毒理学第八章外源化学物致癌作用.ppt

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第八章 外源化学物致癌作用,肿瘤,(tumor,neoplasm),：具有分裂潜能的细胞受致癌因素作用后，发生恶性转化和克隆性增生所形成的新生物。人体任何部位、任何组织都可以发生肿瘤。,肿瘤分类：,1,、良性肿瘤：呈膨胀生长，与周围组织有明显界限，多有包膜，生长具有“自限性”，对机体的破坏性小。,2,、恶性肿瘤：呈增殖失控，细胞异常分化，且具有侵袭和转移能力。,（,1,）癌（,carcinoma,）：上皮细胞来源的恶性肿瘤,（,2,）肉瘤（,sarcoma,）：由间质细胞来源的恶性肿瘤,毒理学中的“癌”是一种广义的概念，包括：癌、肉瘤及良性肿瘤。实际上毒理学中所指的化学致癌作用，是指化学致肿瘤作用。,化学致癌作用,(chemical carcinogenesis)：,是指化学物质引起或诱导正常细胞发生恶性转化并发展成为肿瘤的过程。,化学致癌物,(chemical carcinogen)：,凡是能引起生物体肿瘤，增加其发病率或死亡率的化学物。,1775,年由英国的,Pott,报导煤烟和煤焦油是清扫烟囱工人阴囊癌的主要病因。,瑞典的,Reher,观察到，苯胺染料生产工人膀胱癌的发病率升高，当时认为苯胺为致癌原因后来发现主要与在其生产中同时存在的联苯胺及,-,萘胺有关。,英国的,Kennaway,从焦油沥青中分馏出致癌物苯并（,a,）芘，又陆续报导了一些多环芳烃类物质可引起肿瘤的发病率提高。,第一节 化学致癌过程,细胞癌变的多阶段学说,肿瘤发生是一个长期的、多阶段、多基因改变累积的过程，具有多基因控制和多因素调节的复杂性。,化学致癌过程至少可分为,:,引发（,initiation）,促长（promotion）,进展（progression）,1.引发阶段（Initiation),2.促长阶段（Promotion),3.进展阶段（Progression),DNA损伤,损伤固定,遗传性状改变,突变细胞在内、外因素的作用下，促进肿瘤细胞的分裂和增生,突变细胞,生长速度快,侵袭性和转移能力强,生理生化和免疫性状改变,1、,引发阶段,引发（启动）是遗传毒性发生的过程，是化学致癌的第一步。,致癌物直接作用于,DNA，引起基因突变，使单个或少量细胞发生永久性的、不可逆的遗传性改变，成为突变细胞，或称“启动细胞”，诱发细胞突变的因素称为,引发剂,（,启动剂,）。,启动细胞的表型可能正常，它必须通过克隆扩增才能形成良性损伤。,在接触致癌物与发生细胞转化之间要有一个相当长的潜伏期，需要启动效应的遗传传递。,1.引发阶段（Initiation),2.促长阶段（Promotion),3.进展阶段（Progression),DNA损伤,损伤固定,遗传性状改变,突变细胞在内、外因素的作用下，促进肿瘤细胞的分裂和增长,突变细胞,生长速度快,侵袭性和转移能力强,生化学和免疫性状改变,引发阶段的主要特征,不可逆,需要通过细胞分裂加以固定,剂量-反应显示没有可测定的阈值，无可测定的最大反应,存在自发的引发作用,对外源性化学物质和其他化学因素敏感,引发作用必须发生在促长作用之前，“纯”引发作用在无促长时不导致肿瘤,2、促长阶段,细胞在致癌物的作用下变成启动细胞后，在某些因素作用下，以相对于周围正常细胞的选择优势进行克隆扩增，形成镜下或肉眼可见的细胞群，即良性肿瘤（如乳头状瘤或腺瘤）。促长价段癌细胞的表型发生变化，恶性肿瘤细胞的各种性状得以表达。起促进作用的因素称为,促长剂,或,促癌剂,。,促癌剂包括多种人类环境中存在的因子，如,TCDD、苯巴比妥，以及高盐高脂饮食、糖精、香烟烟雾等。其中烟雾既是肺癌、胰腺癌、食道癌和其它器官癌的启动剂，同时也是促癌剂。,人体内的一些内源性物质也具有促癌作用，如雌激素对乳腺癌有促进作用；胆酸是结肠癌与肝癌的促进剂。,促癌剂的作用机理：,通过细胞毒性或激素作用刺激细胞增殖。如高脂肪饮食可使乳腺癌的发病率增高，原因是高脂肪饮食可使催乳素分泌增多，而催乳素对乳腺癌的发生有促进作用。,抑制细胞间的信息互通，从而解除细胞生长的接触抑制，使启动了的细胞能逃脱周围正常细胞的抑制，出现增殖失控。