分子生物学癌基因与抑癌基因-1.ppt

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oncogene,v-onc,),。后来的研究发现，癌基因是基因组内正常存在的基因，是细胞内总体遗传物质的一部分，人们把这类存在于生物正常组织细胞基因组中的癌基因称为,原癌基因,（,protooncogenes,，,pro-onc,）或,细胞癌基因,（,cellular-oncogene,，,c-onc,），存在于病毒中的被称为,病毒癌基因,。,癌基因,(oncogene),及其表达产物是细胞正常生理功能的重要组成部分，癌基因所编码和表达的蛋白质在正常条件下并不具有致癌活性。,肿瘤细胞形态结构发生变化,培养中的正常的成纤维细胞呈扁平梭形（左），当这种细胞转化成癌细胞后就变成球形了（右）,。,一、细胞癌基因,细胞癌基因,(,cellular-oncogene,，,c-onc,),存在于生物正常细胞基因组中的癌基因（,c-onc,），在正常情况下处于静止或低水平表达状态，其表达产物参与调节正常细胞的生长与分化。由于细胞癌基因在正常细胞中以非激活的形式存在，不致癌，故又称,原癌基因,(proto-oncogenes,，,pro-onc),。,原癌基因,癌基因,细胞癌变,物理、化学、生物,突变、扩增、激活,被转导入反转录病毒而活化,病毒癌基因,v-con,广泛存在于生物界中；,基因序列高度保守；,作用通过其产物蛋白质来体现；,表达产物对正常细胞无害，而且对细胞正常生长、繁殖、发育和分化起精确调控。,在某些因素作用下被激活（基因结构或表达水平异常）后形成癌性的细胞转化基因。,细胞癌基因,/,原癌基因的特点,src,家族：,产物多具有酪氨酸蛋白激酶活性，能促进增殖信号的转导。,ras,家族：,编码小,G,蛋白,p21,，参与,cAMP,水平的调节。,myc,家族,：,编码核内,DNA,结合蛋白，调节其他基因转录的作用。,sis,家族：,编码的,p28,，能刺激间叶组织的细胞分裂繁殖。,myb,家族：,核内转录因子,细胞癌基因的分类及其产物,类别,癌基因名称,作用,生长因子类,SIS,PDGF-2,INT-2,FGF,同类物，促进细胞增殖,蛋白酪氨酸激酶类生长因子受体,EGFR,EGF,受体，促进细胞增殖,HER-2,EGF,受体类似物，促进细胞增殖,FMS,、,KIT,M-CSF,受体、,SCF,受体，促增殖,膜结合的蛋白酪氨酸激酶,SRC,、,ABL,与受体结合转导信号,细胞内蛋白酪氨酸激酶,TRK,在细胞内转导信号,细胞内蛋白丝,/,苏氨酸激酶,RAF,MAPK,通路中的重要分子,与膜结合的,GTP,结合蛋白,RAS,MAPK,通路中的重要分子,核内转录因子,MYC,促进增殖相关基因表达,FOS,、,JUN,促进增殖相关基因表达,人体内细胞癌基因的分类及功能举例,癌基因最早发现于逆转录病毒中。,1911,年，,F.Rous,医生首次提出病毒引起肿瘤，但直到上一世纪,50,年代才得到实验证实，命名为罗氏肉瘤病毒（,Rous Sarcoma Virus,，,RSV,）。,二、病毒癌基因,一类能使敏感宿主细胞产生肿瘤或者使培养细胞转化成癌细胞的动物病毒。,肿瘤病毒有,DNA,病毒和,RNA,病毒之分。,病毒癌基因最初发现于,RNA,病毒（鸡,Rous,肉瘤病毒）,肿瘤病毒,存在于肿瘤病毒（多数属于逆转录病毒）基因组中，可以使靶细胞发生恶性转化的基因。,目前已发现的病毒癌基因有,30,多种，主要是,RNA,病毒，大多数是逆转录病毒。也可以是,DNA,病毒，如乙型肝炎病毒。,病毒癌基因,(virus oncogene,v-onc),存在于病毒（,DNA,肿瘤病毒或,RNA,反转录病毒）基因组中的癌基因，通常不编码病毒的结构成分，对病毒复制也没有作用，但可以使细胞持续增殖，从而导致宿主细胞发生恶性转化。