分子生物学-5.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第四节 突变类型,第五节 回复突变(抑制突变),第六节 突变剂和突变生成,概述：损伤因素及其类型,第一节 复制过程中的错配修复,第二节 损伤修复,第三节 限制和修饰,引起损伤的因素:,自发性损伤,(复制,中的损伤、碱基的自发性化学改变、,自发脱碱基、细胞的代谢产物对DNA的损伤),物理因素引起的损伤,(电离辐射、紫外线),化学因素引起的损伤,（烷化剂、碱基类似物）,引起损伤的类型：,碱基脱落、碱基（或核苷）改变、错误碱基（碱基的取,代）、碱基的插入或缺失、链的断裂、链交联（链内、链,间）、,嘧啶二聚体,等等,广义的修复系统：,DNA聚合酶的校对功能(,复制的范畴,),尿嘧啶-N-糖苷酶修复系统,（复制时U的渗入、C脱氨氧化成U）,错配修复系统,损伤修复系统(光复活、重组修复、SOS修复等),限制修饰系统-对付外源DNA的入侵,2、错配修复系统（Mismatch repair system）,DNA polymerase,Helicase SSB 外切核酸酶(,和,)连接酶,MCE,(mismatch correct enzyme),3 subunits,mutH,L,S,dam gene,DNA腺嘌呤甲基化酶(,m,6,A甲基化酶,),扫描新生链中错配碱基,识别新生链中非 m,6,A 的GATC序列,酶切含错配碱基的新生DNA区段,（1）组成,DNA合成过程中的甲基化变化,DNA中的,GATC(palindromic seq,.),为m,6,A甲基化敏感位点,平均每2kb左右有一,GATC,seq.,错配修复系统受甲基化的引导,甲基化程度的差异,a、MutH/MutS,扫描识别错配,碱基和邻近的,GATC,序列,切点甲基化,GATC中,G的5侧,DNA helicase II,SSB,exonuclease I,去除包括错,配碱基的片段,DNA polymerase III 和,DNA ligase 填充缺口,昂贵的代价用于保证DNA的准确性,（2）修复过程,外切核酸酶切割切点的5端（错配碱基在切点的5端）,-3端（-3端）,3、尿嘧啶-N-糖苷酶系统(,ung system,),修复尿嘧啶的来源：dUTP的渗入,胞嘧啶的自发脱氨氧化,-TAGC-,-ATCG-,-TAGC-,-A CG-,U,-TAGC-,ung-ase,G,C,U,A,U,-TAGC-,-A CG-,AP内切酶(,Apurinase),-TAGC-,-ATCG-,DNApol,Ligase,第二节 DNA损伤的修复,一、嘧啶二聚体的产生,类型：TT二聚体（）、CC二聚体（）、,CT二聚体（）（P131页）,TT,CC,CT,相邻的胸腺嘧啶,胸腺嘧啶二聚体,C,C,C,C,C,C,C,C,PR,1、光复活（photo reactivation）,-TT-,-AA-,-,TT-,-,-AA-,-TT-,-AA-,-,TT-,-,-AA-,复制前、不容易出错,400 nm,蓝光、,PR,酶,(photo-reactivation enzyme),光敏裂合酶（,photolyase,）,可见光激活,二、二聚体修复的机制,2.切除修复,ExisionRepair,复制前进行,不易出错,UvrA,B,C gene,内切核酸酶,Endonucleases,）,外切核酸酶,（,Exonuclease,）,DNA,pol,Ligase,碱基切除修复,核苷酸切除修复,碱基切除修复,核苷酸切除修复,A,B,A B,C,A B C,A B,C,A,B,螺旋酶,Pol,螺旋酶,连接酶,切,补,切,封,3.重组修复（RecombinativeRepair）,后复制修复、E.coli的挽回系统,E.coli,存活%,U.V 计量,w.t.,UvrA,+,RecA,+,uvr a,-,rec a,-,该系统存在的实验证据,Rec-A.gene,以某种方式参与DNA损伤修复,Rec修复系统比切除修复系统更有效,目前知道,Uvr系统负责切除二聚体,Rec系统负责消除没有被切除的二聚体,可能造成的后果,TT TT,AA AA,TT TT,TT TT,AA AA,TT TT,变性,E.coli,(,Rec-A,uvr-a,-,),D.S.DNA,S.S.DNA,U.V.