分子影像研究中分子探针技术的进展.doc

分子影像研究中分子探针技术的进展键词:分子影像学分子探针分子医学的发展已经从根本上改变传统临床医学的检测、诊断和治疗的模式。分子医学包括分子诊断、分子治疗和分子影像三个部分。分子诊断是在体外以蛋白、RNA和DNA水平对疾病进行早期、特异性诊断，并对疾病治疗效果进行监测。分子治疗是阻止疾病发生、发展的关键步骤，在分子水平上进行特异性阻断或抑制，以达到预防和治愈疾病的目的。分子影像的诞生为疾病研究和诊断建立了一个全新的平台。分子影像技术的关键核心是分子探针。本文介绍分子影像探针技术的进展，希望我国分子影像工作者能够从分子影像学关键技术入手，加速我国分子影像技术的发展。为了系统阐述分子探针的制备和进展，我们从分子影像学简介、分子探针原理和制备、分子探针制备中注意的问题和分子探针的进展四个部分进行介绍。一 分子影像学简介分子影像学包括临床前期分子影像研究和临床分子影像应用两个部分。目前只有SPECT/CT、SPECT、PET、PET/CT、MRI(MRS)和分子荧光成像能够胜任临床分子影像工作。分子影像和目前的医学影像相比具有高特异性、高灵敏度和高图像分辨率等特点，能够真正实现无创伤，以及分子水平的临床诊断。并且提供以解剖结构为基础，以分子水平为基准的疾病发生和发展的信息，为临床对疾病诊断提供定位、定性、定量和对疾病分期的准确依据。一般而言，如果能够在基因改变的早期检测到不良变化的发生，就可以做到疾病早期发现和早期诊断。只有在分子水平认识疾病原因和变化，才能提出分子水平的治疗方案，达到疾病根治的效果。图1提示医学影像发展的过程和趋势，可以看出分子影像是今后医学影像发展的主要方向。1. 分子影像学基础分子影像是采用高特异的探针，无创地与体内细胞特定的分子靶位结合，以影像方式反映分子水平的变异信息。由于分子影像是在功能蛋白质水平对疾病进行研究，所以分子影像的本质是将先进的影像技术与生物化学、分子生物学等技术紧密结合，完成分子水平成像。分子影像具有高灵敏度和高特异性。由于分子影像的目的是建立高灵敏和高特异的无创伤性影像学方法，所以它研究的重点包括以下几个方面：(1)探讨细胞和特异性代谢、酶、受体及基因表达。目前临床广泛应用的CT、MRI及超声图像的特异性不能满足临床对特异性检测的要求，分子影像正好在这方面弥补了它们的不足。(2)以分子影像学手段进行靶向治疗药物和基因治疗方法的研究。(3)在分子病理学的基础上评价治疗效果和预后。(4)建立分子水平上药物代谢的动力学模型。(5)建立个性化治疗的平台。分子影像技术不但可用于研究人体疾病发生和发展过程，同时被用于人体生理、生化的研究。图2所示的是采用磁共振技术进行分子影像研究的示意图。2. 分子影像学在基础研究和临床中应用分子影像技术在基础研究和临床诊断中具有以下特点：(1)在生物体上可以重复进行生理、病理生理和生物化学的研究分析，具有良好的可对比性。特别是临床前期活体小动物研究，提供了在同一动物体上进行重复性研究的可能，并可通过精确定量分析获得准确的药代动力学模型，从而加速新药开发。(2)在基因表达和基因治疗疗效研究领域，分子影像技术是目前公认的最佳方法之一。尽管基因表达和基因治疗目前仍处于临床前期研究阶段，但是在研究基因技术对脑胶质瘤、干细胞对心肌缺血的治疗中，分子影像技术已显示了其独特的优势。(3)在进行酶和受体研究过程中，分子影像技术的无创检测能力很受临床的欢迎。分子影像技术已经成为临床前期研究的重要手段，由PET/CT、SPECT/CT和高场强MRI共同建立了新的临床分子影像平台。分子影像在临床有广泛的应用前景，但是目前分子影像、特别是临床分子影像还刚刚起步。临床应用最为广泛的是糖代谢显像、小分子显像、酶、受体和基因表达显像(图3)。3. 分子影像研究设备在应用中的选择MRI除了能够进行弥散成像和MRS在代谢水平成像外，对酶、受体和基因表达的显像剂研究还处于临床前的研究阶段。