免疫沉淀技术.ppt

免疫沉淀技术,免疫沉淀反应定义,免疫化学基础,免疫沉淀技术分类,免疫沉淀技术的应用,免疫沉淀技术,免疫沉淀反应定义,免疫化学基础,免疫沉淀技术分类,免疫沉淀技术的应用,免疫沉淀反应,可溶性抗原,与相应抗体在液相或凝胶中特异性结合后，形成的免疫复合物在一定条件下出现的蛋白质析出现象。,与凝集反应、中和反应、补体参与的抗原抗体反应并称,经典免疫学技术,免疫沉淀技术,免疫沉淀反应定义,免疫化学基础,免疫沉淀技术分类,免疫沉淀技术的应用,沉淀反应原理,沉淀原（,precipitinogen,）,沉淀素,（,precipitin,）,抗原抗体间的力,抗原的价,抗体的价,IgG,、,IgA,、,IgD,和IgE,类抗体：两价,分泌型,IgA,：四价,IgM,类抗体：十价,亲和力和亲合力,affinity,avidity,抗原抗体反应的特异性,特异性的物质基础,epitope,交叉反应,交叉反应,的物质基础,1.,抗原异质性,（,antigen heterogeneity,）,2.,共同抗原决定簇,（,common antigenic determinant,）,3.,决定簇相似,共同抗原的类型,1.,同种抗原,2.,嗜异性抗原（又称,Forssman,抗原）,抗原抗体反应的最适比例,抗原抗体反应的阶段性,抗原,抗体结合,阶段,2.,抗原,抗体反应阶段,抗原抗体反应的影响因素,1,中性盐的作用2,pH,3,温度,4,离子强度,中性盐的作用,加入高浓度盐（如硫酸铵）以脱水，或者用分子量大约,6000,，浓度,3,4%,聚乙二醇（,PEG6000,），以其多聚物孔隙排阻脱水来大大降低抗原抗体复合物的溶解度。,pH,值,尽可能调节,pH,至复合物的等电点附近，通常此,pH,值是介于,IgG,等电点（约,pH=7,）和抗原等电点之间，也依赖于抗原与抗体的比例。,温度,温度与抗原抗体反应有密切的关系,温度升高可促使分子运动加快，抗原与抗体碰撞机会多，容易结合，但也容易再解离,;,温度低，分子运动慢，撞击机会少，但一旦结合后则不易再分开。,离子强度,（,1,）有利于抗原抗体结合的条件：,中等或较低离子强度,（,2,）有利于抗原抗体解离的条件：,高离子强度,免疫沉淀技术,免疫沉淀反应定义,免疫化学基础,免疫沉淀技术分类,免疫沉淀技术的应用,沉淀反应的种类,1,溶液中沉淀反应,2,凝胶中沉淀反应,溶液中沉淀反应,是指在清彻透明的液体中，呈溶解状态的抗原与抗体在试管内或凹玻片上混匀，可凝聚成为肉眼可见的絮状或颗粒状的不溶性沉淀物。,絮状沉淀试验,康氏反应（,Kahns test,）,:,心肌提取的类脂质抗原,+,反应素（,Aegagin,）,敏感性高，特异性差，易出现假阳性。,(1991,年首批淘汰,),性病研究实验室法,(venereal disease research laboratory,，,VDRL),心拟脂及卵磷酯,+,反应素（,Aegagin,）,不需加热的血清反应素试验,(unheated serum reagin),心拟脂及卵磷酯,+,氯化胆碱,+,反应素（,Aegagin,）,反应最适比测定,（,1,）抗原稀释法（,Dean-Webb,法）,（,2,）抗体稀释法（,Ramon,法）,（,3,）方阵法或棋盘格滴定法（,checkerboard titration,）,环状沉淀试验,（,ring precipitation test,）,Ascoli,于,1902,年建立,用于检查兽类内脏、毛皮浸液等标本中的炭疽杆菌抗原,免疫比浊法,（,immunoturbidimetry,）,优点：校正曲线稳定，简便快速，易于自动化，无放射性核素污染,缺点：特异性、灵敏度稍差,免疫比浊法的分类,（,1,）透射比浊法,（,transmission turbidimetry,）,（,2,）散射比浊法,（,nephelometry,）,（,3,）免疫胶乳浊度测定法,（,immunolatex turbidimetry,）,（,4,）速率抑制免疫比浊法,（,rate inhibition immunoturbidimetry,）,免疫沉淀技术,（,Immunoprecipitation