基因的表达与调控-DNA技术.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因的结构,1),基因的,上游区,含有,控制基因表达调控的顺序,通常将这些顺序称之为,反式因子,.,2),基因的,转录区,包含,:,外显子,:,在转录加工后输出细胞核的顺序,即编码,mRNA,的顺序,.,内含子,:,在转录加工后被切除的顺序,非编码顺序,.,3)mRNA,的顺序组成,:,5,非翻译区,:,可调控翻译起始,3,非翻译区,:,可调控翻译终止,多肽链编码区,(,密码子组成区,或称开放读框,open reading frame,ORF).,以转录起始点为分界线,在其,5,端的顺序,称为,基,因的上游区,在其,3,端的顺序,称为,基因的下游区,.,基因的结构,DNA,的编码链,-,正链,(+),转录时以,负链,(-),或无义链为模板,按碱基配对,法则合成与编码链或正链,(+),顺序相同的,RNA.,同义突变：,不改变相应的氨基酸序列（密码子的简并性,）,错义突变：,改变了氨基酸序列,点突变,替换,错义突变的例子,镰状细胞贫血症,编码血红蛋白,b,肽链上一个决定谷氨酸的密码子,GAA,变成了,GUA,，使得,b,肽链上的谷氨酸变成了缬氨酸，引起了血红蛋白的结构和功能发生了根本的改变。,点突变,插入或缺失,造成翻译过程中其下游的三联密码子都被错读，产生完全错误的肽链或肽链合成提前终止。移码突变三或三的整数倍核苷酸的插入或缺失，仅仅添加或去除一些密码子或者间隔开原来相邻密码子，不影响阅读框。,神经退行性疾病亨廷顿氏病，串联重复序列,5,-CAG-3,的不正常扩增。,正常人中有,10,35,个拷贝，病人中,36,120,个拷贝,基因突变的原因多种多样：,自发突变,DNA,复制错误造成碱基的替换、插入或缺失等自发突变,DNA,聚合酶的错误：,E.coli,中的错误率,10,-7,，,碱基的酮式和烯醇式互变异构,DNA,损伤或突变的修复机制,E.coli,基因组复制的总体错误率为,10,-10,到,10,-11,相当于每拷贝,1000,次出现一次未校正的复制错误,DNA,修复缺陷导致人类的疾病：着色性干皮症,诱发突变,外界因素如某些化学物质诱变剂、紫外线、,电离辐射等也可能诱导基因突变的发生,电离辐射和紫外线：白血病和皮肤癌,芳香烃类：皮肤癌,黄曲霉素：肝癌,亚硝胺：肝癌，食道癌，鼻咽癌,吸烟：肺癌,胸腺嘧啶的酮式与烯醇式互变,利用基因突变进行生物育种：,传统抗生素高产菌种的诱变筛选。,紫外线，,Co,60,，,NTG,，等,菌种,产量（单位,/ml,）,野生型青霉菌,20,突变型青霉菌,(X,射线,紫外线照射等,),50000,60000,染色体的畸变,染色体数目的变异,整倍体变异：多倍体，单倍体,非整倍体变异：三体，缺体,染色体结构的变异,缺失（,deletion,）,重复（,duplication,）,易位（,translocation,）,倒位（,invertion,）,染色体的数量变异,Down,氏综合症,（,21,三体）,Down,氏综合症发病率与母亲年龄有关。,母亲,20,岁时约,2000,新生儿中有一例患者；,30,岁前略有增加,35,岁以后约,300,例中有一个患者；,40,岁后,100,例中有一例；,45,岁后,50,例中有一例。,Down,氏综合症群体发病率,1/800,。,染色体的结构变异,人类的猫叫综合症：,第,5,号染色体缺失,（短臂缺失）患儿发出咪咪声，耳位低下，智商仅,20,40.,DNA,转录和,RNA,翻译，即遗传信息从基因流向RNA,又流向蛋白质的过程总称为基因表达,在高度复杂的生物细胞及其多种多样的代谢过程中，基因的表达是高度有序的。,3,原核生物基因的表达和调控,基因表达可以在不同的水平上进行调控，影响和控制转录和翻译等都属于基因表达的调控。