DNA的生物合成复制专题市公开课一等奖省赛课微课金奖课件.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/10/3,#,(DNA Biosynthesis，Replication),第十一章 DNA生物合成,(复制),复制,是指以亲代DNA为模板合成子链DNA过程。,A,G,G,T,A,C,T,G,C,C,A,C,T,G,G,T,C,C,A,T,G,A,C,G,G,T,G,A,C,C,C,C,A,C,T,G,G,G,G,T,G,A,C,C,A,G,G,T,A,C,T,G,T,C,C,A,T,G,A,C,T,C,C,A,T,G,A,C,A,G,G,T,A,C,T,G,A,G,G,T,A,C,T,G,C,C,A,C,T,G,G,T,C,C,A,T,G,A,C,G,G,T,G,A,C,C,A,G,G,T,A,C,T,G,C,C,A,C,T,G,G,T,C,C,A,T,G,A,C,G,G,T,G,A,C,C,+,亲代DNA,复制叉,子代DNA,1/45,(Basic Rules and System of DNA Replication),第一节,复制基本规律与体系,复制方式半保留复制,固定起始点,双向复制,半不连续复制,复制高保真性,基本规律,一、复制基本规律,(一)半保留复制,1.概念,DNA合成时，以亲代DNA解开两股单链为模板，按碱基配对规律，合成子代DNA过程。子代DNA，一股单链起源于亲代另一股单链为新合成。子代和亲代DNA碱基序列一致。这种复制方式称为,半保留复制,。,2/45,(1)密度梯度试验,试验结果支持,半保留复制,构想。,含重氮-DNA细菌,培养于普通培养液,第一代,继续培养于普通培养液,第二代,梯度离心结果,2.半保留复制试验依据和意义,3/45,(2)子链继承母链遗传信息几个可能方式,全保留式(混合式)半保留式,按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA,碱基序列一致,，即子代保留了亲代全部遗传信息，表达了遗传,保守性,。是物种稳定性分子基础，但,不是绝正确,。,(3)半保留复制意义,4/45,1.,原核生物复制时，DNA从,起始点,向两个方向解链，形成两个延伸方向相反复制叉，称为,双向复制,。,(三)双向复制,复制中放射自显影示意图,环状双链DNA及,复制起始点,B.复制中两个复制叉,C.复制靠近终止点,ori,ter,A B C,(二)固定起始点,复制是从含有特异碱基序列复制起始点开始。原核生物(一个起始点)，真核生物(多个起始点)。,5/45,2.,真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。习惯上把两个相邻起始点之间距离定为一个,复制子,。复制子是独立完成复制功效单位。,5,3,ori,ori,ori,ori,5,3,5,5,3,3,5,5,3,复制子,3,6/45,(四)复制半不连续性,3,5,3,5,解链方向,3,5,3,3,5,领头链,(leading strand),随从链,(lagging strand),顺解链方向生成子链，复制为连续进行，称为,领头链,。,另一股链复制方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，称为,随从链,。,复制中不连续片段称为,岡崎片段(okazaki fragment),。,领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制,半不连续性,。,7/45,1.DNA-pol,核酸外切酶活性和及时校读,A：DNA-pol外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性掺入正确配正确底物。,B：碱基配对正确，DNA-pol不表现活性。,DNA-pol,外切活性,聚合活性,A,G,A:,C,G,B:,5,/,3,/5,/,3,/,无活性,(五)复制高保真性,8/45,2.复制保真性碱基选择,a)DNA聚合酶靠其大分子结构协调非共价(氢键)与共价键(磷酸二酯键)有序形成。,b)嘌呤化学结构能形成顺式和反式构型，与对应嘧啶形成氢键配对，嘌呤应处于,反式构型,。