实验四-尿标本的微生物学检验.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2014/11/10,#,实验四,尿标本的微生物学检验,实验,目的：,掌握尿液标本的,采集与处理、常见病原菌及,一般微生物学检验程序和细菌计数方法。,掌握大肠杆菌、产气杆菌、变形杆菌的微生物学鉴定方法,和生物学性状,。,尿标本的采集与处理：,正常人的尿液通常是无菌的，但在外尿道除,有,正常菌群外，尚有其他一些病原菌和条件致病菌，可通过多种途径引起尿路感染（,urinary tract infection,UTI,）。如：葡萄球菌、链球菌、,肠球菌、,大肠埃希氏菌、变形杆菌等。,标本采集方法常有五种：导尿法、中段尿采集法、肾盂尿采集法、膀胱穿刺采集法、留尿法,。,1,）导尿法：采取导尿管导尿，是一种较好的无菌采集法，可直接插导管采集尿液标本或滞留导管集尿。直接导尿先让尿流弃,15ml,，滞留导管集尿先用,70%,酒精消毒导管口再用针筒抽取，取尿量为,10,15ml,，直接导尿有将尿道细菌进入膀胱的危险，尽量避免此方法。,2,）中段尿采集法：目前国内临床常用此法。女性病人先用肥皂水或,1:1000,高锰酸钾水溶液冲洗外阴及尿道口；男性病人应翻转包皮冲洗，用,1:1000,新洁尔灭消毒尿道口；用无菌生理盐水或无菌水冲去消毒液，再用灭菌纱布擦干，让病人排尿，弃去前段尿，收集中段尿,10,20ml,，置于无菌容器内，立即加盖送检。,3,）肾盂尿采集法：由泌尿科医生在膀胱镜下分别采集左右侧输尿管的尿液，并做好标记，以防左右侧错位，尿液采集量不少于,1ml,。,4,）膀胱穿刺采集法：在病人耻骨上膀胱区用碘酒、酒精消毒（要求病人不排尿充盈膀胱）以无菌针筒做膀胱穿刺，抽取尿液后针筒插入橡皮塞送检。此法主要用于,厌氧培养,。,5,）留尿法：疑为尿道结核患者，可用一洁净容器，留取,24h,尿液，取其沉淀部分盛于清洁瓶内送检。,通常取晨起第一次尿送检。,由于治疗所用药物多数均通过尿液排泄，因此，无论用何种方法采集尿液都宜在用药前进行。,尿液标本的采取和培养最大的问题是污染杂菌，故应严格进行无菌操作,尿液标本中,不得加防腐剂,，否则会影响检出的阳性率,。,尿液,标本,采集后要立即送检,（常规,2h,内）,或存放于,4,冰箱,（不超过,24h,，教材规定为,8h,）,，因搁置时间稍长尿中病原菌可在室温中增殖，而影响细菌计数的正确性。,应注意淋病奈瑟菌培养时标本不能冷藏保存。,检验程序：,革兰阴性杆菌,氧化酶（,Oxi,）,-+,肠杆菌科细菌 非发酵菌,氧化酶阴性非发酵菌,：不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌。,氧化酶阳性其他革兰阴性菌：,巴斯德菌、气单胞菌、邻单胞菌,和弧菌属等也是氧化酶阳性。,麦康凯平板（,Mac,）：,是一种肠道杆菌专用的弱选择性培养基。培养基成分中除基础成分外，主要含有,0.5%,胆盐、,1%,乳糖、中性红指示剂,。,胆盐,：,一方面对沙门氏菌有刺激生长作用，另一方面对革兰氏阳性菌及大肠,埃,希氏菌有抑制作用。,1%,乳糖,：,作为一种指示糖,。,中性红指示剂,：,pH6.8,8.4,，由红黄,。,（分解乳糖的细菌产酸，使菌落周围胆盐堆积变浑浊）,实验器材：,1,、,标本：,1,#,、,2,#,、,3,#,模拟尿液标本。,2,、,培养基：,BA,、,Mac,、普通营养琼脂、,KIA,、蛋白胨水、葡萄糖蛋白胨水、枸橼酸盐斜面、尿素、苯丙氨酸斜面、硝酸盐蛋白胨水。,3,、,试剂：,9.9ml,无菌生理盐水、革兰染液、氧化酶试剂、,3%H,2,O,2,、靛基质试剂、甲基红试剂、,VP甲液、,VP,乙液、,10%FeCl,3,、硝酸盐还原试剂甲液、硝酸盐还原试剂乙液。,4,、,其它：,无菌空平皿、载玻片等。