基因工程目的基因的制备优品文档.ppt

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library,）,10,2,、基因文库的大小,一个理想的基因组文库应该是在克隆群体中包含完整基因组的所有,DNA,序列。,DNA,片段要有足够的长度，保证含有某个完整的基因序列。,估算：基因组文库的克隆数目,=,基因组,DNA,总长,/DNA,片段的平均长度。,如：,310,6,kb/15kb=210,5,11,经验值约比理论值大,4.5,倍。,基因组越大，包含的克隆数越多，反之越少。,12,3,构建,噬菌体基因组文库的步骤,对,DNA,进行随机切割，以获得一定大小的含目的基因的,DNA,片段。,部分消化,基因组,DNA,20kb,的,DNA,片段,13,切割方法：,物理学方法：机械力和超声波。,生物化学法：酶切,为满足切割的随机性，一般采用识别序列为,4bp,的限制酶。,如,Sau,3AI,或,Mbo,I,等切后的片段可直接与,Bam,H I,酶切的载体连接。,切割后通过凝胶电泳或密度梯度离心，回收一定大小范围的,DNA,片段。,14,与,噬菌体克隆载体连接重组。,噬菌体载体的酶切：,两臂与中央片段相连处有,Sal,I,Bam,HI,和,Eco,RI,酶切位点。两臂中原有的酶切位点被除去。,采纳,Bam,HI,，因为该酶切产生的粘性末端与,Sau,3AI,或,Mbo,I,切割末端结构一样，采用,Sau,3AI,或,Mbo,I,酶解产生的,DNA,片段可直接与噬菌体的,Bam,HI,酶切位点连接。,Bam,HI,切割载体后，电泳或离心将两臂与中央片段分离，回收两臂。,左臂,右臂,中央片段,15,在,T4 DNA,连接酶的作用下载体两臂与外源,DNA,片段连接。,16,Bam,HI sites,Left arm,Right arm,COS,COS,Bam,HI,COS,COS,L,R,COS,COS,L,R,回收,17,重组,DNA,分子在体外包装成噬菌体颗粒，转染宿主后铺板筛选培养，即可得到某种生物的基因组文库。,18,14/31,重组的噬菌体,体外包装,19,（,1,）、用,Cosmid,作载体构建基因组文库的优点：,可容纳更大片段（,30-45kb,），文库中所需克隆数少。,载体本身的分子很小，一般只有,5kb,，便于直接分析插入片段的酶切图谱。,4,、构建,Cosmid,质粒基因组文库,20,（,2,）、缺点：,筛选困难：杂交检测难度大，携带外源片段大，复制困难，拷贝数少。,重组效率低：大片段易出现机械性断裂而不具备粘性末端。,文库不易贮存：噬菌体的重组,DNA,群体比含有,Cosmid,质粒的细菌菌落易贮存。,21,（,3,）、基因文库的构建过程,与噬菌体载体文库的过程大致相似，区别有,在外源,DNA,片段的分离要特别小心，防止断裂。,载体处理时只须酶切，不须进一步分离酶切产物，去除中央片段。但酶切后要用碱性磷酸酶去,5,磷酸防止环化。,22,连接重组时，载体量高出外源片段的,10,倍，保证外源片段最在限度地与载体连接。,包装后的重组颗粒转染宿主时，在,37,度预吸附,20min,，加入,1ml,培养液，继续培养,45min,，再铺板，培养后出现的是菌落，不是噬菌斑。,23,YAC,：酵母人工染色体,适合克隆长达数百,kb,的大片段。,常用的,YAC,载体为,pYAC4,。,首先，用,Bam,HI,Eco,RI,双酶切载体，形成双臂，回收两臂。,其次，制备生物完成,DNA,，用低浓度,Eco,RI,部分消化，纯化后与,YAC,连接。,然后转化去壁的酵母细胞，并进行筛选。,5,、构建,YAC,基因组文库,24,23/31,外源基因,Eco,RI,部分消化,基因组,DNA,DNA,片段,25,基因组很大，有重复序列和非编码序列。,通常表达基因占,15%,，产生约,15000,种,mRNA,。,从,mRNA,分离目的基因更容易。