,免疫抑制。,1.引发阶段（Initiation),2.促长阶段（Promotion),3.进展阶段（Progression),DNA损伤,损伤固定,遗传性状改变,突变细胞在内、外因素的作用下，促进肿瘤细胞的分裂和增长,突变细胞,生长速度快,侵袭性和转移能力强,生化学和免疫性状改变,促长阶段的主要特征,可逆性,促长剂通常是非致突变物，需要持续和 反复暴露,促长剂的有效性仅出现在引发作用之后,促长细胞群的存在取决于促长剂的持续存在,内源性促长剂可起自发促长作用,剂量,-反应显示有可测定的阈值，有可测 定的最大效应,对饮食和激素等因素敏感,促长作用的相对效力取决于达到最大效 应的时间和剂量速率,引发剂与促癌剂对小鼠皮肤诱发肿瘤的阶段性,组 别 肿瘤,（,1）I I I I I I I I I +反复多次给予引发剂可诱发肿瘤,（,2）I 引发后无促癌剂则不能发生肿瘤,（,3）P P P P P P P P 无引发剂，仅有促癌剂也不发生肿瘤,（,4）I P P P P P P P +引发后，多次给予促癌剂则可发生肿瘤,（,5）I P P P P 引发后，促癌剂接触次数少不发生肿瘤,（,6）P P P P P I 先促癌剂，后引发剂也不发生肿瘤,（,7）I P P P P P P +,引发后经过一定时间再给予促癌剂可发生肿瘤,3、,进展阶段,指在肿瘤形成过程中，在促进之中或之后，细胞表现出不可逆的遗传学改变，其标志为遗传不稳定性增加和恶性变化，在形态上或功能代谢和行为方面逐渐表现出恶性肿瘤的生物学特征，如生长速度、侵袭性、转移能力、以及生理生化、免疫性能的改变等。,当细胞开始失去维持核型稳定的能力并出现染色体畸变时，它们即进入进展期。核型不稳定性进一步促进肿瘤细胞的生长和恶性表型的发展，同时引起细胞代谢调节功能的改变，且逃避机体免疫监视等功能。,1.引发阶段（Initiation),2.促长阶段（Promotion),3.进展阶段（Progression),DNA损伤,损伤固定,遗传性状改变,突变细胞在内、外因素的作用下，促进肿瘤细胞的分裂和增长,突变细胞,生长速度快,侵袭性和转移能力强,生化学和免疫性状改变,进展阶段的主要特征,不可逆,伴随生长率和侵袭性的增加出现核型异常，核型不稳定性导致细胞基因组结构的形态学改变,有可测定的和,/或形态学可描述的细胞基因组的改变,进展的早期阶段对环境因素敏感,可见良性和,/或恶性肿瘤,促进展剂可促进细胞进入该阶段，但可能不是引发剂,可以发生自发的进展作用,前致癌物,终致癌物,活化,正常细胞,致癌物,-DNA加合物,DNA复制错配修复失败,DNA修复,细胞死亡,细胞含错 配碱基,引发的细胞,分化的细胞,不分化的细胞,转移,促长,进展,化学致癌过程的主要阶段,修复,遗传易感性与化学致癌,单核苷酸多态性,特定基因的遗传多态性,个体的遗传易感性,肿瘤,第二节 化学致癌机制,化学致癌作用：,多因素、多基因参与的多阶段过程,。,体细胞突变致癌学说：,即造成,DNA损伤而引发肿瘤的遗传毒性机制,非突变致癌学说：,即对,DNA以外靶分子作用的非遗传毒性机制,一、体细胞突变学说,体细胞突变学说的依据：,1、致癌物代谢活化后生成的DNA加合物诱导基因突变；,2、大多数致癌物在致突变实验中呈阳性；,3、DNA修复缺陷可以导致肿瘤发生；,4、许多肿瘤组织中发生染色体畸变和基因组不稳定性；,5、肿瘤细胞来源于单细胞克隆；,6、癌基因突变及抑癌基因突变和缺失在肿瘤细胞中普遍存在，且突变的基因型可以通过细胞分裂传递给子代细胞。,（一）与致癌作用有关的代谢,人们接触的大多数致癌物是间接致癌物，必须通过酶系统的代谢活化，形成终致癌物才能发挥其致癌作用。,体内正常的生物转化酶的作用：一是解毒（水解、还原、氧化反应），二是使外来化合物的极性增加（结合反应），容易排出体外。,在某些情况下，生物转化酶也可作用于外来化合物，产生代谢活化作用，如无活性的间接致癌物，可以在体内生物转化酶系统的作用下，经代谢活化转变为终致癌物。,化学致癌物的代谢特点,:,（,1）代谢以氧化过程为主，所形成的终致癌物具有亲电子性，能与DNA、RNA、蛋白质结合，导致损伤效应，引起突变，诱发肿瘤。