人乳头瘤病毒荧光定量PCR法检测.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,人乳头瘤病毒,(HPV),人乳头瘤病毒,(human papillomavirus,，,HPV),属于乳头多瘤空,泡病毒科,(papovaviridae),乳头瘤病毒属，是一种可以引起人类黏膜组织良性及恶性肿瘤的病毒。,人乳头瘤病毒直径为,55nm,，分子量为,54000,道尔顿，为对称型的,20,面体，是由,DNA,核心和蛋白衣壳组成的无包膜双链,DNA,病毒。,由,双链,DNA,（,8000个,bps）,分子的病毒颗粒及包裹其外的衣壳蛋白组成,。,庞,大家族：,目前有,100+,种型别,HPV,，大约,20,种型别与癌症相关，根据,HPV,致癌危险性大小不同，分为,高危型,和,低危型,与宫颈癌相关的高危型,HPV,有,:,16,18,31,33,35,39,45,51,52,(53),56,58,59,68,低危型别有,:,6,11,(42,43,44),人乳头瘤病毒与疾病,低危型,HPV,主要引起子宫颈良性乳头瘤样变、肛门皮肤和外生殖器,疣,类病变；,高危型,HPV,主要引起,宫颈癌,、外阴癌、肛门癌等恶性肿瘤,其中,HPV16,和,HPV18,是引起宫颈癌的最常见的两种亚型，,HPV16,与宫颈鳞癌关系最为密切，,HPV18,易导致宫颈腺癌,妇产科门诊,（皮肤科、泌尿外科门诊）,人乳头瘤病毒的传播途径,HPV,主要通过直接或间接接触污染物品或性接触传播。,1,性传播途径；,2,密切接触；,3,间接接触：通过接触感染者的衣物、生活用品、用具等；,4,医源性感染：医务人员在治疗护理时防护不好，造成自身感染或通过医务人员传给患者；,5,母婴传播：婴儿通过孕妇产道的密切接触,人乳头瘤病毒的感染特征,HPV,感染多为短暂性的，约有,80,的女性在其一生中的某个阶段曾经感染。,通常,HPV,在感染后的,6-12,个月内可自行消失，只有少部分为持续感染。,高危型,HPV,持续感染,是激发宫颈上皮恶性转化的最重要危险因素，它能使宫颈癌的发生风险提高,250,倍，,是宫颈癌及癌前病变发生发展的必要条件,。,一般从,HPV,最初感染到癌前病变，最终演变为宫颈浸润癌至少需要,10-15,年。,“,几乎所有宫颈癌患者的病理样本中均能找到,HPV,病毒，从而印证了,HPV,是宫颈癌的主要原因，也使宫颈癌成为目前人类所有癌症病变中唯一个病因明确的癌症。”,Jan M.Walboomers,教授,预防,HPV,感染就可以预防宫颈癌，没有,HPV,感染就可以不患宫颈癌。,中华医学会妇产科分会主任委员北京协和医院妇产科专家,郎景和教授,人乳头瘤病毒的实验室检测,目前宫颈癌筛查的方法多采用宫颈细胞学检查及,HPV,病毒检测。,薄层液基细胞学检测技术（,Thin-Cytologic Test,，,TCT,）,二代杂交捕获技术,(HC2),实时荧光定量,PCR,技术,阴道镜活检一组织病理学,通过,采集阴道或宫颈分泌物,，获得脱落细胞后浸入液基细胞处理试剂中进行处理，试剂中的裂解成分能对红细胞进行裂解，去除红细胞对检验结果造成的干扰；同时试剂中的固定成分能保存固定,白细胞、脱落上皮细胞,等有价值的细胞；并使包裹在黏液中的有效细胞充分分离出来，防止有价值细胞的丢失。将有效细胞制备成细胞悬液，最后通过过滤离心方法清除黏液对制片的干扰，,制成脱落细胞薄片,。可用,HE,染色、巴氏染色或其他,免疫组织化学染色,等方法使细胞着色，再通过人工观察分析来,检查阴道或宫颈的细胞形态,，诊断子宫颈癌及其癌的前期变化、人乳头瘤病毒和单纯疱疹,病毒感染,。同时还能发现部分癌前病变，,微生物感染,如霉菌、滴虫、病毒、衣原体等。