胞株系上，需要做杂交融合，亚克隆筛选，是一个长期复杂的过程，既耗费财力、物力，又浪费时间，且检测所用真菌毒素标准品价格昂贵。,利用噬菌体展示技术制备抗体、模拟抗原表位，不仅绕过了细胞融合，而且可以以单克隆抗体（McAb）或单链抗体（ScFv）为靶分子筛选真菌毒素的模拟抗原表位，代替真菌毒素的标准品，建立无毒ELISA检测方法，保证实验操作人员和相关研究人员的人身安全。,熊啸（2007 年）等选用抗黄曲霉毒素M1（anti-AFM1,Aflatoxin M1,AFM1）单克隆抗体为筛选配基，从噬菌体表面展示的随机7 肽库中筛选出AFM1 抗原的模拟表位LTSFPRH 和MAPSSWR，为研制出安全无毒的ELISA 试剂盒奠定基础。,4、前景及展望,噬菌体检测技术具有快速、准确而直观特点,具有很强的优势,应用前景广阔。,噬菌体大规模应用技术尚不成熟,有关噬菌体的各种研究正在开展,但是这些研究仍限于动物模型,且缺少统一的评定指标。噬菌体技术存在很多缺陷，比如:噬菌体携带一些毒素基因;噬菌体裂解细菌高度特异,作用谱很窄。这些问题会导致实际过程中治疗的不稳定性和不安全性。,所以目前噬菌体在实践中的应用相对较少,研究空间较大。相信随着噬菌体技术的不断发展和改善,它将在生命科学等各个领域产生深远的影响。,Thank You!,