,（2）致癌物的代谢活化可在多种组织、器官中进行，虽有组织特异性，但以肝脏为主。,（3）人和动物对化学致癌物的代谢在种属、品系、家族和个体上的差异与遗传因素决定的代谢酶多态性有关，致癌物代谢酶的活性因人而异，个体间的差异可达30-100倍，个别甚至达1000倍。,DNA加合物（DNA adduct）,化学致癌物在体内生物转化酶系统作用下，经代谢活化，产生具有致癌作用的终致癌物，后者含有亲电子结构，能与体内的生物大分子如,DNA上的亲核基团发生共价结合，导致DNA的突变，引起DNA损伤。,致癌物与DNA大分子的结合具有位点特异性，不同位点的加合物有不同的生物学效应，绝大多数化学致癌物加合物形成位点与基因突变位点密切联系。,支持这一观点的实验依据,1.大多数致癌物同时也是致突变物,2.许多致癌物的致突变和致癌性质取决于它们是否能转变为亲电子的代谢产物,3.DNA加合物的水平通常与致癌性和致突变性成正相关,4.DNA和致癌物的相互作用可活化肿瘤基因,亲电性化合物,DNA,RNA,蛋白质,亲核基团,加合物,碱基突变、缺失、插入、交联,基因结构改变,肿瘤,细胞、血液、尿,共价结合,（二）,DNA修复与化学致癌,正确修复：,受损的,DNA完全回复到原有的结构与功能，不发生突变。,错误修复：,经修复的,DNA部分仍可能在结构和功能上存在缺陷，细胞虽能生存，但出现突变。,DNA损伤-修复-突变-肿瘤,化学致癌物能否引发肿瘤既取决于它们对机体生物大分子尤其是,DNA的损伤，也取决于机体对损伤DNA的修复能力。,DNA受化学致癌物作用而损伤后，可能通过糖基化酶排除损伤的碱基或切除化学损伤周围的一段碱基，从而迅速修复，接着由DNA聚合酶催化正常序列的合成。,DNA修复机制十分复杂，由一些DNA损伤修复基因调控，涉及一些酶系统，如甲基转移酶、糖基转移酶、以及各种类型的损伤特异修复酶。,DNA损伤修复存在不均一性和可诱导性,不均一性,表现在不同个体、不同器官和不同种类细胞之间的修复能力不同，也表现为同一细胞内不同基因片段上的损伤获得的修复机会不同等，即,表达基因优先于静止基因,，,调控基因优先于功能基因,。,可诱导性,是指细胞修复,DNA的能力并不是固定不变的，可被相关因素所诱导。在小剂量损伤因素的连续刺激下，DNA损伤修复的能力会升高。,（三）癌基因、原癌基因及抑癌基因,DNA上原（前）癌基因、抑癌基因很可能是化学致癌物的靶分子。,癌基因（oncogene）：,一类在自然或实验条件下能引起细胞恶性转化及癌变的基因。,多数癌基因表达产物都是细胞信号转导系统的组成成分，作为细胞生长因子和细胞生长因子受体、核转录因子或转录调节蛋白，促进细胞有丝分裂，参与细胞周期的调控等。,癌基因是化学致癌物作用的靶分子,在细胞癌变过程中发挥关健作用,指导合成的蛋白质能促成细胞恶性表型的形成,原癌基因,（,proto-oncogene）：,指机体内正常细胞所具有的能致癌的遗传信息，即癌基因的原型,.,在正常情况下，原癌基因呈静止状态，对细胞无害且具有重要生物学功能，如生长因子、受体、信号分子、转录因子和细胞周期调节等，癌基因是化学致癌物作用的靶分子。,癌基因,通常以,原（前）癌基因,的形式普遍存在于正常动物细胞的基因组内，原癌基因在进化过程中高度保守，它们在细胞中行使正常的生物学功能，对细胞增殖、分化和信息传递的调控起重要作用。,化学、物理或生物等致癌因素作用于细胞后，引起原癌基因突变并使之激活，转变成癌基因后才会导致细胞癌变。,原癌基因,癌基因,突变,致癌物,癌变,原癌基因与癌基因关系示意图,抑癌基因（anti-oncogene）：,又称,肿瘤抑制基因（,tumor suppressor genes）、肿瘤易感基因（tumor susceptibility gene)，,指对细胞生长、增殖和分化起负性调节的基因，即抑癌作用。,是正常细胞分裂生长的负性调节因子，其编码的蛋白质能够降低或抑制细胞分裂活性。,由于含化学致癌因素的作用，抑癌基因发生纯合子缺失或失活，可引起细胞的恶性转化而致癌。,抑癌基因失活,肿瘤细胞增殖失控,正常情况抑癌基因具有多种多样的细胞功能，如,P53,P53,野生型,P53,：肿瘤抑制基因的作用。