复制,提取 变性,复制过程越过二聚体而在相应新链上留下缺口,二聚体后起始,修复时期的证明,与Rec-A蛋白引起的重组(strand transfer)有关,TT dimer未被修复，仅表现在后代群体中TT dimer,浓度的稀释,链的非准确转移，导致突变机率的增加,修复相关机制:,重组修复,(链转移修复),复制后修复,容易出错,RecA,DNApolymeraeligase,二聚体后起始,RecA,聚合酶、连接酶,重组修复后的损伤位点可,由其它机制进一步修复,4.易错修复（SOS修复 SOS repair）,E.coli,E.coli,E.coli,80 10 100,mut.,100%50%10%,损坏的噬菌体,DNA,在,E.coli,A,被修复,E.coli,的,SOS,修复能被,U.V.,诱导,(A&B),SOS,修复过程有非常高的突变频率,(,易出错,),A,B,C,UV 复活,或,W复活（Jean Weigh）,（1）实验证据,（2）SOS 修复机制,SOS 修复无模板指导的DNA复制,大剂量的紫外线照射，大量的二聚体产生,SOS系统诱导，错误潜伏的复制超越二聚体而进行,错误碱基,SOS 修复只是SOS反应的一部分,RecA在SOS反应,反应中起核心作用,RecA与LexA组成调控环路,DNA 损伤,SOS,RecA受LexA的部分抑制,RecA-P;三种功能,a、DNA 重组活性,b、与S.S.DNA结合活性,c、少数蛋白的proteinase活性,当DNA正常复制时,（无复制受阻，无DNA损伤，无TT dimer）,RecA-p不表现proteinase活性,当DNA复制受阻/DNA damaged,细胞内原少量表达的RecA-p,与S.S,DNA结合,激活RecA-p的proteinase活性,修复损伤,LexA-p降解,RecA-p高效表达,SOS open,上节课内容回顾：,1、复制过程中的错配修复,错配修复系统,尿嘧啶N糖苷酶修复系统,2、DNA的损伤的修复,嘧啶二聚体,光复活修复,切除修复,重组修复,易错修复（SOS修复）,当DNA复制度过难关后,SOS repair 是一种错误倾向性极强的修复机制,是进化中形成的“竭尽全力，治病救人”的措施,（正常状态下，SOS是关闭的）,RecA-p很快消失,LexA gene on,SOS off,第三节 限制和修饰,1、限制修饰现象(restriction and modificaion),50年代初 Luria（T偶数噬菌体）Bertani（,）,Weigle（P2噬菌体）,结论：,菌体限制修饰系统中的限制性内切酶能将外来DNA切断,菌体本身的DNA可受甲基化酶的保护,两者称为限制-修饰作用,*E.coli K菌株和 B菌株各有自己的限制修饰系统,*E.coli C菌株没有,细菌借助于,限制-修饰系统,来区别自己DNA和外源DNA,自己DNA:限制模式相同的DNA,同株系的不同个体DNA、寄生于其中的质粒和噬菌体,居民DNA(resident DNA)：同一个细胞内的不同类型的DNA，,包括细胞DNA，质粒DNA，噬菌体DNA等,2、限制修饰系统,根据其特征分为两大组(三大类),第四节 突变类型,染色体突变（,Chromosome mutation,）,chromosome number,chromosome structure,核苷酸突变（,dNt point mutation）,突变(mutation)：可以通过复制而遗传的DNA结构,的任何永久性改变,遗传状态,突变体(mutant)：携带突变的生物个体或群体或株系,突变基因(mutantgene):存在突变位点的基因,野生型基因（wild type gene）：,表示方法,表现型 Arg,+,Arg,-,基因型 arg,+,arg,-,野生型 正性状,1、从,突变作用来源上定义,自发突变自然界的突变剂或偶然复制错误,诱变 人为使用突变剂,碱基异构式引起DNA复制过程的错误-自发突变,碱基异构式,A(amino 氨基)A(imino 亚氨基),C(a)C(i),G(keto 酮式)G(enol 烯醇式),G(k),G(e,i),T(keto),T(enol-2)or T(enol-4),碱基异构式引起DNA复制的错配,G(k)C(a),正确配对,A(a),T(k),错误配对,G(k),T(e),A(a),C(i),A(i,anti)A(a,syn)A(i,anti)G(k,syn),G(e,i,anti)G(k,syn)G(e,i,anti)A(a,syn),A(i),C(a),G(e),T(k),A(a),T(k),A(a,anti),T(k,anti),C(i)C(a,anti),A(a),A(i,anti),碱基异构式引起DNA的错配突变,C(i),C(a),G(k,syn),G(k,syn),G(k,anti),G(k),2、从序列改变多少上定义,单点突变(point