五：核酸.ppt

单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,第五章 核酸,5.1,概述,5.2,核酸的化学成分,5.3,脱氧核糖核酸（,DNA,）的结构,5.4,核糖核酸（,RNA,）的结构,5.5,核酸的理化性质,5.6,核酸类物质的制备和应用,5.1,概述,核酸的概念,核酸是遗传物质的证明,核酸的种类、分布与功能,5.1,概述,核酸的概念,是以,核苷酸,为基本组成单位的生物大分子，携带和传递遗传信息。,5.1,概述,烟草花叶病毒,M,和,HR,品系的重建试验,5.1,概述,核酸的种类、分布与功能,脱氧核糖核酸（,D,eoxyribo,n,ucleic,A,cid,DNA,),原核：裸露的,DNA,分子集中于,拟核区和质粒,真核：细胞核,DNA,（与组蛋白、,非组蛋白形成染色体）；细胞,器,DNA,（双链环形，一般裸露）,功能：遗传信息的贮存和携带,5.1,概述,核糖核酸（,R,ibo,n,ucleic,A,cid,RNA,),原核：细胞质,真核：细胞质（主要）、线粒体、叶绿体、细胞核,功能：参与遗传信息的传递和表达；某些病毒的遗,传物质；细胞功能的调控；催化功能；在细胞分化,和个体发育中发挥重要作用；在生命起源中可能有,重要作用。,5.2,核酸的化学成分,核酸的组成核苷酸的连接,5.2,核酸的化学成分,核酸的组成,元素组成,碳、氢、氧、氮、,磷（,9-10%,）,化学组成,碱基,戊糖,核苷,核苷酸,核酸定量测定的经典方法,5.2,核酸的化学成分,核酸水解层次图,核苷,5.2,核酸的化学成分,核苷酸中的碱基均为,含氮杂环化合物,，它们分别属于嘌呤衍生物和嘧啶衍生物。,碱基,紫外吸收特性：,260nm,碱基之间相互作用：,氢键,碱基的化学结构,腺嘌呤（,A,）,鸟嘌呤（,G,）,胞嘧啶（,C,）,胸腺嘧啶（,T,）,尿嘧啶（,U,）,5.2,核酸的化学成分,5.2,核酸的化学成分,稀有碱基：,大多是在上述嘌呤或嘧啶碱的不同部位甲基化、甲硫基化或进行其它的化学修饰而形成的衍生物。,5.2,核酸的化学成分,b,-D-,戊糖（核糖）,b,-D-2-,脱氧戊糖（脱氧核糖）,戊糖,1,2,3,4,5,1,2,3,4,5,5.2,核酸的化学成分,核苷,脱氧核苷,核苷,由,D-,核糖或,D-2-,脱氧核糖与嘌呤或嘧啶通过,糖苷键,连接组成的化合物。,C/T,糖苷键,5.2,核酸的化学成分,核苷酸,核苷中,戊糖的羟基,与,磷酸,以磷酸酯键连接而成为核苷酸，即核苷的磷酸酯，核苷酸是核酸分子的,结构单元,。,糖苷键,酯键,5.2,核酸的化学成分,碱基,核糖核苷酸,脱氧核糖核苷酸,腺嘌呤,腺嘌呤核糖核苷酸,（腺苷酸，,AMP,）,腺嘌呤脱氧核糖核苷酸,（脱氧腺苷酸，dAMP,）,鸟嘌呤,鸟嘌呤核糖核苷酸,（鸟苷酸，,GMP,）,鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸,（脱氧鸟苷酸，,dGMP,）,胞嘧啶,胞嘧啶核糖核苷酸,（胞苷酸，,CMP,）,胞嘧啶脱氧核糖核苷酸,（脱氧胞苷酸，,dCMP,）,尿嘧啶,尿嘧啶核糖核苷酸,（尿苷酸，,UMP,）,胸腺嘧啶,胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸,（脱氧胸腺苷酸，,dTMP,）,常见核苷酸,5.2,核酸的化学成分,多磷酸核苷酸,核苷二,/,三磷酸,脱氧核苷二,/,三磷酸,二,/,三磷酸腺苷（腺苷二,/,三磷酸）,酶活性和代谢的,调节物质,生理储能和供能,的主要形式,5.2,核酸的化学成分,3,5-,环化腺苷酸（,cAMP,）,核苷酸的环化形式,重要的第二信使,5.2,核酸的化学成分,紫外吸收特性：,260nm,用于核苷酸的,定量,检测,5.2,核酸的化学成分,核苷酸的连接,3,5-,磷酸二酯键,5,3,OH,OH,OH,5,3,RNA