,3.DNA复制保真性依赖三种机制,a)恪守严格碱基配对规律。,b)聚合酶在复制延长时对碱基选择功效。,c)复制犯错时DNA-pol及时校读功效。,N,N,9,P-R,N,H,H,N,N,6,顺式,N,N,9,R-P,N,H,H,N,N,6,反式,9/45,二、,DNA,复制体系,(一),底物(,substrate),dATP,dGTP,dCTP,dTTP。,(二),模板(template),解开成单链DNA母链。,(三),引物(primer),提供3,-OH末端使dNTP能够依次聚合RNA(DNA)片断。,(四),酶和蛋白因子,1.DNA聚合酶,全称为,依赖DNADNA聚合酶(DNA-dependent DNA polymerase)，,简称,DNA-pol。,10/45,(1)活性：,5,3,聚合活性,；,3,5,外切酶活性,能识别错配碱基对，并将其水解；,5,3,外切酶活性,能切除突变 DNA片段。,5 A G C T T C A G G A T,A,3,|,3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5,?11/45,大肠杆菌,E.coli,中三种DNA聚合酶,分类,DNA聚合酶I,DNA聚合酶II,DNA聚合酶III,分子量(KD),109,120,900,聚合速率(核苷酸/分),1 000,60 000,5,3,聚合酶活性,+,+,+,3,5,外切酶活性,+,+,+,5,3,外切酶活性,+,生物学功效,切除引物,延长冈崎片段,DNA损伤修复,延长子链,校读作用,校读作用,DNA损伤修复,(2)原核生物DNA聚合酶,DNA-pol ,DNA-pol ,DNA-pol ,12/45,DNA-pol(109kD),小片段,5,核酸外切酶活性,大片段/Klenow 片段,DNA聚合酶活性 ，,5,核酸外切酶活性,N 端,C 端,木瓜蛋白酶,DNA-pol ,Klenow片段是试验室合成DNA惯用工具酶。,功效,:,对复制中错误进行校读，对复制和修复中出现空隙进行填补。,13/45,DNA-pol,(120kD),DNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活。它参加DNA损伤应急状态修复。,功效：,是原核生物复制延长中真正起催化作用酶。,DNA-pol (250kD),14/45,(3)真核生物DNA聚合酶,填补引物,空隙，切,除修复，,重组,延长子,链主,要酶，,解螺旋,酶活性,线粒体,DNA,复,制,起始引,发，引,物酶活,性,功效,+,+,+,-,-,3,5,高,高,高,？,中5,3,聚合活性,25.5,12.5,14.0,4.0,16.5,分子量（,kD,）,DNA,-,pol,填补引物,空隙，切,除修复，,重组,延长子,链主,要酶，,解螺旋,酶活性,线粒体,DNA,复,制,起始引,发，引,物酶活,性,+,+,+,-,-,3,5,外切,酶活性,高,高,高,？,中,5,3,聚合活性,25.5,12.5,14.0,4.0,16.5,分子量（,kD,）,DNA,-,pol,参加损伤与修复,生物学,15/45,(1)解螺旋酶(,helicase),利用ATP供能，打开氢键，使DNA双链解开成为两条单链。,(2)引物酶(primase),复制起始时催化生成RNA引物酶。,3)单链DNA结合蛋白(single stranded DNA binding protein,SSB),在复制中维持模板处于单链状态并保护单链完整。,2.其它酶与蛋白因子,稳定已解开单链,单链,DNA,结合蛋白,SSB,催化,RNA,引物生成,引物酶,DnaG,(,dnaG,),运输和协同,DnaB,DnaC,(,dnaC,),解开,DNA,双链,解螺旋酶,DnaB,(,dnaB,),识别起始点,DnaA,(,dnaA,),蛋白因子,通用名,功效,16/45,10,8,局部解链后,拓扑异构酶,切断,DNA,双链中,一股,链，使,DNA,解链旋转不致打结；适当初候封闭切口，,DNA,变为松弛状态,。,反应,不需,ATP,。,拓扑异构酶,切断DNA分子,两股,链，断端经过切口旋转使超螺旋松弛。利用,ATP,供能连接断端，DNA分子进入负超螺旋状态。