其表达产物,p53,蛋白参与细胞周期,G1/S,交界处检查点的检查机制，负责检查基因组的完整性。如果,DNA,有损伤，则,p53,使细胞阻滞于,G1,期，以使其修复；如修复失败，则,p53,启动细胞发生凋亡。,突变型,P53:,癌基因的作用。促进细胞恶性转化，抑制细胞凋亡。在多种肿瘤中高表达。,p53蛋白是四聚体，,野生型限制细胞生长,缺乏,p53细胞生长不受控制,突变亚基因阻碍四聚体功能，细胞生长不受限制,P53,等位基因的缺失或突变,都可使细胞生长不受限制,癌基因,激活，导致肿瘤的阳性增殖，原癌基因突变为癌基因后通常过度表达,癌基因的两个等位基因中单个基因突变可以影响细胞表型,抑癌基因,的产物能阻断肿瘤的细胞生长，抑癌基因突变后丧失其功能,抑癌基因的两个等位基因都必须失活才能改变细胞的表型,（四）基因表达调控异常与肿瘤发生原癌基因、抑癌基因或其他基因表达、转录、翻译等过程的异常均引起基因表达异常，引发肿瘤。,基因表达的调控是一个多水平的过程，包括基因组、转录、转录后、翻译及翻译后等复杂过程。,肿瘤发病机制学说的两大学派：,1、基因学说：,即癌变是由于基因的改变；,2、基因外学说：,即基因表达调控失常，基因本身不一定有改变。,两大学派已逐渐在癌基因发病的理论中趋向统一，目前认为，肿瘤的发生是由于多层次上异常所致，仅从单一方面去认识与解释都将是局限的。,二、非遗传毒性致癌机制,一些外源的化合物如免疫抑制剂、激素、苯巴比妥和促癌剂（如佛波酯）等，是通过非遗传机制而产生致癌作用，称为非遗传因子。,非遗传因子,并不改变DNA,序列，即对遗传物质没有影响，但能改变或抑制某些与细胞增殖和分化有关的基因。,它们可作用于转录和翻译等过程，促进基因型已发生改变的细胞，即含有突变或原癌基因已激活成为癌基因的细胞增生，从而使这些改变或启动的细胞克隆增生。,非遗传因子非遗传毒性致癌机制涉及因素很多，包括：细胞间隙连接通讯、信号转导系统、纺锤丝系统、,DNA,修复系统以及基因表达调控系统等。,非突变致癌学说的主要研究方向,表观遗传调控失常致癌,细胞异常持久增生致癌,内分泌激素失调致癌,免疫功能抑制致癌,过氧化物酶体增殖剂激活致癌,外源化学物,与人体接 触包括各 种途径,非遗传毒 性化学物,直接或间接诱导 有丝分裂、促进 细胞过度增殖,引发细胞,绝大多数经代谢解毒,排泄,少数经代谢活化,终致癌物,作用于生 物大分子,DNA加合物形成、癌基因与抑癌基因的改变,直接致癌物,癌前病变,肿瘤,逃避宿主的免疫监视,促癌物,DNA损伤修复,多阶段致癌 理论图解,化学致癌多基因、多因素参与的多阶段理论,化学致癌物,癌基因,抑癌基因,DNA修复基因,代谢酶基因,凋亡基因,抗凋亡基因,外源性因素,理化生物因素、营养等,内源性因素,遗传、免疫、激素、精神等,生物体,引起癌基因、抑癌基因等发生点突变、扩增、易位、重排、缺失等使癌基因活化，抑癌基因失活，导致细胞的增殖、分化、凋亡异常引起肿瘤。,第三节 化学致癌相关的分子事件,一、端粒调控与细胞永生化,二、细胞调控周期紊乱,三、细胞凋亡,一、端粒调控与细胞永生化,端粒（telomere)：,是线状染色体末端的,DNA,重复序列。端粒是线状染色体末端的一种特殊结构，在正常人体细胞中，可随着细胞分裂而逐渐缩短。,端粒酶(telomerase)：,一种由催化蛋白和,RNA,模板组成的酶,在细胞中负责端粒的延长，是基本的核蛋白逆转录酶,可将端粒,DNA,加至真核细胞染色体末端,赋予细胞复制的永生性。端粒酶在正常人体组织中的活性被抑制，在肿瘤中被重新激活，端粒酶可能参与恶性转化。,原代培养的人上皮细胞在体外分裂,40-60次后就停止生长，进入老化阶段M1期，,如此时细胞内的抑癌基因p53和Rb失活，细胞就能暂时逃脱老化的威胁而继续分裂，,但端粒是随着细胞分裂次数的增加而逐渐缩短，这些细胞最终进入以死亡为特征的M2期，如此时端粒酶被激活，细胞就获得了不断增生分裂的能力而成为永生化细胞。