,薄层液基细胞学检测技术,(TCT),5,计算机,判读,15,min,后,2,DNA-RNA,杂交,60,min,3,抗体,捕获,60,min,4,化学发光检测,30,min,1,DNA,分解,45,min,原理,:,利用对,基因杂交、化学发光、信号放大,的原理在分子水平定性定量检测病毒,DNA,（1）样本,DNA,双链被释放并分解为核苷酸单链；（2）,DNA,单链与,RNA,探针结合为,RNA-DNA,杂交体；（3）特异性抗体(一抗)将,RNA-DNA,杂交体固定在微孔壁上；（4）结合有碱性磷酸酶的多个第二抗体与,RNA-DNA,杂交体结合,使化学发光物质信号放大,（,5,）碱性磷酸酶使酶底物发光，判读光的强弱可确定碱性磷酸酶的含量，通过仪器分析从而确定,RNA-DNA,的含量。,二代杂交捕获技术,(HC2),TaqMan,荧光探针：,PCR,扩增时在加入一对,引物的同时加入一个特,异性的,荧光探针,，该探,针为一寡核苷酸，两端,分别标记一个,报告荧光,基团和一个淬灭荧光基,团,。探针完整时，报告,基团发射的荧光信号被,淬灭基团吸收；,PCR,扩增时，,Taq,酶的外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条,DNA,链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与,PCR,产物形成完全同步。,实时荧光定量,PCR,技术,阴道镜活检一组织病理学视为“金指标”，但其有创伤性不作为常规的筛查手段。,细胞涂片检查敏感性一般在,55%,80%,左右，但一旦发现异常细胞，特异性可达到,90%,以上。,HPV,检测虽敏感性高，但特异性一般只在,64%,95%,之间，这是由于大多数,HPV,阳性的病人可自然转阴，并不导致宫颈癌的发生。,人乳头瘤病毒的实验室检测方法的比较,宫颈癌筛查指南,-,筛查策略,筛查对象：,三年以上性行为或,21,岁以上有性行为的妇女,起始年龄：,经济发达地区：,25-30,岁,经济欠发达地区：,35-40,岁,高危人群：起始年龄应相应提前,（高危人群定义为有多个性伴侣、性生活过早、,HIV/HPV,感染、免疫功能低下、卫生条件差、性保健知识缺乏的妇女）,终止年龄,:,65,岁以上危险性极低,筛查间隔,每年一次细胞学筛查，连续,2,次正常可改至,3,年,连续,2,次,HPV,和细胞学正常可延至,5-8,年.,随访对象,细胞学低度鳞状上皮内病变(,LSIL,)、组织学,CIN,特殊职业人群、,30,岁以上高危,HPV,感染者至少每半年一次,宫颈癌筛查指南,-,筛查推荐流程,HPV,检查前的注意事项,1.,检查前,48,小时内不要做阴道冲洗，不要再阴道内用药物；检查前不要进行醋酸或碘液涂抹。,2.,检查前,48,小时最好不要进行性生活，月经期间不宜进行,HPV,检查。,如何看待,HPV,检测结果,1.HPV,检测结果阴性，表明没有感染,HPV,，结合细胞学检测结果为阴性，,35,年不会发生宫颈癌。,2.HPV,检测结果为阳性，表明有,HPV,感染，若同时细胞学阴性，则无需临床治疗，但需要随访追踪，不可忽视。若,HPV,检测和细胞学同时为阳性，应进一步检查。,HPV,检测的意义,HPV,分型：,感染的,HPV,类型预测受检者,HPV,阳性的发病风险度，决定其筛查间隔，预测患病风险；,有效对,HPV,阳性病人进行很好的随访监控，即可避免对病人进行过度治疗，又可控制病人的病情发展：,HPV,基因分型检测结果对宫颈病变病人手术前后随访提供依据。,HPV,定量,:,HPV,病毒载量与宫颈病变严重程度在一定的含量阈值内有关，高水平的,HPV,载量可以促进宫颈病变的发生发展。一旦检出,HPV,高危型别感染，定量检测不仅使患者了解感染的,HPV,型别，而且还能获知,HPV,病毒的复制情况，为下一步检测或治疗提供帮助。,