,如控制基因转录的开启、关闭；,翻译速率的调节；,基因表达产物（蛋白质）的活性的控制,。,法国科学家,Monod,和,Jacob,发现，大肠杆菌在不含乳糖的葡萄糖培养基中不会分泌,-,半乳糖苷酶（参与乳糖降解代谢的主要酶）；相反，含有乳糖时，会合成,-,半乳糖苷酶，使乳糖水解。,经过一系列的实验后，他们又发现，大肠杆菌在没有乳糖的环境中不产生编码,-,半乳糖苷酶的,mRNA,。,1961,年，他们提出了一种模型即,乳糖操纵子学说,。,大肠杆菌对乳糖的利用,乳糖操纵子学说,乳糖操纵子学说,操纵子（,operon,）：由,启动子,、,操纵基因,和,结构基因,共同构成的基因簇单位，称为原核生物的操纵子。,启动子：,RNA,聚合酶结合的位点,操纵基因：转录的开关，决定,RNA,聚合酶能否转录,结构基因：编码,b-,半乳糖苷酶（,Z,）、透性酶（,Y,）和硫半乳糖苷乙酰转移酶（,A,）的基因。,在操纵子上游存在,调节基因,，其表达产物为,阻遏蛋白,乳糖,+,阻遏蛋白，改变阻遏蛋白的形状,细菌中转录与翻译偶联,原核生物,操纵子，真核生物,？,4,真核生物基因的表达和调控,真核生物基因表达与调控的复杂性：,（,1,）真核生物具有由核膜包被的细胞核，其基因的转录发生在细胞核中，而翻译则发生在细胞质中。,（,2,）真核生物基因数目比原核生物多，大多数基因除了有不起表达作用的内含子，另外还有更多调节基因表达的,非编码序列,，真核生物所转录的前体,mRNA,必须经过加工成熟后才进入表达阶段。,真核生物基因表达与调控的复杂性：,（,3,）真核生物染色质由,DNA,与,5,种组蛋白结合组成，它们折叠和缠绕形成核小体，核小体及染色质进一步折叠缠绕形成超级结构状态的细胞分裂中期染色体。染色质的结构对基因的表达起总体控制作用。,真核生物基因表达的调控可发生在不同水平上,染色质水平的调控,X,染色体部分失活,转录水平的控制,前体,mRNA,的加工,mRNA,跨核膜的运输调控,细胞质中,mRNA,的稳定性,mRNA,的选择性翻译,蛋白质产物的活化和后加工,玳瑁猫的皮毛颜色,5,基因与人类疾病,精妙的基因表达和调控机制，保证了细胞中,DNA,的复制、转录、翻译和各种代谢反应的高效和有序性，从而保证了生命的健康。,由于环境因素，或遗传因素，或环境与遗传因素的相互作用等，都可能导致基因突变的发生，也可能导致基因表达调控的失常。其结果便造成了某些与基因相关的人类疾病的发生。,从分子水平来解释某些与基因表达相关的人类重大疾病为基因诊断和治疗提供了依据。,癌症,癌症和心血管疾病成为威胁人类健康的两大恶魔。,癌是细胞生长与分裂失控引起的疾病，其根源是体细胞中调节细胞生长与分裂的基因异常表达。,癌症的发生是环境和遗传因素共同决定的。,环境致癌因子,遗传因素,肿瘤发生的家族聚集现象；种族间的差异；遗传易感性,肺癌,肝癌,胃癌,皮肤癌,乳腺癌,子宫颈癌,肿瘤发生的机理,肿瘤细胞的最大特点是细胞的分裂失去控制，导致无规律的增生。这一过程在本质上是,控制细胞分裂的基因,发生了突变。,癌变通常发生在必需不断更新的组织细胞,，由于频繁复制可积累突变。这些必需不断更新的组织细胞由于接触和受到许多物理化学因素的影响，易受损伤和发生遗传变异。,3),肿瘤发生相关的基因可分为两大类：,癌基因（,oncogenes,）,，它们能促进细胞的生长和增殖；,肿瘤抑制基因（,tumor-suppresor gene,）,或抑癌基因，它们能调节细胞的生长和分化而抑制肿瘤的发生。,细胞癌变的多步模型,-,结肠癌,组织学检查，将肿瘤分成不同等级,肿瘤基因的基因扩增，用癌基因探针杂交,基因芯片，评定肿瘤细胞的基因表达模式,在不同层面比较基因的表达水平,正常和肿瘤细胞,不同类型的肿瘤细胞,同一肿瘤的组织来源不同的细胞,肿瘤不同阶段的细胞,原位肿瘤和转移的细胞,来自不同患者的组织来源相似的细胞,提高对癌症的诊断和治疗能力,六、基因工程技术和应用,1,、基因工程技术,基因工程是生物技术的核心部分。