DNA,5.2,核酸的化学成分,核酸链的简写式,5,pApCp,T,p,T,pGpApApCpG,3,DNA,5,pApCp,U,p,U,pGpApApCpG,3,RNA,5,pACTTGAACG,3,5,pACUUCAACG,3,5,ACTTGAACG,3,双链,DNA,3,TGAACTTGC,5,字符式,5.2,核酸的化学成分,线条式,5,-,磷酸,戊糖,3,-OH,核苷酸,5.3,DNA,的结构,DNA,的一级结构,DNA,的二级结构,DNA,的三级结构,DNA,的特殊结构,5.3,DNA,的结构,DNA,的一级结构,3,5-,磷酸二酯键,指,DNA,分子中,四种脱氧核苷酸,按照一定的排列顺序，通过磷酸二酯键连接形成的多核苷酸。,方向性：,5,3,5,-,端：,C5,没有和其他核苷酸相连的末端残,基，含磷酸，又称5,磷酸端,3,-,端：,C3,没有和其他核苷酸相连的末端残,基，含有-,OH，,又称3,羟基端,通常用,bp,、,kb,或,Mb,的数目表示大小,生理,pH,下，核酸是多聚阴离子化合物,碱基序列,5.3,DNA,的结构,基因组,DNA,某些有代表性的生物体基因组大小,种类,典型代表,碱基对（,bp,）,最简单的微生物,SV40,病毒,5.010,3,噬菌体,5.010,4,细菌,大肠杆菌,4.610,6,哺乳动物,小鼠,2.310,9,人,3.010,9,一般将细胞内遗传信息的携带者染色体所包含的,DNA,总体,称为基因组。,5.3,DNA,的结构,基因,DNA,分子中不同排列顺序的,DNA,区段,构成,特定的功能单位,即基因。,基因的功能取决于,DNA,的一级结构,。,大肠杆菌基因组上部分基因的排列,5.3,DNA,的结构,DNA,的二级结构,DNA,双螺旋结构的研究背景,双螺旋结构模型,DNA,纤维的,X,射线衍射图谱分析,碱基理化数据分析,A-T,、G-C,以,氢键,配对较合理,碱基组分分析（,Chargaff,规则）,不同来源,DNA,：,A=,T,，,G,=,C,不同物种,DNA,：,A+T/G+C,不同,A+G=T+C,5.3,DNA,的结构,DNA,双螺旋结构模型要点,由,脱氧核糖,和,磷酸基,通过酯键交替连接而成。,二条主链,相互平行,而,走向相反,形成右手双螺旋构型,主链,螺旋直径为,2,nm,，形成,大沟,及,小沟,相间,主链处于螺旋,外侧,，,亲水性,5.3,DNA,的结构,碱基对,碱基位于螺旋的内侧，同一平面的碱基在,二条主链间,形成碱基对（,A=T,和,G,C,），以,氢键,维系。,碱基平面取向与螺旋轴垂直。,螺距,3.4nm,，螺旋周期含,10,碱基对，,相邻碱基平面间距,0.34nm,。,5.3,DNA,的结构,作用力,氢键,氢键,碱基堆积力：,在水相中，轴向平行相邻的碱基平面将自发地相互靠近，从而形成碱基堆积，它的实质是,疏水相互作用,和,范德华引力,。,5.3,DNA,的结构,DNA,双螺旋结构的多态性,DNA,的分子结构是,动态,的，在不同的条件下可以有所不同。