,如，最早鉴定的禽类肉瘤病毒,(RSV),基因组中的,src,基因,调节和,启动转录,LTR,gag,pol,env,src,LTR,长末端,重复序列,癌基因,正常的病毒基因,病毒,核心蛋白,逆转录,酶和整合酶,病毒,外膜蛋白,酪氨酸,蛋白激酶,禽肉瘤病毒,(RSV),基因组,结构,促进增殖信号的转导，细胞恶化,病毒复制所需要,病毒癌基因,v-src,来源于宿主细胞的,C-SRC,基因,RNA,病毒和宿主细胞基因组整合过程示意图,v-onc,c-onc,病毒（,RNA,）,RNA,DNA,（逆转录酶）,DNA,（前病毒）,DNA,RNA,病毒粒子,新,RNA,病毒粒子,宿主细胞,细胞癌基因,宿主细胞的细胞癌基因导入,RSV,基因组内，使,RSV,转变为携带,src,基因的病毒，获,得致癌能力。虽然病毒癌基因来源于宿主细胞，但整合过程中，其结构发生变化,（内含子缺失、编码区截短、突变），病毒癌基因对细胞的恶性转化明显强于细,胞中的原癌基因。,正常宿主细胞,存在在,scr,基因,无癌基因的,RSV,细胞癌基因与病毒癌基因的差,别,1、病毒癌基因没有内含子,；,2、病毒癌基因编码序列有点突变或缺失突变,；,3、病毒癌基因表达的蛋白质有较强的细胞转化活性,；,4,、,细胞原癌基因的产物正性调节细胞增殖,。,三、癌基因活化的机制,癌细胞基因在物理、化学因素的作用下,发生突变，表达产物的,质和量,的变化、表达方式在,时间及空间,上的改变，都有可能使细胞脱离正常的信号控制，获得不受控制的,异常增殖,能力而发生恶性转化。从正常的原癌基因转变为具有使细胞转化功能的癌基因的过程，称,原癌基因的活化,，是功能获得的过程。,通常情况下，原癌基因是细胞正常生长分裂、生长和增殖所必需的，只不过其表达受到细胞的严格控制。,（,1,）,基因低甲基化修饰,（,2,基因扩增,（,3,）染色体易位,（,4,）,DNA,重排,（,5,）病毒基因启动子与增强子的插入,（,6,）点突变,（,7,）癌基因的协同作用,癌基因激活的方式,（一）基因低甲基化修饰,DNA,分子中碱基的甲基化修饰状态在真核基因表达调控中发挥重要作用。,真核细胞中,胞嘧啶,C,常被甲基化修饰成,5-,甲基胞嘧啶,，发生在基因转录调控区的,CpG,富集区（,CpG,岛,）。通常甲基化水平与基因表达程度呈,反比,，处于转录激活状态的基因,CpG,岛一般,低,甲基化修饰。在肿瘤细胞中发现癌基因的低甲基化或去甲基化可导致癌基因的大量表达，如胃癌细胞中的,c-H-ras,癌基因的低甲基化可导致其过度表达，是细胞癌变的一个重要特征。,（二）基因扩增,（,gene amplification),指基因组上个别基因的额外复制。,在,许多转化细胞和肿瘤细胞中，可见原癌因扩增现象。发生扩增的机制目前不清。,基因扩增常见于实体瘤，在肿瘤细胞中,基因扩增涉及的癌基因主要有,c-myc,c-abl,N-ras,及,neu,等。,原癌基因数量的增加或表达活性的增强，产生过量的表达蛋白质。,肿瘤扩增可能预示肿瘤演进的改变或是癌变的晚期，代表该肿瘤自主性和侵袭性的增强，故对其检测可能有助于预后的判断。,逆转录病毒基因组中的长末端重复序列,（,LTR,）,内含较强的启动子或增强子，感染细胞时，,LTR,可随机整合到宿主细胞的基因组中，如果病毒,LTR,恰好整合到细胞原癌基因附近或内部，则,LTR,所含的强启动子或增强子可启动或促进原癌基因的过度表达，导致细胞癌变。,（三）获得启动子与增强子,1,、启动子插入,2,、增强子插入,（四）染色体易位,（,chromosome translocation,）,染色体的一部分基因断裂脱离，并与其他染色体连接的重排过程。,在染色体易位的过程中发生了某些基因的易位和重排，使原来无活性的原癌基因转位至强的启动子或增强子附近而被活化，原癌基因表达增强，导致肿瘤的发生。,使原来无活性的原癌基因移至某些强的启动基因或增强子附近而被活化。,肿瘤细胞中的染色体是不正常的。肿瘤细胞中常见的染色体异常是易位。,染色体易位,是指一条染色体的某一片段断下之后再连接到另一条染色体上。,例如,：正常细胞中,c-myc,基因在转录水平上是低水平的，而易位的,c-myc,则转录频率升高，导致癌变。,急性髓系白血病,(AML),患者,6;9,染色体易位,DEK-CAN,融合基因表达。,4,例急性髓系白血病患者为,t(6;9)(p23;q34),易位；,4,例初诊、再发及完全缓解期患者均不同程度检出,DEK-CAN,融合基因，占,100%,；,DEK-CAN,基因是,AML,发病的分子基础，检测,DEK-CAN,融合基因对于,AML,的诊断、疗效观察及预后判断有重要意义。