,端粒假说：抑癌基因,p53和Rb的失活以及端粒酶的激活是细胞获得永生化的必要条件,意 义,寻找端粒酶抑制剂，为肿瘤治疗提供新药物,寻找端粒酶激活剂，为维持细胞活力和阻止细胞衰老开拓新途径,二、细胞周期调控紊乱,细胞周期分为G1 S G2 M,细胞周期调控的核心成员：细胞周期素、细胞周期素依赖性蛋白激酶（CDK)和CDK的抑制性蛋白（CDKI),细胞周期调控机制：细胞周期驱动机制,细胞周期监控机制,细胞周期监控包括：,DNA损伤感应、细胞生长阻滞、DNA修复和细胞凋亡启动,如果细胞周期调控的某些重要因子功能障碍，增强细胞周期的驱动力，并使正常的监控能力下降，就造成细胞周期调控失常，细胞进入失控性生长阶段。,注意：某些癌基因或抑癌基因也是细胞周期调控过程的重要成分，如,p53、Rb、p21、p16等,三、细胞凋亡与肿瘤,细胞凋亡是细胞在一定的生理或病理条件下，受内在遗传因素的控制自动结束生命的过程，是一种自然的生理过程。,它是机体为了清除多余的、有害的、已经完成使命的细胞，维持机体的稳态所启动的系统。,细胞凋亡的调控机制：,促进凋亡:如p53,Rb,p16,Bax,抑制凋亡:如c-Myc,Ras,Src,Bcl-2,某些化学物质改变了调控基因的表达和功能，干扰细胞的正常凋亡过程，使本该清除的细胞保留下来，受损细胞中携带的突变得以固定和传递。,如果某些药物可诱导细胞凋亡也为肿瘤治疗提供了一个方向。,如 砒霜,第四节 化学致癌物的分类,一、根据致癌物对人类和动物致癌作用分类,国际癌症研究所（,IARC,）分类：,组,1,：对人是致癌物。对人类致癌证据充分者属本组。,组,2,：对人类很可能或可能是致癌物。,组,2A,：对人很可能是致癌物，指对人类致癌性证据有限，对实验动物致癌性证据充分。,组,2B,：对人可能是致癌物，指对人类致癌性证据有限，对实验动物致癌性证据并不充分；或对人类致癌性证据不足，对实验动物致癌性证据充分。,组,3,：现有证据不能对人类致癌性进行分类。指缺乏人类的资料，动物致癌性资料也有限。,组,4,：对人类可能是非致癌物。,二、根据化学致癌作用模式分类,1、遗传毒性致癌物（genotoxic carcinogen）：,指进入细胞后与,DNA发生共价结合，引起机体遗传物质改变，导致癌变的化学物质。,直接致癌物,间接致癌物,前致癌物,近致癌物,终致癌物,前致癌物 近致癌物 终致癌物,代谢酶,代谢酶,直接致癌物,(driect carcinogen),：,其本身直接具有致癌作用，在体内不需要代谢活化即可致癌。如各种烷化剂，这类物质大多数为亲电子物。,间接致癌物,(indirect caicinogen),：,其本身不能直接致癌，必须在体内经过化谢转化，所形成的代谢物具有致癌作用。如多环芳烃、芳香胺类化合物等。,前致癌物（,precarcinogens）,：,未经代谢活化的间接致癌物。,近致癌物（,proximate carcinogens,）,:,前致癌物在体内经代谢活化形成的一种或一系列中间代谢产物。其化学性质活泼但寿命短暂，需经代谢活代，转变为带正电子的亲电子物，与,DNA,等生物大分子发生反应。,终致癌物（,ultimate carcinogens,）,:,不需代谢活化的直接致癌物和间接致癌物经代谢活化所形成的具有致癌作用的代谢产物的总称。无机致癌物：,通过选择性改变,DNA复制的保真性，导致DNA的改变，如金属镍、铬或它们的盐类等。,2、表观遗传毒性致癌物,（epigenotoxic carcinogen）：,指不作用于机体遗传物质的化学致癌物。,（,1）,促长剂,：本身无致癌作用，在给予遗传毒性致癌物后再给予促长剂，可以增强遗传毒性致癌物的致癌作用，也可以促进“自发性”转化细胞发展成癌。如苯巴比妥、二丁基羟基甲苯等。,（,2）,内分泌调控剂,：主要改变内分泌系统平衡及细胞的正常分化，常常起促长剂作用。如乙烯雌酚、雌二醇、硫脲等。,（,3）,免疫抑制剂,：主要对病毒诱导的恶性转化起增殖作用，如嘌呤同类物。,（,4）,细胞毒剂可能引起细胞死亡，导致细胞增殖活跃及癌症发展。如次氮基三乙酸、氯仿等。,（,5）,过氧化物酶体增殖剂,：可导致细胞内氧自由基过量生成。如祛脂乙酯、邻苯二甲酸乙基已酯。,（,6）,固态物质,：物理状态是关键因素，可能涉及到细胞毒性。如塑料、石棉。