mutation)(点突变),多点突变(multiple mutation),点突变,碱基替代,、碱基插入、碱基缺失,碱基替代（,conversion,）,转换(,transition),Py Py,Pu,Pu,颠换(,transvertion,),Py,Pu,核苷酸缺失或插入（dNt deletion or insertion,）,=3x dNt,n x Amino acid,3x dNt,移框（Framshift,）,移框突变（frameshift mutation）:一个或两个碱基的插入,或缺失，或扁平碱性染料分子,3、从对阅读框的影响上定义,移码突变,Examples of deletion mutations,4、从对遗传信息的改变上定义,（点突变）,同义突变：没有改变产物氨基酸序列的密码子,错义突变：碱基序列的改变引起了氨基酸序列的改变,（中性突变、渗漏突变）,无义突变：碱基的改变使代表某种氨基酸的密码子变,为蛋白合成的终止密码子,碱基替代对遗传信息的改变,-同义突变,GA,A,GA,G,Glu,-错义突变,G,AA,A,AA,Lys,-无义突变,G,AA,T,AA(stop),无义突变类型,UAA（Oc）赭石型（Ocher）,UAG（Am）琥珀型（amber）,UGA（Opal）乳石型（Opal）,5、从,突变的表达类型 上定义,-非条件型突变:,-条件型突变:,突变的表现=突变基因型+诱导条件,（光，温敏感不育）,6、从突变效应上定义,正向突变,回复突变:使突变体所失去的野生型性状得到恢复的第二次突变,真正的原位回复突变很少,大部分为第二点的回复突变,抑制突变,7、,突变位点存在于负责基因调控的序列中,*在启动子区域时:,启动子上升突变:增强启动子对转录的发动作用的突变,启动子下降突变:,*在操作子上或调节基因上,组成型突变:产生组成型表达方式的操作子突变或调,节基因的突变,突变的操作子不能被阻遏蛋白所识别,调节基因突变不能产生有活性的阻遏蛋白,两者之一都使结构基因失去了负向控制,第五节 回复突变(抑制突变),1、抑制突变发生的部位,基因内抑制突变：抑制突变发生在正向突变的基因中,基因间抑制突变：抑制突变发生在正向突变基因外的其它,基因中,wild type,mutant (表现型),正向突变(low F.),回复突变(very low F.正向的110),间接抑制突变:不恢复正向突变基因蛋白质产物的功能,而,是通过改变其它蛋白质的性质或表达水平,而补偿原来突变造成的缺陷,从而恢复野生型,2、野生表型恢复作用的性质,直接抑制突变:通过恢复或部分恢复原来突变基因产物蛋,白质的功能而恢复野生表型,3、,回复突变的分子机制,a)A,G,C(Ser),A,C,C(Thr),A,G,C(Ser),b)AG,C,(Ser),AG,G,(Arg),AG,T,(Ser),c)AG,C,(Ser),AG,G,(Arg),G,GG(Gly),if Ser,Gly,（1）基因内抑制突变(Intragenic suppression),第二位点引起的基因内校正,密码子间两次错义突变的互补,4、抑制突变的分子机制,错义突变,移框突变,错义突变,造成野生型表型的丧失 部分原因在于影响到蛋白质的空间结构,(正负电荷、疏水作用),a、静电作用,b疏水作用,-UGG,174,-GGA,210,-(w.t.),(K)(G),回复突变,(C),（G）,-UGG,174,-GGA,210,-,-UGG,174,-GGA,210,-,-UG,C,174,-G,A,A,210,-,活性结构,无活性结构,C,A,无活性结构,(K)(,E,),上节课内容回顾：,1、限制和修饰现象,2、突变的类型,突变作用来源、序列改变多少、对阅读框的影响,对遗传信息的改变、突变的表达类型、突变效应,突变位于负责基因表达调控的序列当中,3、抑制突变,发生部位：基因内、基因间,野生表型恢复作用性质：直接抑制、间接抑制,基因内错义抑制突变的分子机制,移框突变的抑制突变(基因内第二点的插入或缺失),（2）基因间的抑制突变,无义突变-无义抑制突变,错义突变-错义抑制突变,移框突变-移框抑制突变,发生在,tRNA基因或与tRNA功能相关的基因上,a、基因间的无义抑制突变（,Nonsense suppressor,）,野生型,UAG、UGA、,UAA,三种无义抑制 50,赭石型无义抑制tRNA产生的几率很低，且抑制效率很低,A,GAUCU,Arg,Gly,GGACCU,U,CU,Gly,C,CU,Gly,b、基因间的错义抑制突变(,Missense