,（五）点突变,（,point mutation,）,原癌基因在射线或化学致癌剂作用下，可能发生点突变，导致编码蛋白中单个氨基酸的替换，改变了蛋白质的氨基酸组成，造成蛋白质结构和功能异常，活性改变。,30%,的肿瘤组织都带有,ras,基因家族（,H-ras,、,K-ras,、,N-ras,）的点突变，从各种不同的人类肿瘤细胞系分离到的,ras,癌基因中，,c-ras,原癌基因都是由一个单碱基突变而激活成癌基因的。,例如，正常,H-ras,中的第,12,号密码子为,GGC,，从各种不同的人类肿瘤细胞系分离到的,ras,癌基因中，,c-ras,原癌基因都是由一个单碱基突变而激活成癌基因的。,癌基因活化的,4,种机制示意图,核内癌基因易与胞浆癌基因产物发生协同作用,(,前者使细胞永生,后者改变细胞形态,降低对生长因子和贴壁的要求,).,如,myc,与,ras,协同致癌,癌基因的激活与抑癌基因的失活协同致癌,（六）癌基因的协同作用,癌基因的活化是肿瘤发生过程中的关键步骤，不同的癌基因在不同的情况下，可通过不同的途径被激活。一种癌基因在同一癌变过程中可通过不同 的机制活化，同一个致癌因素可通过不同的方式、不同的致癌因素可通过现一种方式来激活癌基因，因此癌基因激活是个复杂、相互协调的过程，癌基因被激活的结果可能是：,出现新的表达产物,出现过量的正常表达产物,出现异常、截短的表达产物,癌基因被激活的结果,癌基因编码的蛋白质称为,癌蛋白,，癌基因的生,物学功能即是由癌蛋白执行的。,癌,蛋白,多数是作为传递生长信号的因子参与肿瘤细胞增殖过程。,四、原癌基因的产物与功能,癌基因编码的蛋白质与细胞生长调控的许多因子有关，参与细胞生长、增殖、分化途径各个环节的调控，依据其在细胞信号转导途径中的作用分为以下几类：,癌蛋白的分类,作用于,细胞膜上的受体系统,或,直接被传递至细胞内,，通过蛋白激酶活化转录因子，引发一系列基因的转录激活。,sis,表达蛋白,P28,和,PDGF,一样能促进血管的生长。,（一）细胞外生长因子,例如：,（二）跨膜的生长因子受体：,接受细胞外的生长信号并将其传入胞内。,受体的胞质结构区具有特异的蛋白激酶活性，通过磷酸化作用使其结构发生改变，增加激酶对底物的活性，促进生长信号在胞内的传递。,例如,c-src,、,c-abl,有酪氨酸特异的蛋白激酶活性。,c-mos,和,raf,所编码的激酶使丝氨酸和苏氨酸残基磷酸化。,非受体酪氨酸激酶,(src,，,abl),、丝氨酸,/,苏氨酸激酶,(raf),，,ras,蛋白,(H-ras,，,K-ras,和,N-ras),及磷脂酶,(crk,产物,),。,（三）细胞内信号传导分子,原癌基因的产物,作为胞内信息传递体系成员，或者通过影响第二信使作用，,将接受到的信号由胞内传至核内，促进细胞生长。,例如：,（四）核内转录因子,某些癌基因表达蛋白定位于细胞核内，,与靶基因的顺式调控元件相结合,直接调节靶基因的转录活性。,例如：,c-fos,是一种即刻早期反应基因,(immediate early gene,，,IEG),。作为传递信息的第三信使。,主要介绍几种结构及功能了解较为清楚的癌基因。,1,、,sis,等生长因子类癌基因,v-sis,首先发现于猿猴肉瘤病毒中，,sis,基因的蛋白产物位于细胞质，分子量为,28kD,，称为,p28,sis,它与血小板源性生长因子,链具有同源性,。,几种癌基因的特性及其作用,如果,PDGF,被不断产生，则细胞即可持续分裂，所以,sis,癌基因产物可以通过,自分泌或旁分泌,的形式刺激自身或其邻近细胞的,分裂增殖。,erbB,原癌基因产物是分子量为,170kD,的糖蛋白，由,配体结合区，跨膜区,及,酪氨酸蛋白激酶区,三个结构域组成。,、,erbB,等生长因子受体类癌基因,ras,基因家族包括三个相关的成员：,K-ras,、,H-ras,和,N-ras,。,c-ras,及,v-ras,基因产物分子量为,21kD,，称为,p21,ras,。,p21,蛋白有结合,GTP,和,GTP,酶活性。,p21,与其他,G,蛋白具有同源性，它们在信号转导过程中发挥作用。,ras,原癌基因的激活主要是通过点突变及过量表达方式。,、,ras,及,src,等信号转导因子类癌基因,src,基因首先是从禽类,Rous,肉瘤病毒中分离得到的。