,3、其他,：,助致癌物：,本身既不具有引发作用，也不具有促长作用，但可以促进引发作用和增强促长作用，即能促进或增强全部致癌过程。如乙醇、二氧化硫等。,三、根据对人和动物致癌性的其他分类,确定致癌物,：,指人和动物都有充分明确的证据,，表明该化学物质对人有致癌性。,可疑致癌物：,指仅有个别临床报告，但在人群流行病学调查中未得到确切肯定的因果关系；或仅在多种动物、特别是与人类血缘相似的灵长类动物致癌试验阳性的化学物。,潜在致癌物：,指在人群中尚无充分资料说明人有致癌性，但有充分的动物致突变资料的化学物质。,已鉴定的人类主要环境致癌因素,化学致癌物：如香烟烟雾中的化学致癌物,饮食中的污染物：如黄曲霉毒素B1,物理因素：如紫外线、石棉、氡,致病菌和病毒：如幽门螺旋菌、人乳头状瘤病毒、人乙肝和丙肝病毒,某些生活方式：如吸烟、过度暴露于阳光、过度脂肪摄入等,第五节 化学致癌物筛查的基本方法,化学致癌物的判别包括两方面的证据：,人群流行病学调查：,必须具备两项以上不同研究者在不同地点、不同对象中以不同调查方法获得的结论相符的证据。,动物实验：,至少有两项按现行常规设计进行，符合,，在不同物种动物中所得结果一致的动物致癌物鉴定资料。,致癌是一种后果严重的毒性效应，因此致癌性评定是一项极其重要、慎重而又复杂的工作。在方法学上需要经过严密设计的、可靠的流行病学调查才能判定对人的致癌性。如果进行动物致癌试验，只有长期的、终生试验才被公认为可得到确切证据，说明对动物有无致癌性。,常用的致癌物判别方法包括三大类,短期试验,动物致癌试验,人类流行病学调查,（一）遗传毒性试验,依据：,化学物致突变性与致癌性紧密相关。,局限性：,无法检出非遗传毒物的致癌性（假阴性）和具有遗传毒性的非致癌物（假阳性）。,一、短期试验,致癌物筛选试验主要包括：,基因突变试验：包括用微生物、昆虫、哺乳类动物细胞及啮齿类动物进行体外或体内试验，其中以,Ames最常用。,染色体畸变分析，微核试验。,直接观察化学物对,DNA的损伤：SCE试验。,目前主张采用几种方法组合试验，减少出现假阴性和假阳性的情况。,有人主张用,Ames、小鼠细胞基因突变试验、SCE、体外细胞转化试验为一组，若这四种中有一种为阳性，则表明该物质致癌作用值得进一步探讨。,（二）细胞恶性转化试验,细胞恶性转化试验：是指受试物与正常细胞在体外接触，如有致癌作用，可使正常细胞形态、功能发生变化，发生与癌细胞相似的过程。,体外培养细胞观察内容：细胞生长自控能力、增殖速度、细胞形态、生化表型以及移植于动物体内形成肿瘤的能力等。,原理：,癌细胞与正常细胞的不同是其核型的改变和因此而导致的生长自控能力的丧失。细胞自控能力丧失可能导致细胞在离体培养时生长特性改变。,正常细胞：,在液体培养时，克隆中的细胞排列有序、只能生长成单层；,癌细胞：,贴壁生长的克隆失去接触抑制的能力，因而形成的“恶性转化”克隆中的细胞排列杂乱，重叠生长。,判断是否出现了细胞的恶变，须将转化的细胞植入试验动物体内，观察转化的细胞是否可发展成肿瘤。,恶变的细胞表现,细胞偏大，且大小不等；,核大而畸形，染色质深染而粗糙，核浆比例倒置，核膜粗厚，核仁增生而肥大；,核仁核胞浆因,RNA增多而偏酸性，呈嗜碱性染色而偏蓝；,多见核分裂现象；,正常的接触抑制消失，它的克隆是多层细胞且排列紊乱；,生长表型改变。,常用的细胞种类,细胞选择的主要原则：,1、体外容易培养和传代，阴性细胞克隆背景较低；,2、细胞自发突变率低，或自发转化能力很弱；,3、已获得无限生长能力，但仍保持接触抑制而无致 肿瘤性。,原代细胞：如,SHE细胞、人类成纤维细胞、小鼠皮肤或大鼠支气管上皮细胞等；,细胞系：BALB/C-3T3，C3H10T1/2，BHK-21；,病毒感染细胞：如RLV/RE细胞（劳舍尔白血病病毒感染的Fisher大鼠胚胎细胞）和SA7/SHE细胞（猿猴腺病毒感染的SHE细胞）。,优点：,试验周期短，经济方便；一个细胞克隆或细胞巢就相当于一只受试物；受试物直接与靶细胞作用，便于控制剂量，不受吸收、代谢、分布的影响，并且可不受体内免疫系统等干扰；便于观察。,缺点：,仍存在假阳性、假阴性等问题。