,A,构象,B,构象,C,构象,D,构象,Z,构象,5.3,DNA,的结构,Z,构象,左手螺旋,重复单位,二核苷酸,只有一个螺旋沟,比较内容,B-DNA,Z-DNA,螺旋手性,右旋,左旋,螺旋周期的核苷酸数目,10,12,螺旋直径,20A18A,碱基平面的间距,3.4A,3.7A,螺距,34A,45A,相邻碱基对间的转角,36A,60A,轴心与碱基的关系,穿过碱基对,不穿过碱基对,5.3,DNA,的结构,DNA,的三级结构,双螺旋,DNA,进一步扭曲盘绕则形成其三级结构，是一种比双螺旋更高层次的空间构象。,超螺旋,是,DNA,三级结构的主要形式。,超螺旋按其方向分为,正,超螺旋和,负,超螺旋两种,负超螺旋：,形成超螺旋时旋转方向与,DNA,双螺旋方向,相反,，旋转结果使,DNA,分子内部张力减小，称为松旋效应。在自然条件下共价封闭环状,DNA,呈负超螺旋结构。,正超螺旋：,形成超螺旋时的旋转方向与,DNA,双螺旋方向,相同,结果加大了,DNA,分子内部张力，有紧旋效应。,松弛环 正超螺旋 解链环,5.3,DNA,的结构,DNA,超螺旋的特点,环状,DNA,分子,双螺旋扭曲而形成,麻花状,的超螺旋结构。,线状,DNA,分子,双螺旋与,蛋白质,结合后扭曲盘绕而形成螺旋结构。,5.3,DNA,的结构,核小体是构成染色质的,基本结构单位,。,组蛋白八聚体,H1,组蛋白,核小体：,在真核生物中，双螺旋的,DNA,分子围绕一蛋白质八聚体进行盘绕形成特殊的串珠状结构。平均每200,bp DNA,绕核小体左旋1.75转,。,5.3,DNA,的结构,DNA,的特殊结构,发夹结构,十字架结构,5.3,DNA,的结构,回文结构：,双链,DNA,中含有的二个,结构相同,、,方向相反,的序列称为反向重复序列，也称为回文结构。,5.4,RNA,的结构,RNA,的结构特征,RNA,的主要类型、结构与功能,5.4,RNA,的结构,RNA,的结构特征,3,5-,磷酸二酯键,由核苷酸通过,3,5-,磷酸二酯键,连接成的无分支的长链大分子，但它只有一条核酸链，呈右手螺旋结构。,5.4,RNA,的结构,种类,RNA,DNA,组成,戊糖,核糖,脱氧核糖,碱基,A,G,C,U,，稀有碱基含量多,A,G,C,T,磷酸,Pi,（,3,5-,磷酸二酯键）,结构,单链,，局部双螺旋，具有明确,的三级结构,双链,，碱基互补，双螺旋结构,分布,细胞核（核仁）,细胞质（线粒体，核蛋白体，,胞液）,细胞核（染色质）,细胞质（线粒体）,生物功能,遗传信息表达，反转录，直接,参与蛋白质的生物合成,遗传的物质基础，负责遗传信息,贮存，发布，转录,RNA,与,DNA,的比较,5.4,RNA,的结构,RNA,的部分碱基互补,RNA,发夹双螺旋结构,5.4,RNA,的结构,RNA,的主要类型、结构与功能,类型,细胞核和胞液,线粒体,功能,核蛋白体,RNA,rRNA,mt rRNA,核蛋白体组成成分,信使,RNA,mRNA,mt mRNA,蛋白质合成模板,转运,RNA,tRNA,mt tRNA,转运氨基酸,不均一核,RNA,hnRNA,成熟,mRNA,的前体,小核,RNA,snRNA,参与,hnRNA,的剪接、转运,小胞浆,RNA,scRNA/7S,RNA,蛋白质内质网定位合成的信号识别体的组成成分,5.4,RNA,的结构,mRNA,的结构与功能,占,RNA,总量的,3-5,，胞内最不稳定的,RNA,。,多顺反子：,在原核细胞中，通常是几种不同的,mRNA,连在一起，相互之间由一段短的不编码蛋白质的间隔序列所隔开。这样的一条,mRNA,链含有指导合成几种蛋白质的信息。,原核细胞,编码区,编码区,5-,非编码区,3-,非编码区,插入序列,真核细胞,5.4,RNA,的结构,单顺反子：,真核基因转录产物为单顺反子，即一种基因编码一种多肽链或,RNA,链，每个基因转录有各自的调节元件。