,v-src,基因产物为分子量,60kD,的磷蛋白，称为,pp60,v-src,它是逆转录病毒从宿主细胞中转导而来的。,c-src,基因编码的蛋白质亦为分子量为,60kD,的磷蛋白，称为,pp60,c-src,。二者具有很高的同源性。,src,基因产物酪氨酸蛋白激酶活性表现之一为肌醇磷脂激酶活性催化底物产生第二信使分子如,DG,和,IP,3,参与生长因子信号转导。,、,myc,等核转录因子类癌基因,myc,基因家族包括三个成员：,c-myc,、,N-myc,、,L-myc,，,三者之间具有很高的同源性，编码的蛋白质亦具有相似的生物学作用。,myc,基因产物与另一反式作用因子,Max(21kD),结合形成复合物，,与,DNA,结合，,调节下游基因的表达以刺激细胞分裂或抑制细胞的终末分化。,细胞外生长因子,跨膜的生长因子受体,细胞内信号传导体,核内转录因子,原癌基因,BRAF,所编码的蛋白质属于丝,/,苏氨酸激酶，是,MAPK,信号通路的重要组成分子，在调控细胞增殖、分化等方面发挥重要作用。,五、癌基因表达产物促进肿瘤发生发展,约,60%,的黑素瘤中,BRAF,发生突变，其第,600,位氨基酸从缬氨酸突变为谷氨酸（,V600E,）最为常见，导致,B-Raf,的持续激活。,（一）,BRAF,例如：,HER2,是表皮生长因子受体家族成员，具有蛋白酪氨酸激酶活性，能激活下游信号通路，从而促进细胞增殖和抑制细胞凋亡。,在,30%,的乳腺癌中,HER2,基因发生扩增或者过度表达，其表达水平与治疗后复发率和不良预后显著相关。,（二）,HER2,例如：,慢性粒细胞白血病患者的,9,号染色体与,22,号染色体之间发生易位，从而融合产生了癌基因,BCR-ABL,，编码的蛋白质,Bcr-Abl,具有持续活化的蛋白酪氨酸激酶活性，能促进细胞增殖，并增加基因组的不稳定性。,在,95%,的慢性粒细胞白血病患者中都伴随有,BCR-ABL,融合基因的产生，在一些急性淋巴白血病患者中也有发现。,（三）,BCR-ABL,例如：,第 二 节,抑 癌 基 因,Anti-oncogenes,肿瘤抑制基因,(tumor suppressor gene),一、肿瘤抑制基因的概念,抑癌基因也称肿瘤抑制基因或抗癌基因（,anticancer gene,）或抑癌基因（,Anti-oncogenes,），,是调节细胞正常生长和增殖的基因。当这些基因不能表达，或者当它们的产物失去活性时，细胞就会异常生长和增殖，最终导致细胞癌变。反之，若导入或激活它则可抑制细胞的恶性表型。,抑癌基因,(cancer suppressive gene,anti-oncogene),抑制细胞过度生长、增殖从而遏制肿瘤形成的基因。,早在,20,世纪,20,年代，,T.Boveri,就提出正常细胞中存在特异的抑制细胞增殖的因素，并假定与染色体有关,肿瘤细胞因失去某种抑制性染色体而能无限增殖。,20,世纪,60,年代，,H.Harris,开创了杂合细胞的致癌性研究,A.Knudson,在研究视网膜母细胞瘤（,retinoblastoma,，,Rb,）的流行病学中发现,RB,基因,二、抑癌基因的发现,杂合细胞的致癌性研究,将小鼠的恶性肿瘤细胞与正常细胞杂交融合，得到杂合细胞，失去恶性表型；,将杂交细胞接种在动物体内，不产生肿瘤；,导入正常细胞染色体的肿瘤细胞接种动物，通常不产生肿瘤,提示正常细胞中有抑制肿瘤的基因，即肿瘤抵制基因！,二次打击学说,家族性,Rb,患者的肿瘤常在婴幼儿,早发,，且双侧多发性（散发患者刚发病较晚，且单发），遗传性和散发性的肿瘤都与,RB,基因的失活有关。,早发性患者从父母获得的一对等位,RB,基因，一个是正常（野生型）基因，另一个是的，如野生型,RB,基因再发生突变失活，其功能就会全部丧失，导致早期发生,Bb.,散发性患者从父母获得的一对等位,RB,基因都是正常的，只有它们各自都突变失活，才可能使,RB,基因的功能丧失，肿瘤发生较晚。,据此提出,“,二次打击学说，即肿瘤的发生需要该基因位点发生两次突变,”,细胞杂交试验,正常细胞,肿瘤细胞,非肿瘤型杂交细胞,杂交融合,肿瘤细胞,1,肿瘤细胞,2,杂交融合,非肿瘤型杂交细胞,正常细胞,失去某些基因,肿瘤细胞,抑癌基因编码产物的功能主要有诱导细胞分化、维持基因稳定、触发或诱导细胞凋亡等。