,可把,mRNA,反转录成,cDNA,，构建,cDNA,文库，从中分离目的基因。,三、,cDNA,文库的构建及目的基因的分离,26,1,、,cDNA,基因文库的概念,（,1,）、某生物基因组转录,mRNA,经反转录产生的各种,cDNA,片段分别与克隆载体重组，贮存在一种受体菌群体中，这样的群体称为该生物的,cDNA,文库。,27,（,2,）、缺点：,只反映,mRNA,所携带的信息。不能反映内含子、启动子和终止子及核糖体识别,mRNA,相应的序列。,只包含特定组织、特定发育阶段的基因。,28,（,3,）、优点：,A,、,mRNA,为材料，特别适用于,RNA,病毒。,B,、克隆数少，筛选比较简单。,C,、假阳性出现概率小。出现假阳性则有意义，可证明其它片段上也出现该基因序列。,D,、,cDNA,中无内含子序列可适用于原核生物的直接转化入表达。,F,、通过与基因组,DNA,文库比较，可用于分析真核基因结构组织和表达。,29,（,4,）、分类：,表达型：采用表达载体构建，插入的,cDNA,片段可表达产生蛋白，具有抗原性或生物活性。,常用的：,gt11 cDNA,文库,适用于蛋白质氨基酸序列未知的，不能采用核苷酸探针筛选的基因而用抗体或化合物进行筛选。,30,非表达型,cDNA,文库：适于采用核苷酸探针进行杂交筛选的目的基因的分离研究。,常用的：,gt10 cDNA,文库,核苷酸探针可从部分蛋白质序列中推测，人工合成寡核苷酸探针。,31,根据载体不同分为：,质粒,cDNA,文库：包含克隆数少，适于高丰度的,mRNA,噬菌体,cDNA,文库：包含克隆数多，适于低丰度的,mRNA,。,32,2,、,cDNA,文库的构建,包括以下几步,:,细胞总,RNA,的制备及,mRNA,的分离,cDNA,第一条链的合成,双链,cDNA,的合成,cDNA,与载体的连接,噬菌体颗粒的包装转染或质粒的转化。,33,（,1,）、分离细胞总,RNA,，纯化出,mRNA,。,tRNA,、,rRNA,和,mRNA,mRNA,占总,RNA,的,1-5%,，种类繁多，分子大小不一。,显著特征：,3,端有,poly(A),。,用,Oligo(dT,）结合在纤维素柱上，带,poly(A),的,mRNA,可结合在柱上，而其它,RNA,则不能，从而使其与其它,RNA,分开。,34,（,2,）、以,mRNA,分子为模板合成,cDNA,第一链：,以,mRNA,为模板，在逆转录酶的作用下，利用适当的引物合成的。,引物：,oligo(dT),引物：从,3,端开始，适于较短的,mRNA,。,随机引物：在,mRNA,的任何位置开始，适于较长的,mRNA,。,35,（,3,）、双链,cDNA,的合成：,A,、自我引导合成：,用碱处理使,mRNA-DNA,杂交分子中的,mRNA,降解，,cDNA,第一链解离，单链,cDNA 3,端自身环化，形成一个发夹环结构。在,DNA,聚合酶的作用下产生一个完整的发夹结构双链,cDNA,，,S1,核酸酶将发夹切去，即可。,缺点：,S1,酶会多切，而丢失信息。,36,AAAAA,AAAAA,TTTTT,AAAAA,TTTTT,碱处理后，,S1,核酸酶,引物结合,逆转录酶,DNA,聚合酶,37,B,、大肠杆菌,RNaseH,酶降解取代法：,RNaseH,酶可识别,mRNA-DNA,杂交分子，将其中的,mRNA,模板消化成许多短片段。,这些短片段可作为引物，在,DNA,聚合酶作用下合成第二链,cDNA,，通过,DNA,连接酶将缺口补平。,38,AAAAA,AAAAA,TTTTT,AAAAA,TTTTT,RNaseH,DNA,聚合酶,+,连接酶,引物结合,逆转录酶,39,C,、,oligo(dG),寡聚引物引导法,在第一链,cDNA,分子尚未与,mRNA,分离之前，在其,3,端加上一段,oligo(dC),序列,再碱性蔗糖梯度离心处理，使,mRNA,降解，回收全长,cDNA,再以互补,oligo(dG),序列作引物，引导第二链合成。