,5,非编码区,3,非编码区,编码区,帽子结构为核糖体识别,mRNA,提供信号，也可增加,mRNA,的稳定性，免受核酸外切酶降解。,5,帽子,m,7,GpppN,polyA 3,尾巴,mRNA,：,作为蛋白质的氨基酸序列合成模板的,RNA,。,hnRNA,：,在真核生物中，转录最初生成的,RNA,，是成熟,mRNA,的前体。,5.4,RNA,的结构,5.4,RNA,的结构,tRNA,的结构与功能,在蛋白质生物合成过程中起介导作用，即,转运氨基酸,作用，占总,RNA,的,15%,。,tRNA,的一级结构,由,7090,核苷酸构成，是,3,种主要,RNA,中,分子量最小的,含有约,20,多,个固定核苷酸,成熟的,tRNA 5,末端被磷酸化，通常为,pG,，,3,末端序,列是,CCA,是含,稀有碱基最多,的,RNA,，约,1020%,5.4,RNA,的结构,tRNA,的二级结构,氨基酸臂,DHU,环,反密码环,T,y,C,环,额外环,三叶草结构,氨基酸臂,：,其3,端为,CCA-OH,结,构，用来连接活化的氨基酸,二氢尿嘧啶环（,DHU,环）：,由8,-,12,个核苷酸组成，其中含两个二,氢尿嘧啶；,反密码子环,：,环中央的三个碱基,构成反密码子,额外环,：,核苷酸数目不确定，可,作为,tRNA,分类的重要指标,T,C,环：,由7个核苷酸组成，其,中含有保守的,T,C,序列。,5.4,RNA,的结构,tRNA,的三级结构,倒,L,形,5.4,RNA,的结构,rRNA,的结构与功能,是细胞中,含量最多,的,RNA,，占,80%,以上。,参与组成,核糖体,，作为蛋白质生物合成的场所。,核糖体的组成,5.4,RNA,的结构,原核细胞和真核细胞的核糖体组成,组成,原核细胞,真核细胞,沉降常数,近似分子量,沉降常数,近似分子量,核蛋白体,70S,2.710,6,80S,4.610,6,小亚基,30S,0.910,6,40S,1.510,6,rRNA,16S,0.610,6,18S,0.710,6,蛋白质,21,种,0.310,6,约,30,种,0.78106,大亚基,50S,2.010,6,60S,3.010,6,rRNA,23S,1.210,6,28S,1.710,6,5.8S,4.010,4,5S,3.210,4,5S,3.210,4,蛋白质,34,种,0.710,6,约,50,种,1.3710,4,5.4,RNA,的结构,rRNA,的一级结构,修饰碱基含量比,tRNA,少得多，但存在,甲基化核苷,5,S rRNA,为真核和原核细胞共有，含120个核苷酸,真核细胞的 5.8,S rRNA,与大肠杆菌 23,S rRNA 5,端160个核,苷酸具有,同源性,。在原核细胞中，,rRNA,的基因按照 16,S，,23S,和5,S,的顺序串连排列而真核细胞是按照18,S，5.8S,和,28,S,的顺序排列（5,S rRNA,在高等真核生物中单独转录），,所以推测23,S rRNA,的基因在进化过程中演变为5.8,S,和28,S,两,个基因。,普遍存在于原核生物的,16,S rRNA,约为1.5,kb，,其可变区序列,的差异可用来对不同菌属、菌种的细菌进行,分类鉴定,。,rRNA,的二级结构,16S rRNA,5.4,RNA,的结构,5S rRNA,5.8S rRNA,23S rRNA,单股,rRNA,链可自行折叠，形成,螺旋区,和,环区,，从而构成不同的,结构域,。