总体上抑癌基因对生长起负调控作用，能抑制细胞的恶性生长。目前公认的肿瘤抑制基因有,10,余种，抑癌基因的变异构成某些共同的致癌途径。已鉴定的一些抑癌基因产物及功能如下：,三、常见抑癌基因及其功能,名称,染色体定位,相关肿瘤,编码产物及功能,TP53,17p13.1,多种肿瘤,转录因子,p53,，细胞周期负调节和,DNA,损伤后凋亡,RB,13q14.2,Rb,、骨肉瘤,转录因子,p105 Rb,PTEN,10q23.3,胶质瘤、膀胱癌、前列腺癌、子宫内膜癌,磷脂类信使的去磷酸化，抑制,PI3K-Akt,通路,P16,9p21,肺癌、乳腺癌、胰腺癌、食道癌、黑素瘤,p16,蛋白，细胞周期检查点负调节,P21,6p21,前列腺癌,抑制,Cdk1,、,2,、,4,和,6,APC,5q22.2,结肠癌、胃癌等,G,蛋白，细胞粘附与信号转导,DCC,18q21,结肠癌,表面糖蛋白（细胞黏附分子）,NF1,7q12.2,神经纤维瘤,GTP,酶激活剂,NF2,22q12.2,神经鞘膜瘤、脑膜瘤,连接膜与细胞骨架的蛋白,VHL,3p25.3,小细胞肺癌、宫颈癌、肾癌,转录调节蛋白,WT1,11p13,肾母细胞瘤,转录因子,常见抑癌基因及其功能,名称,相关肿瘤,TP53,tumor protein p53,肿瘤蛋白,p53,RB,PTEN,P16,P21,APC,adenomatous polyposis,多发性,结肠腺癌,DCC,Deleted in colorectal carcinoma,结肠癌缺失基因,NF1,neurofibromatosis,神经纤维瘤,NF2,VHL,Von Hippel-Lindau,综合征，血管母细胞瘤合并肾或胰腺等多种肿瘤,WT1,Wilms tumor,威尔姆肿瘤,常见抑癌基因及其功能,四、抑癌基因失活的机制,（一）基因高甲基化修饰,近年表观遗传学研究表明，,DNA,甲基化修饰在真核基因的转录调控中发挥重要作用，主要由甲基化酶和去甲基化酶调节。,抑癌基因,启动子区,CpG,岛高甲基化,修饰，阻碍转录因子蛋白与启动子结合，不能形成转录复合体，从而影响基因转录活性。,（一）基因高甲基化修饰,在许多肿瘤中常检测到,p16,、,p53,、,BRCA-1,、,VHL,等抑癌基因启动子区,CpG,岛高甲基化修饰变化，而且往往是肿瘤发生的早期事件。,如，约,70%,的散发性肾癌患者中，因启动子的甲基化而存在,VHL,的失活。,启动子区的高甲基化可使,p16,表达水平降低，导致细胞周期异常从而促进细胞增殖。,人类体细胞属于二倍体细胞，其基因组的大多数区域是杂合的，即这些区域往往含有两个不同的等位基因（父母各一个）。,某些情况下，会丢失等位基因的一个拷贝，从而丧失其杂合性，该现象称杂合性缺失loss of heterozygosity,LOH,）。,LOH,是肿瘤细胞中常见的异常遗传现象，发生杂合缺失的区域往往是抑癌基因所在的区域。如,Rb,（二）杂合性缺失,两个等位基因纯合性缺失不可能表达相应的蛋白质。,（三）纯合性缺失,（四）基因突变,基因突变是导致抑癌基因失活，甚至转变为癌基因的主要机制之一。,抑癌基因在细胞增殖、生长、分化过程中发挥重要作用，其功能缺失会导致肿瘤等相关疾病的发生。以,TP53,、,RB,、,PTEN,三个肿瘤抑制基因为例说明：,五、抑癌基因失活与肿瘤,Rb,基因（人视网膜母细胞瘤易感基因，,retinoblastoma susceptibility gene,基因,是第一个被克隆和完成全序列测定的抑癌基因。它控制许多肿瘤的遗传易感性，最明显的是视网膜母细胞瘤，（小细胞肺癌、乳腺癌、膀胱癌和前列腺癌中都发现有,Rb,基因）,Rb,基因位于人类染色体,13q14.12,，含有,27,个外显子全长,180388bp,，其,mRNA,长度为,4.7kb,，编码的蛋白质属于,磷蛋白,，分子量,105000,。,Rb,蛋白的磷酸化状态及其与其他蛋白质结合，与它的功能密切相关。,（一）视网膜母细胞瘤基因（,Rb,基因）,磷酸化的,Rb,（,pRb,）蛋白是一种核磷蛋白，位于核内，为,DNA,结合蛋白，作为转录因子调节基因转录。