估计采用MRI进行临床酶、受体成像，还需要进行更多的临床实际应用研究。由于SPECT/CT系统的灵敏度和分辨率均不够理想，使SPECT/CT分子影像学应用受到一定限制。对于PET/CT而言，代谢研究已经是非常成熟的临床检查项目。分子影像设备各自的特点不同，CT、光成像、PET、常规核医学SPECT、MRI以及MRS成像设备的空间分辨率、时间分辨率和检测灵敏度，以及设备价格和使用成本等诸多方面存在差异，合理选用将有利于研究工作的开展(图4)。表1分别显示CT、光成像、PET、常规核医学SPECT、MRI以及MRS成像设备空间、时间分辨率。表中数据显示：MRI在空间和时间分辨率明显优于PET，光成像设备介于PET和MRI之间。而光成像设备和CT设备的成本要低于MRI和PET。尽管MRI在分子水平探测灵敏度方面不如PET，但是与PET相比MRI技术相对简单，因此易于普及，加上最新采用的分子纳米技术优化了MRI探针制备，从而推动MRI分子影像学的发展。光成像设备介于PET和MRI之间。而光成像设备和CT设备的成本要低于MRI和PET。PET设备具有更多的正电子放射性药物供临床及临床前期的研究，所以PET在分子影像的研究中发挥着重要的作用。表2所示的是各种分子影像设备在临床前期研究中实际应用技术方法。由于临床分子影像设备的探测器结构设计不断改进，使系统的分辨率和灵敏度得到较大提高。以前猴、兔等中型动物活体试验必须使用动物PET、动物MRI等设备，现在都能在临床分子影像设备上完成。目前在临床前期分子影像设备上主要进行裸鼠等小型动物模型的活体试验。对于荧光成像，由于受深度响应限制，在使用中存在一定的局限性。二 分子影像研究中分子探针原理和制备分子影像中的关键技术是分子探针的制备和应用，只有开发满足研究或临床需求的，具有高灵敏度、高特异性的分子探针，才能从根本上推动分子影像的发展。众所周知，分子影像设备的供应商不可能每年都推出新型的设备，也就是讲分子影像设备的发展是阶梯状，而分子影像中分子探针的开发和制备却是连续的。所以，从另外一个角度来看分子影像中分子探针的研究比分子影像设备开发更重要。对于PET、PET/CT和SPECT、SPECT/CT而言，探针就是放射性示踪剂。与MRI和光分子成像探针相比，放射性示踪剂形式的探针制备比较简单，但是成本要高得多。对于荧光素标记的荧光分子探针成本低、容易制备，可以在体外研究中使用。与放射性示踪剂和荧光素标记分子探针相比较，基于MRI的顺磁性分子探针使用得要少得多。1. 分子探针概念分子影像技术由于使用了分子探针技术，因此在成像方法和诊断效果上形成了与传统医学影像的本质区别。有了分子探针和相关的影像设备后才能够完成分子成像。分子探针(Molecular Probe)是一种特殊的分子，将该特殊分子引入体内(被称为分子探针)与组织、细胞特定的分子(被称为靶分子)特异性结合时产生可探测的信号，这些信号可以用PET、PET/CT、超高分辨率CT、MRI以及化学荧光或发光设备进行成像(图5)。分子探针是分子影像成像的关键，分子影像技术对分子探针的要求主要有以下几点：(1)分子探针必须具有生物学兼容性，能够在人体内参与正常生理代谢。同时分子探针必须以微量分子为标记物载体，从而不会对人体造成任何伤害。(2)分子探针必须能够克服体内生理屏障。人体内具有许多屏障，比如血脑屏障、血管壁、细胞膜等。分子探针必须通过这些屏障才能和目标靶分子结合。(3)分子探针要求与靶分子具有高灵敏度和特异性的结合。分子生物学载体具有与目标靶分子高灵敏和高特异结合的特点，分子探针正是利用了这一特点达到分子影像示踪剂的要求，从而出色地胜任临床特异性诊断的任务。常用的小分子探针有：与靶分子特异结合的受体、生物酶；单克隆抗体则归为大分子探针(图6)。按照临床诊断或基础研究的需要，可以选用不同分子生物学载体设计符合分子影像学要求的探针，以完成特异性诊断或研究的任务。2. 