,实验方法：,一、分离培养,用无菌,方法将,1,#,、,2,#,、,3,#,模拟尿液标本分别,划线接种于,BA,、,Mac,上，置,35,培养,18,24,小时。,二、直接涂片染色,取,上述,1,#,、,2,#,、,3,#,标本分别,作涂片、革兰氏染色、镜检,。（要求绘图并描述）,三、细菌计数（倾注平板法）,0.1ml,尿液,9.9ml,无菌,NS,混匀,取,0.1ml,（,1:1000,稀释）标本,无菌空平皿 倾入,10,15ml,加热融化并冷至,50 ,的无菌营养琼脂，混匀,35,培养,18,24h,。,0.1ml,尿液,9.9ml NS,1:100,稀释标本,0.1ml,总稀释倍数,1:1000,四、结果观察：,1,、细菌计数,1,）结果记录：,2,）结果计算：,每,ml,尿液细菌数,=,菌落平均数,稀释倍数,3,）结果判断标准：,尿标本中细菌的计数，主要是根据尿中细菌的多少来判断是否感染。一般认为，细菌计数：,10,4,/ml,为污染,10,5,/ml,为感染,10,4,10,5,/ml,为可疑,目前认为由革兰氏阴性杆菌引起的菌尿，其菌数均可达到,10,5,/ml,，而球菌所引起的菌尿，其菌数达到,10,4,/ml,，即可作为尿路感染的标准（因不同细菌繁殖速度快慢不一，在同一时间内细菌繁殖数应该是：革兰氏阴性杆菌葡萄球菌肠球菌）。为此，作菌尿计数时，必须与涂片染色结果结合，作出报告。,以下几种情况均可使尿液中菌数,10,4,/ml,：,（,1,）,应用了低敏感性抗菌药物，尿液中细菌受到一定抑制。,（,2,）,患者大量输液或使用利尿剂后。,（,3,）,尿液,pH,值失常，当,pH,5.8,或,pH,8.5,时，细菌生长受阻。,（,4,）,尿频时，膀胱内的菌停留时间短则细菌数少。,（,5,）,某些菌的繁殖能力低。,2,、菌落形态描述：,（,BA,、,Mac,分别描述）,1,#,标本：,2,#,标本：,3,#,标本：,3,、菌体形态观察：,分别取,1,#,、,2,#,、,3,#,标本的,BA,、,Mac,培养物涂片、革兰染色、镜检。（要求绘图并描述、对比,BA,、,Mac,菌体形态差异）,BA,：,Mac,：,五、鉴别试验,:,1,、氧化酶（,Oxidase,）试验：,原理：,氧化酶又称细胞色素氧化酶，是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸酶。氧化酶试验中，酶并不直接与试剂（,1%,盐酸四甲基对苯二胺或,1%,盐酸二甲基对苯二胺）起反应，而是首先使细胞色素,c,氧化，然后氧化型细胞色素,c,使对苯二胺氧化，出现显色反应。,试剂：,1,盐酸四甲基对苯二胺或,1,盐酸二甲基对苯二胺,方法：,直接法和试剂纸片法,直接法：用滤纸片刮取待检菌菌落（切勿刮到培养基），在有菌的位置滴加氧化酶试剂，,1,分钟内观察结果。,结果判断：,立即出现红色，继而逐渐加深为阳性（,盐酸四甲基对苯二胺,呈现蓝紫色为阳性,），,不变色为阴性。,意义,：,本试验应用广泛，如奈瑟菌属、假单胞菌属、莫拉菌属呈阳性，肠杆菌科细菌呈阴性。,2,、触酶试验：,六、生化鉴定：,将,1,#,、,2,#,、,3,#,标本分别,接种于,KIA,、蛋白胨水、葡萄糖蛋白胨水、枸橼酸盐斜面、尿素、苯丙氨酸斜面、硝酸盐蛋白胨水中,，置,35,培养,18,24,小时,。,1,、,KIA,（,克氏双糖铁,）,试验：,原理,1,、,营养非常丰富,2,、葡萄糖：乳糖,1,：,10,3,、指示剂为酚红：,变色范围,6.0,8.6,，,pH8.6,显红色,4,、含有硫代硫酸钠,5,、含有,Fe,2,方法：,直接观察结果。,21,只分解葡萄糖,分解葡萄糖和乳糖,产生气体,产生,H,2,S,结果判断,22,结果表示：,不产酸，产酸，产酸产气,产酸,A,产碱,K,斜面,/,底层,H,2,S,斜面,/,底层,H,2,S,产气,/,A/,A,/,K/,A,24,2,、,吲哚（靛基质）试验,:,原理：,色氨酸,色氨酸酶,吲哚、丙酮酸和氨,对二甲基氨基苯甲醛,玫瑰吲哚,吲哚,25,方法,:,结果,:,应用：,用于肠杆菌科细菌的鉴定。