assay,）,关键因素,抗原的丰度,抗体,的结合,能力,蛋白,和抗体的可接触,性应用范围,免疫共沉淀技术,（,Co-Immunoprecipitation assay,）,结果分析,Nat Immunol.2008 Apr;9(4):369-77.,GST PULL DOWN,结果分析,PNAS February 26,2008 vol.105 no.8 2836-2841,应用范围,寻找新的相互作用,蛋白,验证,目的蛋白和待测蛋白是否有,相互作用,免疫共沉淀的局限性,（,1,）难以检测低亲和力和短暂的相互作用,（,2,）不能够确切分辨第三种蛋白的桥联作用,（,3,）灵敏度不如亲和色谱高,（,4,）需对未知蛋白的相关信息有一定了解,基因转录调控,染色质免疫共沉淀,染色质免疫共沉淀,结果分析,Mol Cancer Ther June 2010 vol.9 no.6 1764-1774,RNA,免疫沉淀,在生理状态下对结合在,RNA,上的蛋白质进行免疫沉淀，然后通过基因芯片或者其它手段检测目的,RNA,的含量。,应用范围,研究蛋白与,DNA,的动态,作用,研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达之间的,关系,研究蛋白与,RNA,的相互作用,免疫沉淀中抗体的选择,免疫共沉淀技术的应用,凝胶中沉淀反应,以一定浓度（,1,2%,）的琼脂（或琼脂糖）凝胶作为介质，将抗原、抗体溶液分别放在琼脂凝胶板上并使它们彼此在凝胶中自由扩散，形成浓度梯度，当抗原与抗体相遇且比例适当时，在相应位置即可出现可见的沉淀环或沉淀线。,沉淀线特点,形成,沉淀线的特异性抗原抗体无法通过沉淀线，只能在沉淀线周围形成,沉淀,与,沉淀线无关的抗原和抗体分子则可以自由,通过,沉淀,线的位置与抗原抗体的浓度和迁移率有直接关系,单相免疫扩散试验,（,single immunodiffusion,）,双向免疫扩散试验,（,double immunodiffusion,）,沉淀线分析,A B C D E F,Ag,Ab,沉淀线分析,免疫电泳,（,immunoelectrophoresis,）,对流免疫电泳,（,counter immunoelectrophoresis,）,火箭免疫电泳,（,rocket immunoelectrophoresis,）,交叉免疫电泳,（,crossed immunoelectrophoresis,）,免疫固定电泳,（,immunofixation electrophoresis,）,首先将蛋白质抗原进行电泳分离，电泳后直接将抗体加于蛋白质区带表面，抗体与对应的抗原就会直接结合，形成的复合物嵌于固相支持物中。,Urine Immunofixation Electrophoresis,免疫印迹技术,（,immunoblotting,）,基本流程,一,SDS-,聚丙烯酰胺凝胶电泳（,SDS-PAGE,）,1.,收集蛋白样品：贴壁细胞、组织、药物处理细胞,2.,蛋白质浓度测定：,BCA,3.,电泳：,10,分离胶、,4,的浓缩胶,4.,电泳结果检查,二,.,电转移,毛细管印迹法和电泳印迹法,转移膜的选择,NC膜,尼龙膜,PVDF膜,灵敏度和分辨率,高,高,高,背景,低,较高,低,结合能力,80110 ug/cm2,400 ug/cm2,125200 ug/cm2（适合于SDS存在下与蛋白质的结合）,材料质地,干的,NC膜易脆,软而结实,机械强度高,溶剂耐受性,无,无,有,操作程序,缓冲液润湿,避免气泡,缓冲液润湿,100%甲醇润湿,检测方式,常规染色，可用放射性和非放射性检测,不能用阴离子染料,常规染色，比较于,NC膜，可用考马斯亮蓝染色，可用于ECL检测，快速免疫检测,适用范围,0.45um 一般蛋白0.2um一分子量小于20kD蛋白0.1um一分子量小于7kD蛋白,低浓度小分子蛋白、酸性蛋白、糖蛋白和蛋白多糖,(主要用在核酸检测中),糖蛋白检测和蛋白质测序,价格,价格较便宜,便宜,较贵,基本流程,三酶免疫定位,封闭：,抗体的的,选择：来源、标记、效价、二抗,标记的,选择：,HRP,、,AP,技术优势,灵敏度高,特异性高,方法简便,无需纯化,易于观察、保存,应用范围,蛋白质相对含量检测,蛋白质修饰水平分析,蛋白质相互作用研究,