,此法无发夹结构，不用,S1,核酸酶。,40,AAAAA,AAAAA,TTTTT,碱性蔗糖梯度离心，水解,RNA,回收,cDNA,Oligo(dG)DNA,聚合酶,引物结合,逆转录酶,TTTTT,CCCCC,5,3,AAAAACCC,TTTTT,CCCCC,5,5,5,CCCCC,GGGGG,TTTTT,41,D,、,PCR,法：,以,cDNA,的第一链为模板，设计一组引物，用,PCR,扩增获得双链,cDNA,。,42,AAAAA,AAAAA,TTTTT,AAAAACCC,TTTTT,碱性蔗糖梯度离心，水解,RNA,回收,cDNA,引物结合,逆转录酶,CCCCC,TTTTT,CCCCC,5,3,5,5,5,Sal CCCCC,Sal GGGGG,TTTTTTT Not I,加,PCR,引物,Sal I-GGGGG,TTTTTTT-Not I,AAAAAA Not I,43,（,4,）、将,cDNA,双链重组到质粒或噬菌体上导入大肠杆菌宿主细胞。,A,、标准方法将,cDNA,甲基化。防酶切,B,、末端转移酶加尾或加适当的衔接头 与适当方法处理的载体连接。,C,、将重组,DNA,转化大肠杆菌宿主。,常用的载体是,gt10/gt101,，一般不用转化效率低的质粒。,44,AAAAAA,TTTTTTT,Eco RI,位点,cDNA,Eco RI,甲化酶,AAAAAA,TTTTTTT,AAAAAA,TTTTTTT,Eco RI,衔接物,DNA,连接酶,Eco RI,酶切,AAAAAA,TTTTTTT,Eco RI,位点,Eco RI,酶切,co s,位点,co s,位点,co s,位点,co s,位点,连接后体外包装,感染大肠杆菌,45,46,表达型,cDNA,文库的构建演示,24,47,3,、,mRNA,丰度与,cDNA,文库大小,总,mRNA,中某种基因的,mRNA,数量越多，,cDNA,文库中贮存该基因工程概率越大，越容易分离。高丰度的,mRNA,构建较小的,cDNA,文库即可，反之，则构建大的文库。,文库大小的理论公式：,cDNA,克隆数,=,细胞总,mRNA,数,/,某种,mRNA,的拷贝数,细胞总,mRNA,数为,500500,个,某种,mRNA,的拷贝数,3500,文库最小为,500500/3500=143,个,48,经验值是理论值的,4.5,倍左右,49,四、利用,PCR,扩增目的基因,采用,PCR,进行,DNA,的克隆省时、省力，但要求对待扩增的,DNA,片段的序列必需已知，至少要求,DNA,片段的两端约,20bp,序列是已知的。,PCR,的有以下几种类型：,50,1,、套式,PCR,两对引物扩增同一样品的方法。从一个,DNA,模板的同一区域扩增出不同长度的片段而设计。,外侧引物,内部引物,51,2,、反向,PCR,酶切线性,DNA,模板,连接成环，或加上接头后再连接成环。,用另一种酶切环中已知序列上的酶切位点。,利用已知序列设计引物,PCR,扩增出未知序列。,52,已知序列,未知序列,未知序列,用限制性内切酶,1,去切,连接环化,已知序列中有,1,个限制性内切酶,2,的位点,酶,2,切,已知序列,已知序列,PCR,53,3,、长程,PCR,常规,PCR,扩增几,kb,长程可扩增,10kb,聚合酶：,LA Taq,酶，,EX Taq,酶。,模板纯度和完整性高,引物长度,30-35bp,（常规,20bp,），浓度为,0.1-1mmol/L,（常规,：,0.2-1mol/L,）,54,反应程序：,94 1min,，,98 20s,68 15min(,复性及延伸,),30,循环,55,4,、反转录,PCR,RT-PCR,提取,RNA,反转录合成,cDNA,以,cDNA,为模板进行,PCR,扩增。,56,五、人工化学合成,已知序列,计算机控制的全自动核酸合成仪。,57,第二 节 目的基因的分离,从基因文库中分离。