,5.4,RNA,的结构,rRNA,在蛋白质合成中的作用,16S rRNA,的,3,末端可与,mRNA,起始密码,AUG,前的一段序列,（,SD,序列）直接互补（,识别结合,mRNA,）,16S rRNA,中另一个特定区域是两个,tRNA,结合位点（,结合,tRNA,，即,A,位和,P,位,）,核糖体大亚基,23S rRNA,具有肽酰转移酶活性（,转肽酶中心,）,其他类型的,RNA,分子,核内小,RNA,（,snRNA,）,存在于真核细胞细胞核内，是小核核蛋白体复合体（,snRNP,）的组成成分，参与,hnRNA,转变为,mRNA,的过程。,胞浆小,RNA,（,scRNA,）,又称,7S RNA,，主要存在于真核细胞细胞浆中，是蛋白质定位于粗面内质网上所需信号识别颗粒（,SRP,）的组成成分。,5.4,RNA,的结构,起始,RNA,（,iRNA,）,在,DNA,生物合成中作为引物，大约,10,个核苷酸。,指导,RNA,（,gRNA,）,真核生物中参与,RNA,编辑具有与,mRNA,互补序列的,RNA,。,微小,RNA,（,miRNA,）,结合到目标,mRNA,的3,端非编码区进而调节目标,mRNA,的翻译，在生物体的发育时序调控中发挥重要作用。,小干扰,RNA,（,siRNA,）,可以结合到目标,mRNA,上与之序列互补的区域，指导核酶将目标,mRNA,特异性降解，是机体防御病毒入侵的重要机制之一。,5.4,RNA,的结构,核仁小,RNA,（,snoRNA,）,一类小分子非编码,RNA,，且多富集于核仁，需要与特定蛋白质结合形成核糖核蛋白体（,snoRNP,），在核糖体,RNA,前体的剪接加工和转录后修饰过程中起重要作用。,5.5,核酸的理化性质,沉降特性,溶液中的核酸在,引力场,中可以下沉，在超速离心机造成的极大引力场下，核酸分子下沉的速率大大加快。,沉降系数：,以每单位重力的沉降时间表示，并且通常为,1-20010,-13,秒范围，,10,-13,这个因子叫做,沉降单位,S,，即,1S=10,-13,秒,。大多数蛋白质和核酸的沉降系数在,4S,和,40S,之间，核糖体及其亚基在,30S,和,80S,之间。,氯化铯密度超离心后，不同构象,DNA,及各种杂质的分布,5.5,核酸的理化性质,高分子量,类别,mRNA,tRNA,rRNA,E.coli,染色体,人第,13,对,染色体,分子量,2.510,4,10,6,2300030000,1.110,6,2.210,9,6.410,10,核苷酸数,75300,7393,3100,610,6,1.910,8,高粘度,DNA,的粘度比,RNA,的大得多,。当核酸溶液因受热或在其他因素作用下发生螺旋向线性过渡时，粘度会降低。,5.5,核酸的理化性质,光学吸收,酸碱性质,核酸有,磷酸基,和,碱基,，因此核酸具有,两性电离,的性质。但核酸中磷酸基的酸性大于碱基的碱性，其等电点偏酸性。,DNA,的,pI,约为,45,，,RNA,的,pI,约为,2.02.5,，在,pH78,电泳时泳向正极。,紫外吸收：,260nm,旋光性：右旋,5.5,核酸的理化性质,变性与复性,变性：,DNA,分子由稳定的双螺旋结构松解为无规则线性结构的现象。（,一级结构不发生变化！,）,理化及生物学性质改变,粘度降低,溶液旋光性改变,增色效应,5.5,核酸的理化性质,变性,DNA,的,双链解开,，碱基中电子的相互作用更有利于紫外吸收，故而产生紫外吸收作用,增强,的效应。,增色效应,DNA,的热变性曲线,Tm,值：,热变性使,DNA,分子双链解开所需温度称为熔解温度，简写,Tm,。