,26,3,、,甲基红试验（,MR,试验）,4,、,VP,试验,27,原,理：,变色范围,4.4,6.2,28,方,法及结果：,29,甲基红实验结果,阴性 阳性,30,VP,实验结果,阳性 阴性,31,应用：,主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。,MR VP,大肠埃希菌,产气肠杆菌,32,IMViC,I:,吲哚试验,M:,甲基红试验,V:V-P,试验,C:,枸橼酸盐利用试验实验,33,5,、枸橼酸盐利用试验,原理：,某些细菌能利用培养基中的枸橼酸钠作为唯一,的碳源而获得能量，能利用枸橼酸盐的细菌也能利,用铵盐作为唯一氮源，同时产生氨。分解枸橼酸盐,使培养基变碱性。,方法：,直接观察结果。,应用：,肠杆菌科细菌的鉴定,34,35,6,、,尿素酶试验,原理：产生尿素酶的细菌分解培养基中的尿素，产生碳酸铵是培养基,pH,，酚红由浅红色变成深红色。,36,方法：,直接观察结果,。,结果,：,反,应时间因细菌而异,。培养基变成深红,色为阳性。,应,用,：,肠,杆菌科细菌的鉴定。,37,7,、,苯丙氨酸脱氨酶试验：,原理：,38,方法：,待,检菌大量接种于苯丙氨酸琼脂斜面上，培养后在斜面上直接加,4,5,滴,10,氯化铁试剂，出现绿色为阳性，立即观察，为可逆反应,。,39,40,8,、硝酸盐还原试验,：,原理,：,有些细菌具有还原硝酸盐的能力，可将硝酸盐还原为亚硝酸盐、氨或氮气等。亚硝酸盐与硝酸盐还原试剂中的醋酸作用生成亚硝酸，亚硝酸与试剂中对氨基苯磺酸作用，生成重氮苯磺酸，重氮苯磺酸与,-,萘胺结合成红色的,N-,-,萘胺偶氮苯磺酸。,方法：,在硝酸盐蛋白胨水培养物中分别滴加硝酸盐还原试剂甲液和乙液各,1,2,滴，混匀，立即观察结果。,41,阳性：,加入试剂后,30s,变成红色，表明有亚硝酸盐存在，表示硝酸盐还原试验阳性。,阴性：,加入试剂后没有颜色反应，可能是：,硝酸盐没有被还原,(,真阴性反应,),；,硝酸盐被还原成非亚硝酸盐的其他产物，如,NH3,、,N2(,脱硝作用,),、,NO,或,N2O,和羟胺等。由于此试剂只检测亚硝酸盐，上述产物会导致假阴性结果。因此，需要加少量锌粉于阴性反应中，锌离子还原硝酸盐为亚硝酸盐，加入锌粉后变成红色，表示有剩余的硝酸盐存在，证明是真正的阴性反应。,结果判断：,42,43,应用：,肠杆菌科除某些生物型与欧文菌属外，均还原硝酸盐为亚硝酸盐；铜绿假单胞菌、嗜麦芽假单胞菌等假单胞菌可产生氮气，需加入锌粉证实。阳性对照菌为大肠埃希菌，阴性对照菌为醋酸钙不动杆菌无硝变种。,菌名,KIA,硝,酸,盐,还,原,试,验,吲,哚,甲,基,红,MR,V,P,枸,橼,酸,盐,Cit,脲,酶,Ure,苯丙,氨酸,脱氨,酶,Pad,氧,化,酶,试,验,触,酶,试,验,乳,/,葡,H,2,S,气,体,Gas,大肠艾希菌,A/A,+,+,+,+,产气肠杆菌,A/A,+,+,+,+,+,变形杆菌,K/A,+,+,+,+,+,+,+,+七、实验结果：,结果报告：,1,#,标本检出,2,#,标本检出,3,#,标本检出,实验讨论：,作业：,1,、查,5,篇关于尿标本检验常见病原菌文献，例出文献名及每篇文献中前五种常见菌。,2,、尿液标本分离培养选择,Mac,的目的？,3,、产气肠杆菌尿素酶试验出现假阳性的可能原因？,实验讨论：,作业：,1,、查,5,篇关于尿标本检验常见病原菌文献，例出文献名及每篇文献中前五种常见菌。,2,、尿液标本分离培养选择,Mac,的目的？,3,、产气肠杆菌尿素酶试验出现假阳性的可能原因？,实验讨论：,作业：,1,、查,5,篇关于尿标本检验常见病原菌文献，例出文献名及每篇文献中前五种常见菌。,2,、尿液标本分离培养选择,Mac,的目的？,3,、产气肠杆菌尿素酶试验出现假阳性的可能原因？,