,（一）哺乳动物短期致癌试验,小鼠肺肿瘤诱发试验,大鼠肝转变灶诱发试验,小鼠皮肤肿瘤诱发试验,雌性大鼠乳腺癌诱发试验,二、动物致癌试验,上述任一试验的阳性结果，其意义与长期动物致癌试验相当；但因试验期短、靶器官局限、适用化学物质类型较少，阴性结果意义不大。,（二）哺乳动物长期致癌试验,化学致癌物最大的特点是有一个较长的潜伏期，对于一个新化学物的致癌性评价，不可能也不容许等到数十年后才取得人肿瘤流行病调查资料方作出判断。动物致癌试验只需相对较短的时间，对动物进行终生染毒，即可取得资料。,可严格控制受试物进入机体的途径、剂量及动物的生活环境，从而排除其他因素对试验结果的干扰。,三、环境化学致癌物的评价,哺乳动物长期致癌试验,目的：确定受试化学物对实验动物的致癌性、剂量,-反应关系及靶器官。,何时考虑做该实验：,人体可能长期暴露于该化学物；,该化学物或其代谢物的化学结构与已知致癌物相似；,重复染毒毒性试验提示该化学物可能产生癌前病变。,（一）试验动物,物种和品系：在选择品系时应选择,较敏感、自发肿瘤率低、生活力强及寿命较长的品系,。,要求用,两种,实验动物，常规选用大鼠和小鼠，也可用仓鼠。,性别：为接近,人类,情况，应使用同等数量的,雌雄,两种性别的动物。,动物数：每组至少有雌雄各,50只动物，在出现第一例肿瘤时，每组还有不少于25只存活动物。,年龄：使用,刚断乳,的动物，以保证有足够长的染毒和发生癌症的时间，而且幼年动物解毒酶及免疫系统尚未完善，对致癌作用比较敏感。,2 剂量选择,致癌试验一般设三个试验组（即高、中、低）和一个对照组。,美国癌症研究所（NCI）推荐以最大耐受剂量(MTD)为高剂量：最大耐受剂量是由90天毒性试验来确定的，此剂量应使动物体重减轻不超过对照组的,10，,并且,不引起死亡及导致缩短寿命的中毒症状或病理损伤。,中及低剂量组则按等比级数下推，如分别为上一个剂量水平的,1/2或1/3。低剂量组应不影响动物的正常生长、发育和寿命，即不产生任何毒性效应。但低剂量组应,高于,人的接触剂量，一般不低于高剂量的,10,。中剂量组介于高、低剂量之间,.,同时应设阴性,(溶剂或赋形剂)对照组。必要时可设阳性对照组，阳性致癌物最好与受试物的,化学结构,相近。,3、染毒途径,经口染毒,是将受试物给予实验动物的常用途径，一般把受试物掺,人饲料或饮水中,连续给予动物,(57天/周)。若掺入后的适口性不良，可用,灌胃法,。掺入浓度要定期监测，观察其均匀性和稳定性，掺入的浓度一般不超过,5,。,经皮染毒,，涂敷受试物的面积一般不少于动物体表总面积的,10,。必须保证受试物与皮肤良好接触，并防止动物舔食。,吸入染毒,，每天染毒,4小时,，每周,57天。染毒柜内受试物浓度应定期或连续监测，其分布应均匀、恒定。,4、试验期限,ICH（人用药物注册技术要求国际协调会议,I,nternational,C,onference on,H,armonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use）,(1997)建议参考下面几条准则：,(1),一般情况下，试验期限小鼠和仓鼠应为,18,个,月，大鼠为,24,个,月；然而对于某些生命期较长或自发肿瘤率低的动物品系，小鼠和仓鼠可持续,24,个月，大鼠可持续,30,个月。2),当最低剂量组或对照组存活的动物只有,25,时,，也可以结束试验，对于有明显性别差异的试验，则试验结束的时间对不同的性别应有所不同，在某种情况下因明显的毒性作用，只造成高剂量组动物过早死亡，此时不应结束试验。,5、观察和结果分析,1）一般观察 每天,观察受试动物一次,，主要观察其外表、活动、摄食情况等。在实验,最初三个月每周称体重一次，以后每两周称体重一次,。经饲料或饮水给以受试物时，应记录,食物消耗量或饮水量,，,2）观察时要注意有无肿瘤出现、肿瘤出现时间及死亡时间。,3）病理检查 动物自然死亡或处死后必须及时进行病理检查，包括肉眼和组织切片检查。组织切片检查应包括已出现肿瘤或可疑肿瘤的器官和肉眼检查有明显病变的器官，应注意观察癌前病变。通过病理检查确定肿瘤的性质和靶器官。,6、观察和结果分析,（,1）,肿瘤发生率,(),(实验结束时患肿瘤动物总数/,有效动物总数,),100,式中，有效动物总数指,最早发现肿瘤时存活动物总数。