实验四-酶联免疫吸附试验-ELISA.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验四-酶联免疫吸附试验-ELISA,免疫标记技术,定义：,将抗原,-,抗体反应与标记技术相结合，用,放射性同位素、酶或荧光素,标记的已知抗体或抗原，通过检测标记物，间接测定未知的抗原或抗体。,分类：,放射免疫测定法：,131,I,，,32,P,免疫荧光技术：,FITC,，,PE,免疫酶测定法：,HRP,，,AP,免疫酶测定法,(,E,nzyme,I,mmuno,A,ssay,EIA),用酶标记的抗原或抗体进行的抗原抗体反应。,辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶(AP),特点：,高度特异性：保持抗原抗体反应的特异性,高灵敏度：酶催化底物显色的高效性，pg水平微量检测,定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值,分类：,酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体,酶免疫组化法：组织中或细胞表面的抗原。,酶联免疫吸附试验,(,E,nzyme-,L,inked,I,mmuno,S,orbent,A,ssay,ELISA),用酶标记抗原或抗体检测液体（血液、细胞液）中未知抗体或抗原的方法。,1.定义,2.原理,（1）利用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接。,（2）通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。,测定的对象可以是抗体也可以是抗原。,3.常用种类,直接法（,direct ELISA,）：,将已知抗原直接吸附于载体，加酶标抗体,检测抗体,间接法（,Indirect ELISA,）：,将已知抗原吸附于固相载体，加酶标记二抗,检测,液相中未知抗体,双抗体夹心法（,Sandwich ELISA),：,将已知抗体吸附于固相载体，酶标记一抗,检测液相中的,可溶性抗原,竞争法（,Competitive ELISA),：,将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标记抗原或抗体,检测液相中的可溶性,抗原或抗体,阻断法（,Block ELISA),：,将已知抗原吸附于固相载体，酶标记单克隆抗体,检测液相中的可溶性,抗体,（1）直接法测定抗原,A.将抗原吸附在载体表面；,B.加酶标抗体，形成抗原抗体复合物；,C.加底物。底物的降解量抗原量。,（2）间接法测定,抗体,A.将,抗原,吸附于固相载体表面；,B.加抗体,形成抗原-抗体复合物;,C.加酶标抗体；,D.加底物。测定底物的降解量抗体量。,（3）,双抗体,夹心法测定,抗原,A.将,抗体,吸附于固相表面;,B.加待检抗原，形成抗原-抗体复合物;,C.加酶标抗体;,E.加底物。底物的降解量抗原量。,（4）竞争法测定抗原,A.将抗体吸附在固相载体表面;,B.同时加入酶标抗原和待测抗原，竞争结合抗体；对照只加入酶标抗原；,C.加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差未知抗原量。,（5）阻断法测定抗体,本法主要用于检测型特异性抗体。该方法现已成为猪传染性胃肠炎（TGE）、猪伪狂犬病（PR）及猪胸膜肺炎（AP）的主要检测方法。,A.将抗原吸附在固相载体表面;,B.先加待检血清（抗体）,形成抗原-抗体复合物;,C.再加酶标单抗；,D.加底物。,酶联免疫吸附试验,(,E,nzyme-,L,inked,I,mmuno,S,orbent,A,ssay,ELISA),4.原理,（以ELISA为例）,：,显色,酶标单抗,酶标单抗,实验材料,猪伪狂犬病毒（,PRV,）,抗原,阴性对照,阳性对照,样品,待测猪血清,HRP,标记猪,PRV,单抗,酶标单抗,包被缓冲液：,0.025M pH9.6,碳酸盐缓冲液,洗涤液：含,0.05%,Tween,20,的,0.01M pH7.4 PBS,底物缓冲液：,pH5.0,磷酸盐柠檬酸缓冲液,底物溶液：,TMB,（四甲基联苯胺），底物缓冲液，,30%H,2,O,2,，,新鲜配制,酶标板，酶标仪,阻断法测定猪伪狂犬病病毒ELISA抗体 定性检测,实验方法,1.抗原的处理：,2.包被抗原：,取酶标板，加入100L/孔的抗原稀释液,4，湿盒内，18h,取出包被好抗原的酶标板（4孔/组），甩干孔内液体,以洗涤液（200L/孔）洗涤3次，3min/次,3.加待测血清,标记各孔，加入相应液体100L/孔,1,2,3,4,阴性,空白,阳性,待测,4.加单抗：,37，湿盒内，30min,甩干孔内液体,以洗涤液（200L/孔）洗涤3次，3min/次各孔加入酶标单抗100L/孔,37，湿盒内，30min,5.显色：,甩干孔内液体,以洗涤液（200L/孔）洗涤3次，3min/次,加入底物溶液100L/孔,避光显色，10min,6.观察结果,实验方法,1、取已包被猪伪狂犬病毒抗原的酶标板（根据样品多少，可拆开分次使用），用样品稀释液（PBS）将待检血清11稀释后加入板孔中，每孔加100l。同样11稀释阴、阳性对照血清，阴、阳性对照各设1孔，每孔100l。另设一空白对照孔，空白对照孔加100l稀释液。轻轻振匀孔中样品（勿溢出），置37温育30分钟。,2、洗板：甩掉板孔中的溶液，每孔加入稀释好的洗涤液200l，静置3分钟倒掉，再在吸水纸上拍干，重复3次。,3、每孔加酶标单抗100l，置37温育30分钟。,4、洗板：洗涤3次（方法同步骤2）。切记每次在干吸水纸上拍干。,5、显色与终止：每孔先加底物A液、再B液各1滴(50l)，混匀。室温（18-25）避光显色10分钟后。,6、终止：每孔加终止液1滴(50l)（0.25%氢氟酸），终止反应。,7、10分钟内测定结果。采用波长630nm的酶标仪测定OD值。检测样本的OD值0.35为阳性,8、结果判定：试验成立的条件是：阴性对照孔平均OD630值与阳性对照孔平均OD630值之差,0.4,。,S=样品孔OD630值，N=阴性对照孔OD630值,如果S/N比值,0.6，样品判定为PRV抗体阳性。如果,S/N比值,0.7但 0.6，样品重测。,如果,S/N比值,0.7，样品判定为PRV抗体阴性,具体操作步骤,预期结果,阴性：显色为,蓝色,阳性：无色,1 2 3 4,阳性,阳性,阴性,阴性,常用酶及底物,常用酶,底物,加终止液前颜色,加终止液后颜色,辣根过氧化物酶（,HRP,）,碱性磷酸酶（,AP,）,邻苯二胺（,OPD,）,四甲基联苯胺（,TMB,）,对硝基苯磷酸酯（,p-NPP,）,橙黄色,蓝色,棕黄色,蓝色,黄色,注意事项,1、ELISA实验前血清样品尽量做到37灭活30分钟。,2、在ELISA的整个操作过程中，洗涤是不可缺少的重要步骤，每加一层反应结束后均要洗涤固相载体反应板，目的在于防止重叠引起非特异性吸附。洗涤过程中的助溶剂吐温20具有降低非特异吸附的作用。洗涤时尽可能除去未结合的抗原及杂质，用力甩干。,3、加入底物液后应该室温避光，结果判断须在10分钟内完成。,