实验二--革兰氏染色及细菌特殊结构观察.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,1、掌握细菌的简单染色法，初步认识细菌的形态特征,2、,学习细菌的革兰氏染色原理和方法,3、了解细菌的特殊形态结构：芽孢和荚膜,5、学习训练无菌操作技术。,实验目的,细菌细胞微小，透明，不易观察，需染上颜色。利用单一染料对细菌进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。,简单染色是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。,实验原理,1 细菌的简单染色,常用作简单染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等。,实验原理,(continued),常用碱性染料进行简单染色，因为在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色，经染色后的细菌与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。,菌悬液,滴加无菌水,取菌苔,操作步骤,涂片,固定,干燥,染色水洗,干燥镜检,1、涂片,取两块载玻片，各滴一小滴（或用接种环沾取）生理盐水（或无菌水）于玻片中央，用接种环以,无菌操作,分别从枯草杆菌和金黄色葡萄球菌斜面上挑取少许菌苔于水滴中，混合并涂成薄膜。,如用菌悬液或液体培养物，可用接种环挑取1-2环直接涂于载玻片上。,Notes:1）载玻片要洁净无油迹 2）滴生理盐水和取菌不宜过多 3）涂片要涂抹均匀，不宜过厚。,操作步骤（continued）,3、固定,固定的目的：,1）使细胞质凝固，以固定细胞形态；,2）并使菌体牢固地附着在载玻片上。,固定方法：,涂面朝上，通过火焰数次,注意：温度不宜过高，以玻片背面不烫手为宜，,否则会改变甚至破坏细胞形态,操作步骤（continued）,2、干燥 室温自然干燥,4、染色,将玻片平放于桌面上，滴加染液于涂片上（染液刚好覆盖涂片薄膜为宜）。,石碳酸复红染色约1min。,操作步骤（continued）,5、水洗,倒去染液，用洗瓶（或自来水）轻轻冲洗，直至涂片上流下来的水无色为止。,Note:水洗时，不要直接冲洗涂面，而应使水从载玻片的一端流下，水流不宜过急，以免涂片薄膜脱落。,7、镜检,一般使用油镜（100倍）观察细菌个体形态。,操作步骤（continued）,6、干燥,自然干燥或用电吹风吹干，也可用吸水纸吸干。,Notes:,必须等涂片完全干后才可滴加香柏油,油镜使用完毕，切记按规定步骤擦干净，否则可能损害镜头,涂片,干燥,固定,染色,水洗,干燥,镜检,操作步骤,无菌操作,3）擦油镜镜头方法：,A）先用擦镜纸揩去镜头上的香柏油,B）用擦镜纸沾少许乙醚酒精（二甲苯），擦拭镜头；,C）再用一小片擦镜纸擦去镜头上可能残留的乙醚酒精。,操作步骤,（continued）,单染色法只能观察微生物的大小、形状、和细胞排列状况，但不能鉴别微生物以及它的特殊构造等。,复染色法：用两种或两种以上染色液进行染色，有协助鉴别微生物的作用，故也称鉴别染色法。,2、革兰氏染色,常用的有：,革兰氏染色法,、芽孢染色法、抗酸染色法等。,G,细菌细胞壁,G,-,细菌细胞壁,细菌细胞壁的结构,G,菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性屏障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上。呈紫色。,G,菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，沙黄复染后呈红色。,G,+,和G,-,细胞壁的对比,革兰氏染色的实验原理,结晶紫初染,碘液媒染,乙醇脱色,番红复染,涂片固定,革兰氏染色的,步骤,1.,涂片,2.,初染,：滴加草酸铵结晶紫染液，染1分钟，倾去染液，流水冲洗至无紫色。,3.,媒染,：先用新配的路哥氏碘液冲去残水，而后用其覆盖涂面1分钟，后水洗。,4.,脱色,：除去残水后，,滴加,95%酒精进行脱色约1520秒后，立即用流水冲洗。,5.,复染,：滴加番红染色液，染35分钟，水洗后用吸水纸吸干。,6.,镜检,：观察染色结果并绘图。,大肠杆菌、金黄色葡萄球菌,Figure 1-A Gram stain of Gram+,Staphylococcus,cells.,Figure 2-Gram stain of Gram,E.coli,cells,3 枯草杆菌芽孢的染色,枯草芽孢杆菌（24h培养物）,1、制备菌液：加4-6滴蒸馏水于小试管中，用接种环从斜面挑取菌体3-5环于试管中充分混匀。（7人一组）,2、染色：加孔雀绿5滴于小试管中。,3、加热：沸水浴，15-20分钟。,4、涂片：,用接种环从小试管中取一环菌,涂于一干净载玻片上，制成涂片。,5、干燥、火焰固定,6、水洗：用水洗至流出的水中无绿色为止。,7、复染：加复红染色1-2分钟，水洗，吸水纸吸干。,、镜检：10 x，40 x、100X（油镜）观察。,4 细菌荚膜的染色,荚膜,负染色法：,胶质芽胞杆菌,1、制片：取洁净的载玻片一块，加一滴黑墨水，取少量的菌体放入墨水滴中混匀并涂片。,（,也可用,刮片法：另取一载玻片，以三十度角将其边缘浸入黑素中向右端拖动，将黑素涂成一薄层。）,2、镜检：10 x，,40 x,物镜观察（注意物镜不要接触黑素，,不要用油镜,观察）,实验报告,1、细菌简单染色、革兰氏染色的原理、方法和步骤。,2 记录所观察到的染色结果，并绘图,2、思考题,1）制备细菌染色标本时应注意哪些环节？,2）如果你的涂片未经热固定，将会出现什么问题？如果加热温度过高、时间过长，又会怎样？,3）为什么要等制片完全干燥后才能用油镜观察？,4）涂片为何要固定？固定加热时间过长会怎样？,要得到正确的革兰氏染色结果必须注意哪些操作？哪一步是关键？Why?,本次实验课结束,请确保油镜头擦拭干净！,本次实验安排,每人:,简单染色两片:,枯草芽孢杆菌(1218h)培养物,金黄色葡萄球菌,革兰氏染色两片:,金黄色葡萄球菌,大肠杆菌,芽孢染色1片:,枯草芽孢杆菌（24h培养物）,细菌荚膜染色1片:,胶质芽胞杆菌,