,(4)DNA拓扑异构酶(DNA topoisomerase),指理顺DNA链，改变超螺旋状态酶，分为I型和II型。,17/45,(5)DNA连接酶(DNA ligase),连接DNA链3,-OH末端和相邻DNA链5,-P末端，使二者生成,磷酸二酯键,，从而把两段相邻DNA链连接成一条完整链。,3,HO,5,3,3,5,DNA,连接酶,ATP,ADP,5,3,5,18/45,第二节,DNA,复制过程,(The Process of DNA Replication),(一)复制起始,需要处理两个问题,DNA解开成单链，提供模板。,合成引物，提供3,-OH末端。,一、原核生物,DNA,生物合成,19/45,E.coli复制起始点 oriC,GATTNTTTATTT,GATCTNTTNTATT,GATCTCTTATTAG,1 13 17 29 32 44,TGTGGATTA-,-ACACATATT-,-,TTTGGATAA-,-,ACACCTATT,58 66 166 174 201 209 237 245,串联重复序列,反向重复序列,5,3,5,3,1,.DNA解链,起始点,20/45,Dna A,Dna B、Dna C,DNA拓扑异构酶,引物酶,SSB,3,5,3,5,2,.引发体和引物,含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域复合结构称为,引发体,。,21/45,3,5,3,5,引物是由引物酶催化合成短链RNA分子。,引物,3,HO,5,引物酶,22/45,5,3,5,dATP,dGTP,dTTP,dCTP,dTTP,dGTP,dATP,dCTP,OH 3,3,DNA-pol,复制延长指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP方式逐一加入引物或延长中子链上，其化学本质是磷酸二酯键不停生成。,(二)复制延长,23/45,领头链合成,1.领头链延长,领头链沿着5,/,3,/,方向能够连续延长。,24/45,2.随从链延长,25/45,复制简图,26/45,复 制 延 长 动 画,27/45,1.原核生物基因是环状DNA，双向复制复制片段在复制终止点(ter)处汇合,。,ori,ter,E.coli,82,32,ori,ter,SV40,50,0,(三)复制终止,28/45,5,5,5,RNA酶,OH,P,5,DNA-pol,dNTP,5,5,P,ATP,ADP+Pi,5,5,DNA连接酶,2.随从链上不连续性片段连接,29/45,哺乳动物细胞周期,DNA合成期,G,1,G,2,S,M,二、真核生物DNA生物合成,真核生物 DNA 复制在细胞周期S期进行，也可分为起始、延长和终止三个阶段，每个阶段基本过程与原核生物DNA复制相同，但存在不少差异。,30/45,1.真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同时起动。,2.复制起始需要DNA-pol（引物酶活性）和pol（解螺旋酶活性）参加。还需拓扑酶和复制因子(replication factor,RF)。,3.增殖细胞核抗原(proliferation cell nuclear antigen,PCNA),在复制起始和延长中起关键作用。,(一)复制起始,31/45,3,5,5,3,领头链,3,5,3,5,亲代DNA,随从链,引物,核小体,(二)复制延长,真核生物聚合酶催化子链延长，并有校正功效。引物和冈崎片段(约200bp)都比较短。,32/45,5,3,3,5,5,3,3,5,+,5,3,3,3,3,5,5,1.染色体DNA呈线状，复制在末端停顿。,2.复制中岡崎片段连接，复制子之间连接。,3.染色体两端DNA子链上复制RNA引物，去除后留下空隙。,(三)复制终止,33/45,1.,端粒(telomere),指真核生物染色体线性DNA分子末端结构。,TTTT,GGGG,TTTT,GGGG,(四)端粒与端粒酶,3.功效,维持染色体稳定性。,维持,DNA,复制完整性。,2.结构特点,由末端单链DNA序列和蛋白质组成。,末端序列是多重复富含G、C短序列。