,磷酸化和去磷酸化是调节,Rb,蛋白活性的重要形式，其磷酸化程序在细胞周期中发生周期性变化：,G,0,、,G,1,期,:Rb,蛋白,去磷酸化,/,低磷酸化,(,为,活性型，能促进细胞分化，抑制细胞增殖,),；,G,2,、,S,期,、,M,期,:Rb,蛋白磷酸化。,调节,Rb,蛋白磷酸化状态重要的过程是发生在,G,1,/S,期,交界处。,磷酸化和去磷酸化是调节,Rb,蛋白活性的重要形式，其磷酸化程序在细胞周期中发生周期性变化：,Rb,磷酸化的程度，受细胞周期中增殖调控蛋白（细胞周期蛋白,cyclin,、细胞周期蛋白依赖性激酶,cyclin-dependent kinase,CDK),的直接控制。,G,0,、,G,1,期,:Rb,蛋白,去磷酸化,/,低磷酸化,(,为,活性型，能促进细胞分化，抑制细胞增殖,),；,G,2,、,S,期,、,M,期,:Rb,蛋白磷酸化。,调节,Rb,蛋白磷酸化状态重要的过程是发生在,G,1,/S,期,交界处。,G,0,G,1,期,Rb,蛋白,E-2F,S,期,E-2F,DNA,mRNA,DNA,P,Rb,蛋白,低磷酸化的,Rb,在,G1,期,特异的磷酸化，是细胞,从,G1,期进入,S,期的关键。,细胞进入,G,1,期时,Rb,蛋白处于低磷酸化状态，使细胞不能通过,G,1,S,期关卡。,低磷酸化,Rb,蛋白对,G,1,期,S,期的负调节作用，是通过与转录因子,E,2,F,结合而实现的。,在细胞增殖信号通过依赖于,cyclinD1,的激酶,CDK4,的活化，导致,Rb,磷酸化，高磷酸化的,Rb,不能与,E,2,F,结合，,E,2,F,启动基因转录，促进细胞,G,1,S,转化。,Rb,蛋白分子量为,110kD,，称为,p110,Rb,，,Rb,蛋白的磷酸化水平对其功能具有重要影响，且与细胞周期密切相关。在,G,1,/S,期，,Rb,表达增高并从,非磷酸化状态,转化为,磷酸化状态,，,前者可,阻断细胞进入期,，后者则失去这种作用。,视网膜母细胞瘤中发现有,Rb,基因的失活。,野生型,Rb,基因导入,Rb,肿瘤细胞可抑制其在裸鼠中的致癌能力。表明其有抑癌作用。,在,G,1,期,低磷酸化,的,Rb,与,E2F,形成蛋白复合物，抑制,E2F,的转录激活性，阻止,E2F,启动的基因转录，造成,S,期必需的基因产物（如，二氢叶酸还原酶、胸苷激酶、,DNA,聚合酶等）合成受阻，细胞周期的进展受到抑制，从而抑制细胞增殖。,高磷酸化的,Rb,不能与,E2F,结合，,E2F,启动基因转录，促进细胞,G,1,S,转化。,Rb,磷酸化与细胞周期控制,G,1,-S,限制点,p53,基因是人类恶性肿瘤中最常涉及到的抑癌基因，与人类肿瘤相关性最高，其功能与细胞周期的控制有密切关系。,p53,基因定位于人类染色体,17p13.1,，全长,16-20kb,，由,11,个外显子及,10,个内含子组成。,野生型,p53,蛋白质在维持细胞正常生长、抵制恶性增殖中起着重要作用，因此称“基因卫士”。,正常情况下，野生型,p53,蛋白含量低，半衰期短（易被蛋白酶水解），不易检测出来，但在细胞增殖与生长时，可升高,5-100,倍以上。,（二）野生,P53,蛋白,基因卫士,人野生型,p53,蛋白属核内磷蛋白，由,393,个氨基酸残基组成，在体内以,四聚体,形式存在，分子量为,53kD,，含有三个结构域：,N,端酸性区：,第,1-80,位,aa,残基组成，含有一些特殊的磷酸化位点。,具有反式作用因子活性；,中段核心区：,第,102-290,位,aa,残基组成,包含能结合,DNA,的特异性氨基酸序列；,该区在进化上高度保守，乃突变热点，与突变型,p53,蛋白的致癌作用有关；,C,端碱性区：,第,319-393,位,aa,残基组成,可独立发挥转化活性，起癌基因作用。多个磷酸化位点可被多种蛋白激酶识别。,具有核定位功能，且可与特异性,DNA,序列结合。,野生,P53,蛋白,p53,在细胞内监控着染色体,DNA,的完整性，一旦,DNA,遭到损害，,p53,立即与特定的,DNA,序列结合，起,转录因子,的作用，激活,p21,等相关基因转录，使细胞停滞于,G,1,期。,抑制,解链酶,的活性，并与复制因子,A(replication factor A),相互作用，参与,DNA,的,复制与修复,。