,Tm,定义为使被测,DNA,的,50%,发生变性，即增色效应达到一半的温度。,5.5,核酸的理化性质,DNA,的变性曲线,影响,Tm,值的因素,DNA,的,均一性,越高，,Tm,的温度范围越小,G-C,含量,越高，,Tm,值越大,溶液,离子强度,较高时，,Tm,值较大,5.5,核酸的理化性质,复性：,变性,DNA,在,适当条件,下，二条互补链全部或部分,恢复,到天然双螺旋结构的现象。,5.5,核酸的理化性质,影响复性的因素,温度和时间,DNA,浓度,DNA,顺序的复杂性,退火,5.5,核酸的理化性质,不同来源的核酸变性后合并在一处进行复性，这时，只要这些核酸分子的核苷酸序列含有可以形成碱基互补配对的片段，复性也会发生于不同来源的核酸链之间，即形成所谓的,杂化双链,，这个过程称为,杂交,。,核酸的分子杂交,5.5,核酸的理化性质,核酸的水解,酸水解：,糖苷键和磷酸酯键,碱水解：,RNA,的磷酸酯键,酶水解：,核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶、核,酸酶,S1,、核酸内切酶及核酸外切酶等,5.6,核酸类物质的制备和应用,制备方法,生物材料提取,微生物发酵,化学合成,以,自学,为主,5.6,核酸类物质的制备和应用,核酸的提取和检测,核酸提取的原则,防止,核酸酶,的降解（,DNase,或,RNase,）：通常加入抑制剂和,去激活剂，如柠檬酸钠，,EDTA,来抑制酶的活性,防止,化学因素,的降解：避免强酸或强碱,防止,物理因素的降解：高温、机械作用等均会破坏核酸分子,的完整性，因此一般在低温及避免剧烈搅拌等条件下进行,5.6,核酸类物质的制备和应用,核酸的提取和纯化,有机溶剂沉淀法,等电点沉淀法,钙盐沉淀法,选择性溶剂沉淀法,核酸,溶于水,而不溶于有机溶剂，所以核酸一般采用水溶液提取。,超离心法（沉降速度超离心和沉降平衡超离心）,凝胶电泳法（琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳）,柱层析法（排阻过滤层析、离子交换层析，反向层析、,羟基,磷灰石柱层析、硝酸纤维素柱层析和甲基化白蛋白柱层析,）,5.6,核酸类物质的制备和应用,核酸检测的常用方法,紫外灯下观察结果,电泳缓冲液,琼脂糖凝胶电泳,利用荧光染料,溴化乙锭,进行染色，,254nm,的紫外照射观察。,DNA,标准分子量,定量,定性,5.6,核酸类物质的制备和应用,聚丙烯酰胺凝胶电泳,5.6,核酸类物质的制备和应用,由于嘌呤碱和嘧啶碱是一种共轭体系，因此在,260nm,左右有强烈的光吸收值。,纯,DNA,：,OD,260,/OD,280,1.8,纯,RNA,：,OD,260,/OD,280,2.0,紫外吸收,5.6,核酸类物质的制备和应用,核酸类物质的应用,以核苷酸盐为主要成分的助鲜剂,微生物发酵保健食品（膳食补充剂）,直接用于医药或作为药物的原料,广泛用于基因工程研究的重要工具,作为植物生长调节物质,思考题,1.,核酸有哪两大类？它们的组成及细胞内分布有何不同？,2.,试述,DNA,二级结构和三级结构的特点。,3.,稳定双螺旋结构的作用力有哪些？,4.,名词解释：,DNA,的一级结构，,DNA,复性，,DNA,的,Tm,值，增色效应，单顺反子，多顺反子,5.RNA,有哪些主要类型？它们的生物功能分别是什么？,6.tRNA,的二级结构有哪几个功能域？,7.,什么是,DNA,变性？它会使,DNA,发生怎样的改变？,8.,什么是,DNA,复性？影响复性的因素有哪些？,9.DNA,和,RNA,的比较。,