suppressor),Gly,c、基因间移框抑制突变,总结：基因内和基因间的错义（无义）、移框抑制突变均,由相应的错义（无义）、移框突变抑制,第六节 突变剂和突变生成,1、,碱基类似物（Base analog）,2-氨基嘌呤,2-Amino purine,5-溴尿嘧啶,5-Bromine Uracil,O,O,Br,NH,2,5-BrU,:G,:A,烯醇式enol,Br,O,H,H,O,Br,酮式Keto,H,O,AGCT,T,CCTA,TCGA,A,GGAT,AGCT,B,CCTA,TCGA,A,GGAT,酮式5-BrU的渗入,AGCT,B,CCTA,TCGA,A,GGAT,AGCT,C,CCTA,TCGA,G,GGAT,第二轮复制,A,T,G,C,转变,AGCT,B,CCTA,TCGA,G,GGAT,AGCT,T,CCTA,TCGA,A,GGAT,第一轮复制,酮式到稀醇式的转变,烯醇式渗入为 G,C,A,T,转变,In DNA,BrU(k),BrU(e),(,正常形式,)(,异构体,),BrU(k),BrU(e),难,易,A G G A,T C C T,碱基类似物产生的均为错义突变,2、碱基的化学修饰导致突变,又称化学突变剂：,亚硝酸（nitrous acid HNO,2,）,羟氨（hydroxylamine HA）,甲磺酸乙酯（ethyl mathanesulfonate EMS）,N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍,（N-mathyl-N-nitro-N-nitrosoguanidion NNG）,产生错义突变,NH,2,OH(Hydroxylamine,HA 羟胺,),C(i),A(a),HNH,H,O,C(a),HA,HNH,H,H,O,H,N,H,HO,HN,H,H,O,H,N,H,HO,N,H,3、嵌合剂的质突变作用,吖啶橙(Acridine Orange,AO,),扁平染料分子,溴化乙锭(Ethidium Bromide,EB,),-ATTTTTCG-,-TAAAAAGC-,-A TTTCG-,-T AAAGC-,T,AO,T,-,AT,EB,TTTTCG-,-TA,分子插入,AO,EB,-,ATTTCG-,-TAAAGC-,-,AT,X,TTTTCG-,-TA,X,AAAAGC,-,X,AAAAGC,-,结果产生移框突变,5、,增变基因（mutator gene）,w.t.,维持遗传的稳定性,mut.,随机引起其他各类基因的突变,一种误称,4、转座成分的致突变作用,生物体内有些基因与整个基因组的突变频率直接相关,其突变时，整个基因组的突变频率明显上升,增变基因类别：,a、DNA polymerase 相关基因,3,5 校正功能突变,b、错配修复系统的基因,MCE(mismatch correction enzyme),c、DNA损伤修复系统基因,错配，损伤修复功能丧失 突变率升高,6、紫外线的致突变作用,-嘧啶二聚体(TT dimer),U.V.,C T T A,脱氨氧化,U.V.,C,U,A(a),U.V.,U.V.,H,2,O H,+,+OH,-,C(a),C(i),A(a),脱嘌呤,造成的突变：碱基替代、缺失、重复、移框,7、突变热点（Mutation Hotpoint）,基因自发突变的频率是一定的,DNA分子上某些位点的突变频率大大平均数，这样的位点称为,a)重复序列（repetitive seq.）/palindromic seq.,e.g.Lac.Operon,-,CTGG,CTGGCTGG-,b)m,5,C,c)不同诱变剂作用位点不同，转座子插入位点不同,U,C,m,5,C,T,脱氨氧化,复制时，模板与新生链间滑动错配,缺失，插入突变,复制期发生在新生链上不发生突变，,若发生在模板链上很快突变,非复制期突变频率50,DNA 的损伤修复与突变,Mutagen(诱变剂）,完全修复,DNA 损伤,碱基的化学反应,损伤的修复,突变,突变生成,名词解释,移框突变 无义突变 错义突变 增变基因 组成型表达,自己DNA 组成型突变 突变热点,问答题：,1、常见的无义、错义、移框突变的抑制突变的机制如何。,2、m,5,C突变热点形成的原因。,3、造成基因组成型表达的突变如何发生。,4、错配修复酶的主要功能及作用机制。,5、尿嘧啶N糖苷酶系统修复碱基来源及修复机制。,6、核苷酸切除修复和重组修复的修复时期及简单过程。,7、何为RecA蛋白，其在SOS系统中有何用途？,8、举例说明增变基因增加突变的原因？,本章结束!,20032004第一学期 6课时,