,所谓,基因工程,(genetic engineering),就是有意识地把一个生物体中有用的目的基因转入另一个生物体中，使后者获得新的遗传性状或表达所需要的产物。,重组,DNA,技术，又称为基因或分子克隆技术，是基因工程的核心技术。该技术包括了一系列的分子生物学操作步骤。,重组,DNA,操作一般步骤：,（,1,）获得目的基因；,（,2,）重组,DNA,分子的构建；,（,3,）转化或转染；,（,4,）对转化子筛选和鉴定；,（,5,）特定遗传性状的表达。,获得需要的目的基因常用的方法：,（,1,）直接从生物体中提取总,DNA,，构建基因文库,(gene library),，从中调用目的基因；,（,2,）以mRNA,为模板，反转录合成互补的,DNA,片段，构建,cDNA,文库，,从中调用目的基因,；,（,3,）利用聚合酶链式反应（,PCR,）特异性地扩增所需要的目的基因片段，等等。,一般来说，人的基因，要从人体的组织细胞中去找；小鼠的基因要从小鼠的组织细胞中去找。从组织细胞中可以分离得到人,/,小鼠的全套基因，称为,基因文库,。,（,1,）获得目的基因,到哪里去找目的基因？基因文库法,基因文库的构建,将总,DNA,包含的基因组各片段分别克隆在质粒或噬菌体载体上，便构成了该生物的基因文库。,文库中基因总数，就人来说约有,3,万个基因。,如何从中把需要的基因找出来？,“,钓,”,基因称为,印迹法（分子杂交）,。,利用碱基配对的原则，用一段小的已知的,DNA,片断（探针）,去寻找（,“,钓,”,）大的未知的基因片断。,探针,DNA,片断,从何而来？,1,将样品通过,印迹技术,转到酯酰纤维薄膜上，以便操作；,2,用已知小片断,DNA,作为,探针,，互补结合需要找的基因片断；,3,由于探针,DNA,片断已用放射性元素标记，使胶片,感光,后可看出目的基因的位置。,探针,显色,洗膜,挑取阳性克隆并扩增,滤膜,反转录人工合成互补,DNA,构建基因文库获取目的基因存在的问题,费时费事,内含子序列,反转录人工合成互补,DNA,方法的优势,获取的,DNA,片段往往是具有特定功能的目的基因,聚合酶链式反应PCR,）扩增目的基因,PCR,技术就是在体外中通过酶促反应有选择地大量扩增（包括分离）一段目的基因的技术。,加入,4,种物质：,（1）,作为模板的,DNA,序列；（,2,）与被分离的目的基因两条链 各自,5,端序列相互补的,DNA,引物（,20,个左右碱基的短,DNA,单链）；（,3,）,TaqDNA,聚合酶；（,4,）,dNTP,（,dATP,dTTP,dGTP,和,dCTP,）。,聚合酶链式反应（,PCR,）,变性、退火、延伸三步曲,变性：,双链,DNA,解链成为单链,DNA,退火：,部分引物与模板的单链,DNA,的特定互补部位相配对和结合,延伸：,以目的基因为模板，合成互补的新,DNA,链,聚合酶链式反应（,PCR,）,每一轮聚合酶链式反应可使目的基因片段增加一倍,30,轮循环可获得,2,30,（,1.0710,9,),个基因片段,（,2,）构造重组,DNA,分子,载体与目的基因连接在一起形成重组,DNA,分子,。,载体有好几种，常用的有：,质粒,环状双链小分子,DNA,，适于做小片断基因的载体。,噬菌体,DNA,线状双链,DNA,，适于做大片断基因的载体。,载体,载体是运送目的基因片段进入宿主细胞的工具，目前最常用的载体包括细菌质粒、,l,噬菌体、,cosmid,质粒等。,质粒是细菌细胞中自然存在于染色体外可以自主复制的一段环状,DNA,分子。进入到宿主细胞中的一个质粒可以大量增加其拷贝数。,1,该质粒比较小，可以插入一段较长的,DNA,片段。,2,进入宿主细菌细胞后，,pUC18,在每个细胞中可复制形成大约,500,个拷贝。