,4.,端粒酶,(telomerase),端粒酶RNA,(human telomerase RNA,hTR),端粒酶协同蛋白,(human telomerase associatedprotein 1,hTP1),端粒酶逆转录酶,(human telomerase reverse transcriptase,hTRT),34/45,5.端粒酶催化作用爬行模型,真核DNA复制后，两个5末端引物被切除，缺口无法填补，故DNA将面临屡次复制而逐步缩短问题。,35/45,第三节 DNA损伤与修复,突变(Mutation),是指DNA分子中碱基序列改变，又称为,DNA损伤(DNA damage),。,意义,突变是进化、分化分子基础,突变造成基因型改变,突变造成死亡,突变是一些疾病发病基础,(DNA Damage and Repair),36/45,一、引发突变原因,1.物理原因,紫外线(ultra violet,UV)、各种辐射,(一)自发原因,(二)诱发原因,复制过程中发生突变，,可发生10,-16,频率突变。,P,R,R,N,N,H,O,O,CH,3,N,N,H,O,O,CH,3,P,R,R,N,N,H,O,O,CH,3,N,N,H,O,O,CH,3,UV,嘧啶二聚体,37/45,2.化学原因,常见化学诱变剂,化合物类别,作,用,点,分子改变,碱基类似物,如：,5,-,FU,A,5,-,FU,G,-,A,-,T,-,-,G,-,-,C,-,羟胺类（,NH,2,OH,）,T,C,-,T,-,-,A,-,-,C,-,-,G,-,亚硝酸盐（,NO,2,）,C,U,-,G,-,-,C,-,-,A,-,-,T,-,烷化剂,如：氮芥类,G,m,G,G,m,G,DNA,缺失,G,3.生物原因,如逆转录病毒等。,38/45,(三)突变类型,错配,缺失,插入,重排,框移,DNA分子上碱基错配称,点突变,(point mutation),。,(1),转换:发生在同型碱基之间，即嘌呤代替,另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。,(2)颠换:发生在异型碱基之间，即嘌呤变嘧,啶或嘧啶变嘌呤。,1.错配(mismatch),2.重排(rearrangement),DNA分子内较大片段交换，称为重组或重排。,39/45,3.缺失(deletion)、插入(insertion)和框移(frame-shift),(1)缺失：一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分子上消失。,(2)插入：原来没有一个碱基或一段核苷酸链插入到DNA大分子中间。,(3)缺失或插入都可造成,框移突变,。,谷 酪 蛋 丝,5 ,G,C,A,G U A,C A U,G U C,丙 缬 组 缬,正常,5 ,G A G,U A C,A U G,U C,缺失,C,框移突变,是,指三联体密码阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列次序发生改变。,40/45,二、,DNA损伤修复,修复(repairing,),：,是对已发生分子改变赔偿办法，使其回复原有天然状态。,光修复(light repairing),切除修复(excision repairing),重组修复(recombination repairing),SOS修复,类型,41/45,P,R,R,N,N,H,O,O,CH,3,N,N,H,O,O,CH,3,P,R,R,N,N,H,O,O,CH,3,N,N,H,O,O,CH,3,(一)光修复,光修复酶(photolyase),UV,42/45,(二)切除修复,是细胞内最主要和有效修复机制，主要由DNA-pol和连接酶完成。,UvrA,UvrB,UvrC,OH,P,DNA聚合酶,OH,P,DNA连接酶,ATP,E.coli切除修复机制,43/45,切 除 修 复 动 画,44/45,(三)重组修复,(四)SOS修复,1.当DNA损伤难以复制时，而诱发出一系列复杂反应。,2.在E.coli，各种与修复相关基因，组成一个称为,调整子(regulon),网络式调控系统。,3.这种修复特异性低，对碱基识别、选择能力差。经过SOS修复，复制如能继续，细胞可存活。但DNA保留错误较多，造成较广泛、长久突变。,45/45,