对从分子探针获得的生物信号进行放大PET、PET/CT和光成像在分子探针只需纳摩尔(Nanomolar)，甚至皮摩尔(Picomolar)浓度水平，就能够获得高质量图像。受探测灵敏度限制，即使使用高浓度分子探针成像，MRI获得的信号也非常小，需要成像前在体内和体外增强信号以改善图像质量。这种信号增强技术统称生物信号放大，对分子探针信号放大是分子影像设备设计中非常重要的部分。表3所表示的是不同影像技术达到探测要求时的探针浓度水平。从表中可以看出，对MRI分子影像技术而言，提高探测灵敏度是至关重要的。最近几年，提高MRI检测灵敏度的技术和方法有了明显进展，使MRI在分子影像领域取得了令人瞩目的迈进。MRI分子影像技术与PET(PET/CT)技术相比，具有简单、稳定和重复性好等优点，所以用MRI开展分子影像工作很受临床医生的欢迎。正是由于PET(PET/CT)分子影像技术具有高灵敏度特点，只需微量分子探针就可获得理想的图像，非常适合受体和酶等作为探针，用这类探针进行放射性核素标记，使其具有示踪特性以获取分子影像。3. 分子探针的制备随着标记技术的发展，特别是一些全自动化标记设备和药盒的商品化，使得分子探针的制备已日趋规范。图7 为采用放射性核素、荧光染料、稳定放射性核素13C、顺磁性元素制备分子探针的示意图。可以看出，分子探针由生物标志物和标记物两个部分组成。无论哪种标记技术，它们采用的生物标志物部分是基本相同的，只是采用的标记染料、放射性核素、磁性物质不同而已。探针是分子影像的基础和核心，分子影像若没有探针就像射击没有子弹一样。从制备分子探针的角度看，分子影像应该是一门独立的综合性学科。在分子探针制备中，首先需要考虑选择哪种标志物。目前研究中和正在使用的标志物有：有机化合物、多肽类和抗体类。从合成的难易程度比较，有机化合物最容易合成。有机化合物合成的成本低，但是有机化合物与组织细胞靶结合的特异性最差。抗体类与组织细胞靶位结合的特异性高，但是合成过程复杂，有时受检者存在过敏的问题。以多肽类作为标志物具有最佳的性价比。在确定探针的标志物后，我们就需要考虑选择哪种标记物的问题。对于分子探针也存在着“金标准”，一般将碳(11C，13C)或氢(3H)标记物制备的分子探针作为“金标准”。确立分子探针“金标准”后，可以采用荧光或放射性核素标记的探针作为替代的分子探针。对于顺磁性标记的分子探针，由于其对标志物性能影响较大，同时顺磁性金属元素使用的量较大，对人体存在毒性，所以仅仅局限于体外或有限的临床前期研究中。对于分子荧光和PET (PET/CT)，如果没有荧光物质和放射性核素标记示踪剂前体，就无法进行分子影像成像。但是MRI却不同，MRI探针包括标记物和体内非标记物两部分。MRI使用的某些探针即使未进行标记，仍然可以通过MRS频谱分析进行分子影像成像。标记探针的放射性核素可以选用124I、18F、11C、123I、99mTc；MRI探针标记物可以选用Gd、Fe、13C等，标记物选择是根据具体成像要求来决定的。目前发展的趋势是采用最佳性价比分子探针进行分子成像。比如，18F的放射性半衰期是11C的6倍，并且18F探针图像质量明显优于11C探针，采用18F标记的放射性示踪剂比11C标记的放射性示踪剂更具有临床实用性。进行MRI显像时，Gd标记的探针比13C标记的探针具有更高的性价比。对于受体显像探针不能只从性价比考虑，因为它需要一定比活度才能对图像进行精确的定量分析。三 分子探针制备的影响因素在分子影像成像过程中，分子探针决定了分子影像成像的特异性及灵敏度。选择的分子探针的标志物决定了分子探针的特异性高低，选择的分子探针标记物决定了分子探针成像的灵敏度。我们期望的是能够制备成本低，但是具有高特异性、灵敏度的分子探针。但是常常由于条件的限制不得不对分子探针的灵敏度、特异性和制备成本之间的制约做出必要的妥协。降低分子探针的标志物和标记物成本可能会降低分子探针的灵敏度和特异性，但是却提高了分子探针的实用和推广价值。1. 