,（,2）肿瘤潜伏期,：,动物从接触受试物起至出现第一个肿瘤的天数，这包括不同染毒时间剖杀的濒死或已死动物的肿瘤发生时间，要求剖杀时要仔细，以防漏检。,可将各组第一个动物出现肿瘤的时间作为该组的潜伏期。不易察觉的肿瘤则以第一个死亡的时间为改组的潜伏期。,致癌指数,肿瘤发生率（）,/,潜伏期（天）,100,当潜伏期缩短，且存在剂量-潜伏期关系时，也视为阳性。,（,3）肿瘤多发性：,肿瘤的多发性是化学物致癌的又一个特征，这包括一个器官出现多个肿瘤或多个器官出现肿瘤。故要计算各组的平均肿瘤数。当染毒组与对照组存在差异，并有剂量,-多发性关系，则认为是阳性。,计算时须注意：先计算全部肿瘤的发生率，然后将良性与恶性分开，还应注意统计不同器官组织肿瘤的发生率。,当染毒组肿瘤的发生率显著大于对照组，并呈现剂量,-反应关系，以及发生与对照组自发肿瘤类型不同的肿瘤等，均认为是阳性。,阳性结果的确定,任何一项指标与对照组相比出现差异并存在剂量,-反应关系，即使没有统计学意义，但是超出历史性对照范围，均视为阳性。,阴性结果的确定,实验设计的最低要求,:,二种种属,二种性别,至少三个剂量水平,其中一个接近最大耐受量,每组动物至少50只,肿瘤发生率与对照组比较无差异。,结果报告：,应着重报告发现肿瘤的部位、数量、性质、癌前病变，以及其他毒性效应；,应报告剂量,反应关系及统计学分析结果。,如在动物组织中观察到良性和恶性肿瘤，并有良性肿瘤向恶性化进展的证据，在进行统计学分析之前将良性和恶性肿瘤合并是适宜的，但仍希望分别对良性和恶性肿瘤分别进行统计学处理。,评价该试验不同剂量良性肿瘤和恶性肿瘤的相对数量可有助于确定该受试动物对受试物的剂量反应关系。,另一方面，如果仅观察到良性肿瘤，并无恶性化进展的证据，则将此受试物认为是致癌物是不适宜的，此仅提示在该试验条件下需要进一步研究。,作为致癌作用模型的转基因和基因敲除小鼠,1转癌基因小鼠：,与转录启动子连接的癌基因转入后可直接在某些特定的组织中高效表达，这类转基因动物是研究化学物致癌作用的敏感体系。,2肿瘤抑制基因敲除小鼠：,去除抑癌基因。,三、人群流行病学观察,肿瘤流行病调查的结果判断应遵循的原则：,1、证明接触者的发癌率高于对照组，或肿瘤病例中接触者的比例显著超过非肿瘤病例的配对对照,2、肿瘤接触者死亡年龄明显比非接触者提前,3、最好存在剂量-反应关系,4、能排除共存的其它因素作用的可能性,5、有动物致癌或细胞恶性转化试验支持,6、所得的结论能够重复,致癌物的确定和评价,动物致癌物的确定：,两种或两种以上种系的动物阳性；,一种种属但经两次或多次独立试验为阳性；,一种种属一次试验阳性，但发生率高，多个部位发生，出现罕见类型肿瘤、诱发肿瘤的时间短。,人类致癌物的确定：,能够重复的肿瘤流行病学调查结果；,有剂量反应关系；,动物致癌试验阳性。,第六节 阻断化学致癌过程的一些途径,一、控制致癌物的接触,对于已经明确鉴定出一些人类致癌物或致癌因素，应相应的采取预防措施，使人类避免或减少与之接触。如吸烟。,二、高危人群的检出与保护,1、常染色体显性遗传肿瘤（如视网膜瘤）家族成员杂合子。,2、常显有高度肿瘤好发倾向的疾病（如家族性肠道多发性息肉）的杂合子。,3、常隐有高度肿瘤好发倾向的疾病（如着色性干皮病、共济失调性毛细血管扩张症、先天性全血细胞减少症等）的病人及其杂合子。,4、有某些染色体异常的病人（如Down综合症）。,5、某些I相酶（如芳烃羟化酶）活性特别高或II相酶（如谷胱甘肽转硫酶）活性特别低的人。,6、抗氧化损伤能力（如超氧歧化酶或过氧化物酶）活性特别低的人。,7、某些有修复缺陷的人。,8、患有某些肿瘤经药物或手术治疗后的缓解期的病人。,9、高癌家族成员。,10、某些致癌物有大量接触的人。,三、化学预防,化学预防肿瘤药物的作用机制：,防止致癌物的生成,使有致癌活性的物质灭活,保护靶细胞，阻止致癌物作用于靶分子,修复靶分子的损伤，阻止癌变表型的表达,阻止癌变的发展,化学预防的措施,1、阻止摄入，降低吸收量,2、阻止致癌物在体内的生成,3、致癌物的体外灭活,4、阻断致癌物对靶分子的作用,5、调节基因表达与DNA修复功能,