,若修复失败，p53,启动凋亡,过程，诱导细胞自杀，阻止有癌变倾向的突变细胞的生成，从而防止细胞恶变。,P53,蛋白,解链酶,复制因子,A,P21,蛋白,细胞停滞于,G,1,期,细胞调亡,酸性区,核心区,碱性区,P53,蛋白,DNA,损伤,P21,基因,P53,蛋白,抑 制,P53,蛋白,成功修复,修复失败,如果,DNA,损伤较为严重而细胞修复机制难以将其修复时，,p53,则通过,细胞凋亡,途径清除受损的细胞，维持基因组的稳定。,估计约有,50%,的人类肿瘤中具有,p53,基因的突变，突变形式包括,点突变、缺失、插入以及重排,。,突变型,p53,蛋白各不相同，它们与野生型,p53,蛋白在构型，细胞内定位以及转化潜力方面亦均有差异。,突变型,p53,蛋白半衰期明显延长，肿瘤细胞中,p53,蛋白含量明显增加，甚至可增加,100,倍。,在肿瘤组织中应用免疫组织化学的方法检出,p53,蛋白的存在，可能具有诊断及估计预后的价值。,肿瘤细胞中,p53,基因突变,突变型,p53,蛋白丧失与癌蛋白结合的能力，从而使癌蛋白得以发挥致癌作用。,突变型,p53,基因可能通过如下两种模式导致肿瘤发生：,显性致癌模式：,突变型,p53,蛋白丧失原有功能，而获得增殖、转化及致癌的能力。,推测这些突变体具有协助其他癌基因如,ras,的,致癌作用,。,、,p53,基因突变与肿瘤的发生,突变型,p53,基因产物与野生型,p53基因产物通过,蛋白质蛋白质,结合方式形成无功能的,异源二聚体,。,显性阴性致癌模式：,P53,蛋白,解链酶,复制因子,A,P21,蛋白,细胞停滞于,G,1,期,细胞调亡,酸性区,核心区,碱性区,P53,蛋白,DNA,损伤,P21,基因,P53,蛋白,抑 制,P53,蛋白,成功修复,修复失败,（二）,P53,蛋白,基因卫士,p53,的结构及其在清除,DNA,损伤细胞中的作用,P53,基因突变,不仅失去野生型,p53,抑制肿瘤增殖的作用，而且突变本身又使该基因具备癌基因功能。,突变的,P53,蛋白与野生型,P53,蛋白相结合，形成的这种寡聚蛋白不能结合,DNA,，使得一些癌变基因转录失控导致肿瘤发生。,（三）,PTEN,PTEN,基因（,phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,，第,10,号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因）是继,TP53,基因后发现的另一个与肿瘤发生关系密切的肿瘤抑制基因。,PTEN,通过阻断,PI3K/AKT,信号通路抑制细胞的生长,六、肿瘤抑制基因与疾病,RB,APC,VHL,肿瘤抑制基因在细胞增殖、生长、分化过程中发挥重要作用，其功能缺失会导致肿瘤等相关疾病的发生，研究肿瘤抑制基因发挥作用的相关分子机制能够为分子靶向治疗策略提供理论依据，也为攻克癌症等顽疾带来曙光。,、癌基因与肿瘤抑制基因在肿瘤发生中的作用特点,在基因水平上，或通过外界致癌因素，或由于细胞内环境的恶化，突变基因数目增多，基因组变异逐步扩大；,在细胞水平上则要经过永生化、分化逆转、转化等多个阶段，细胞周期失控细胞的生长特性逐步得到强化。,结果组织从增生、异型变、良性肿瘤、原位癌发展到浸润癌和转移癌。,（一）细胞癌变的多基因协同,从基因角度认识结肠癌的发生和发展,（二）细胞周期和细胞凋亡的分子调控是肿瘤进展的关键,癌基因和肿瘤抑制基因与细胞周期,细胞周期调控体现在细胞周期驱动和细胞周期监控两个方面，后者的失控与肿瘤发生发展的关系最为密切。细胞周期监测机制由,DNA,损伤感应机制、细胞生长停滞机制、,DNA,修复机制和细胞命运决定机制等构成。,癌基因、肿瘤抑制基因与细胞凋亡,细胞除了生长、增生和分化等现象之外，还存在细胞死亡现象，即程序性细胞死亡或凋亡。有些肿瘤抑制基因的过量表达可诱导细胞发生凋亡，而与细胞生存相关的癌基因的激活则可抑制凋亡，细胞凋亡异常与肿瘤的发生发展的密切相关。,促进正常细胞向肿瘤细胞转化的因素,第 三 节,生 长 因 子,Growth factors,生长因子,(growth factor),通过质膜上特异的受体，将信息传递至细胞内部，调节细胞生长与增殖的多肽类物质。