分子探针制备中分子标志物和标记物的选择分子探针中的探针的标志物决定整个分子探针的特异性，选择最佳的标志物是制备分子探针的基础和前提。分子探针制备需要有机化学、分子生物学、化学的基础知识和相关的制备工艺。分子探针的制备是一门专门的学科。图8是从探针标记难易程度、标记后对标志物结构和性能的影响、探针灵敏度和特异性等因素考虑选择探针标志物。从综合因素考虑目前采用多肽类作为探针生物标志物已经成为发展的趋势。在选择最佳的探针生物标志物后，需要对选择的生物标志物或其它的官能团进行保护，或是引入一些特定的离去基团以便于标记物进入标志物中。由于标志物不同，采用的官能团保护方法和引入离去基团的方法会有明显的不同。对于已经修饰的标志物需要考虑分子探针标记物选择的问题。再好的分子探针生物标志物，如果没有分子标记物标记那也无法进行分子影像成像。图9是从标记难易程度和标记成本、标记后对探针整体结构影响、标记后对分子探针生物学性能的影响等因素考虑如何选择放射性核素、荧光素或顺磁性的标记物。采用11C标记的分子探针是最佳选择，但是11C标记的分子探针存在成本高的问题。为此，一般采用11C标记的分子探针作为探针的“金标准”，开发低成本的分子标记物。比如，采用18F作为分子标记物取代11C标记的分子探针。相比较采用顺磁性金属作为分子标记物会对分子探针的生物学性能有不同程度的影响，对此需要特别注意。2. 影响分子探针稳定性的因素分子探针的特性不但在制备过程中会受影响，在应用过程中也会受多种因素的影响。这些包括分子探针标志物稳定性、结构和生物学特性等，以及制备后分子探针受酸碱度、保存温度、在体外保存时间、在体内环境等因素影响下的变化。在分子探针制备过程中需要注意的是选择高特异性的分子标志物，特别是在标记过程中需要保证分子探针生物学特性、物理化学性能的相对稳定性。对于取代反应标记的分子探针容易发生标记物脱落的现象，对于分子标记物通过螯合物形成的分子探针大多会在不同程度上影响分子探针的性能，尤其是一些采用顺磁性金属制备的MRI分子探针形成的胶体容易在肝脏聚集，因而形成一些假阳性结果。在分子探针制备后需要注意对分子探针的酸碱度进行调节，使其保持在中性的环境下。对于影响分子探针稳定的一些因素需要在探针制备过程和保存过程特加注意。四 分子探针制备技术进展如以上所述，分子探针是分子影像的核心。最近几年有关分子探针制备的理论和方法已经取得很大进步。这些包括：选择多肽类的生物标志物、选择高特异性和高选择性的标记方法、采用双标记或多标记的方法等。1. 选择多肽类作为分子探针的生物标志物多肽类既兼顾了单抗类特异性，又具有有机化合物类制备简单、成本低的特点。所以，采用多肽类作为分子探针的生物标志物已经成为一种发展的趋势。2. 采用高选择性、高度特异性的分子探针标记方法以前在选择分子标志物后，需要对分子标志物上一些官能团进行保护后才能采用分子标记物进行标记。最近采用高选择性、特异性分子探针的标记方法明显提高分子探针制备效率，降低分子探针制备的成本。3. 采用双标记或多标记方法制备分子探针由于放射性核素、荧光素或一些顺磁性的金属元素作为分子探针的标记物均具有一定的局限性。为了克服单一分子探针标记物的局限性，有时将放射性核素标记和荧光素标记结合起来，一个分子探针可以采用不同的成像设备进行分子成像，这样能加速分子探针研究，同时获得更多的分子信息。4. 建立同一标志物基础上的不同标记物平台，加速探针开发速度以前，不同标记方法需要制备不同的标志物。 这样不但增加了探针制备的成本，也增加了探针制备的过程。现在，可以选择同一标志物对于放射性核素标记、荧光标记、还是Gd等顺磁性标记均可以直接完成，不用对标识物进行修饰。综上所述，分子探针在制备过程和制备后保存也受到多种因素的影响。有效的控制这些影响因素对于分子探针制备至关重要。随着分子影像在临床前期研究和临床应用深度和广度的增加，分子影像学对分子探针的需求也在不断地提高。分子探针的制备在分子影像领域具有重要的价值。