,3,在,pUC18,中有一小段人为设计和插入的具有多种限制性酶切位点的序列，即多克隆位点,细菌质粒,pUC18,基因克隆获得大量目的基因后，就要使其在合适的宿主细胞中表达，产生需要的基因表达产物或使宿主生物具备所需的性状，同时目的基因还能在宿主细胞中稳定遗传。这一过程就是,遗传转化,。,若受体细胞是细菌，通常称,转化,；若受体细胞是 动,/,植物细胞，通常称,转染,。,（,3),转化受体细胞和转化子的筛选,遗传转化常用的方法,载体法转化,感受态的制备和转化,农杆菌,Ti,质粒的介导法,基因的直接转移,（,1,）高压电脉冲电,激穿孔,（,2,）基因枪法,（,3,）微注射法,pUC18,质粒的多克隆位点整合在,lacZ,基因中，该位点如果没有插入外源目的基因，,lacZ,基因便可表达出,半乳糖苷酶，如果平板培养基中含有,IPTG,和,X-gal,，,X-gal,便会被,半乳糖苷酶水解成兰色，大肠杆菌形成蓝色克隆。,在多克隆位点插入外源目的基因，破坏了,lacZ,基因的结构，大肠杆菌形成白色的克隆,利用,lacZ,基因的插入失活筛选重组质粒,pUC18,还携带了氨卞青霉素抗性基因，可,筛选重组质粒。,（,4,）目的基因的表达,若需要让克隆的基因表达和产生大量编码蛋白，可对 转化的大肠杆菌进行培养使目的基因大量表达和积累。对表达产物分离纯化便可获得想要的产品。,通过,DNA,体外重组技术构建的重组质粒还可以直接用以转化宿主细胞，构建基因缺失的突变株。,生产基因工程产品的,生物反应器,以大肠杆菌为宿主菌进行基因的克隆,将目的基因克隆到大肠杆菌细胞中的操作步骤：,1,获得目的基因和质粒载体；,2,形成重组质粒；,3,制备感受态细胞，用重组质粒转化大肠杆菌细胞；,4,培养大肠杆菌，让重组质粒及外源目的基因形成大量拷贝；,5,筛选含重组质粒的大肠杆菌细胞，进行检查或鉴定。,2,、基因工程的应用,基因工程技术已经在医学、工业、农业等各个领域得到了广泛的应用。（,1,）在医学上的应用 基因工程被用于大量生产过去难以得到或几乎不可能得到的,蛋白质肽类药物,。,胰岛素,500 Kg,牛胰,10,克胰岛素,200,升发酵液,10,克胰岛素,干扰素,1200,升人血,2,3,万美元,/,病人,1,升发酵液,200,300,美元,/,病人,凝血因子,VIII,1000,升血浆,10,万单位,1,升（,12 mg,冻粉干）,10,万单位,（,2,）基因治疗,遗传病的基因治疗，通过基因工程手段，对患者的缺陷基因进行修复，达到根治遗传病的目的。,重症联合免疫缺陷症（,SCID,）（,1990,）腺苷酸脱氨酶,血友病,B,（,1991凝血因子,IX,病毒转染,获得正常基因,正常基因与病毒基因组融合,改组的细胞重新注入患者体内,（,3,）转基因动物和植物,转基因动物首先在,小鼠,获得成功。现在转基因动物技术已用于牛、羊，使得从 牛,/,羊 奶中可以生产蛋白质药物。称为,“,乳腺反应器,”,工程。,转基因植物,亦已在大田中广为播种。,转基因植物获得新的性状,金色水稻：合成类胡萝卜素,耐贮藏番茄：抑制乙烯合成,转基因大豆与非转基因大豆的比较,把大鼠生长因子转入小鼠,得到巨大型的转基因小鼠。,基因工程手段培育的蓝玫瑰,蓝玫瑰的培育过程,植物的色素决定花朵的颜色。当花色素是,花青素,衍生物时，花色偏,红,；当是,翠雀素,衍生物时，花色偏,蓝,。,翠雀素的合成需要有,3,个条件,：翠雀素合成基因；黄酮醇辅色素合成基因；液泡中相对高的,pH,值。,导入合成翠雀素和黄酮醇辅色素的相关基因于玫瑰品种中，使花色素合成途径趋向于生成蓝色翠雀素，并且设法导入能够提高花瓣表皮细胞液泡,pH,值的有关基因，成功培育出蓝玫瑰。,转基因技术在花卉育种中的应用,（,4,）,工程菌,在环境工程中应用,美国,GE,公司构造成功具有巨大烃类分解能力的工程菌，并获专利，用于清除石油污染。,喷洒工程菌清除石油污染,无冰晶细菌帮助草莓抗霜冻,