,一、概述,作用模式,内分泌,(endocrine),旁分泌,(paracrine),自分泌,(autocrine),产生相应第二信使,胞内相关蛋白质被磷酸化,与,膜受体,结合,酪氨酸激酶活化,蛋白激酶活化,核内转录因子活化,基因转录,与,胞内受体,结合,生长因子,受体复合物,二、生长因子作用机制,活化相关基因,在某些生理或病理条下，细胞接受到某种 信号所触发的并按一定程序缓慢死亡的过程。,诱导因素：,野生型,p53,基因,抑制因素：,突变型,p53,基因,神经生长因子,(NGF),三、生长因子与疾病,（一）细胞凋亡,细胞凋亡,(apoptosis),1.,原发性高血压,myc,、,fos,的激活促平滑肌细胞增生,p53,低表达或突变,2.,动脉粥样硬化,PDGF,过量产生,3.,心肌肥厚,ras,、,myb,、,myc,、,fos,等过量表达,IGF,、,TGF,、,FGF,（二）心血管疾病,具有生长因子功能的癌蛋白：,肿,瘤细胞通过这种自身分泌生长因子的方式刺激自身的分裂和增殖。,具有生长因子受体功能的癌蛋白：,生,长因子受体是细胞接受外界信号的,特异性感受器,，生长因子与其相应的受体结合后方可发挥作用，促进基因的表达或细胞的增殖。,具有酪氨酸蛋白激酶活性的癌蛋白：,酪,氨酸蛋白激酶的作用是使蛋白质中酪氨酸残基磷酸化。,磷酸化与脱磷酸化,对细胞功能的调节发挥重要作用，细胞内酪氨酸蛋白激酶的活力与细胞的增殖分裂密切相关。,属于核内蛋白的癌蛋白：,该类癌基因包括,c-myc,、,c-fos,c-jun,、,c-myb,等，其产物具有,DNA,结合能力，可以作为反式作用因子与,DNA,靶序列结合，调节基因表达。,属于,GTP,结合蛋白的癌蛋白：,此类癌基因主要是,ras,基因家族,，其产物分子量为,21kD,，能特异性与,GTP,结合并具有,GTP,酶,活性。其功能与,信息传递,有关。,生长因子,Growth factors,第三节,生长因子,(growth factor),一类由细胞分泌的、类似于激素的信号分子，多数为肽类（含蛋白类）物质，具有调节,细胞生长与分化,的作用。,内分泌,(endocrine),旁分泌,(paracrine),自分泌,(autocrine),作用模式,：,一、生长因子的分类和功能,（一）生长因子的分类,生长因子名称,组织来源,功能,表皮生长因子（,EGF,）,唾液腺、巨噬细胞、血小板等,促进表皮与上皮细胞的生长，尤其是消化道上皮细胞的增殖,肝细胞生长因子（,HGF,）,间质细胞,促进细胞分化和细胞迁移,促红细胞生成素（,EPO,）,肾,调节成红细胞的发育,类胰岛素生长因子（,IGF,）,血清,促进硫酸盐参入到软骨组织促进软骨细胞的分裂、对多种组织细胞起胰岛素样作用,神经生长因子（,NGF,）,颌下腺含量高,营养交感和某些感觉神经元、防止神经元退化,血小板源生长因子（,PDGF,）,血小板、平滑肌细胞,促进间质及胶质细胞的生长、促进血管生成,转化生长因子,（,TGF-,）,肿瘤细胞、巨噬细胞、神经细胞,作用类似于,EGF,，促进细胞恶性转化,转化生长因子,（,TGF-,）,肾、血小板,对某些细胞起促进和抑制双向作用,血管内皮生长因子（,VEGF,）,低氧应激细胞,促进血管内皮增殖和新生血管分化,（二）生长因子的功能,生长因子的生物学效应主要表现在促进细胞生长、分化、促进个体发育等方面。但是有些生长因子具有双重调节作用或负调节作用。,同一生长因子对不同细胞的作用有所不同,一种细胞也可受不同生长因子调节,具有负调节作用的生长因子比较少，人们通常把这种负调节因子（,negative growth factor,）称为细胞生长抑制因子产生相应第二信使,胞内相关蛋白质被磷酸化,与,膜受体,结合,酪氨酸激酶活化,蛋白激酶活化,核内转录因子活化,基因转录,与,胞内受体,结合,生长因子,-,受体复合物，活化相关基因,二、生长因子作用机制,肿瘤的发生除了与癌基因的异常活化以及肿瘤抑制基因的异常失活密切相关外，其与生长因子及其受体的高度活化亦紧密相关，如,EGF,、,VEGF,、,TNF,及,IGF,、,PDGF,等的过度表达能导致相应的肿瘤发生。,三、生长因子与疾病,（一）生长因子与肿瘤,myc,、,fos,的激活促平滑肌细胞增生；,p53,低表达或突变。,2.,动脉粥样硬化：,PDGF,过量产生,ras,、,myb,、,myc