,58,一、功能克隆,1,、根据特异蛋白分离目的基因,方法一：,分离特异蛋白,测定氨基酸序列，推测基因核苷酸序列。,合成核苷酸探针。,筛选基因文库,59,为了获得全部可能的顺序，通常要合成一组混合的核苷酸探针，其中只有一条是和目的基因完全互补，在筛选时可能出现多个假阳性反应。,由于遗传密码的简并性，多数氨基酸有2种或多种遗传密码，一种氨基酸顺序存在多种可能的DNA顺序。,1-1mmol/L（常规：0.,筛选困难：杂交检测难度大，携带外源片段大，复制困难，拷贝数少。,2-1mol/L）,碱性蔗糖梯度离心，水解RNA回收cDNA,利用基因中部分保守序列设计合成探针，筛选基因文库获得全序列。,2、cDNA文库的构建,B、大肠杆菌RNaseH酶降解取代法：,C、将重组DNA转化大肠杆菌宿主。,F、通过与基因组DNA文库比较，可用于分析真核基因结构、组织和表达。,用Oligo(dT）结合在纤维素柱上，带poly(A)的mRNA可结合在柱上，而其它RNA则不能，从而使其与其它RNA分开。,载体本身的分子很小，一般只有5kb，便于直接分析插入片段的酶切图谱。,四、利用PCR扩增目的基因,第二 节 目的基因的分离,文库是表达型，有表达的蛋白与抗体反应。,五、Differential display of mRNAmRNA差别显示技术,设计的探针最短,15-16bp,，通常,17-20bp,。,由于遗传密码的简并性，多数氨基酸有,2,种或多种遗传密码，一种氨基酸顺序存在多种可能的,DNA,顺序。,为了获得全部可能的顺序，通常要合成一组混合的核苷酸探针，其中只有一条是和目的基因完全互补，在筛选时可能出现多个假阳性反应。,60,“,猜测体”探针：,一条或很少的几条。,制备探针时，选择密码子简并性尽可能少的蛋白质顺序，或者根据不同生物密码子使用频率的差异加以推测。,61,方法二：,将分离的特定蛋白作为抗原，,免疫动物制备抗体。,用特异的抗体筛选含目的基因的表达型文库。,62,注意事项：,文库是表达型，有表达的蛋白与抗体反应。,一般以融合形式表达目的基因。将,cDNA,插入到细菌基因的下游，使细菌的基因与插入基因相连，表达时生生一个融合蛋白，比产生天然蛋白要稳定，也可产生高水平的表达。,必须考虑,cDNA,在表达载体中的方向和阅读框架问题，以保证目的基因的正确表达。,63,2功能互补法克隆基因。,将重组,DNA,分子导入一种大肠杆菌营养缺陷型菌株的受体细胞，,然后将此受体细胞在缺少所需要的营养底物的基本培养基培养。,只有那些获得了营养缺陷型互补基因的受体才会长成转化菌落。,64,二、序列克隆法,1,、根据已知基因序列分离目的基因,.,利用基因中部分保守序列设计合成探针，筛选基因文库获得全序列。,65,探针,杂交,覆盖膜印迹,取下膜,杂交位点与菌落比对,66,2,、表达序列标签法,表达序列标签（,expressed sequence tag,，,EST,）：指基因序列中一段能特异地标记或表征基因的序列，它含有足够的结构信息以显示出该基因与其他基因的差异，长度为,100-150bp,。,利用,EST,寻找新基因的策略称表达序列标签法。,67,基本步骤：从组织特异性或细胞特异性的,cDNA,文库中随机挑选克隆，进行末端测序（测定,400bp,）。,通过对,GenBank,、,EMBL,或其他核苷酸序列数据库进行联机检索，可以检测出所测定序列及其对应的多肽氨基酸序列。将检测的序列与基因库中已知的基因进行同源性比较，可检测到许多已知基因，还可以发现许多新的未知基因。,最后，通过基因文库的筛选或,PCR,技术分离目的基因。,68,三、差别杂交法,1,、适用范围：,适用于在特定组织中或发育的特定阶段表达的基因以及受生长因子调节的基因。,适用于以特殊处理诱导表达的基因。,69,抗病烟草,感病烟草,分离,mRNA,分离,mRNA,构建,cDNA,文库转入,E.coli.,反转录合成探针,反转录合成探针,杂交,杂交,复印到两张硝酸纤维素膜上分别与两种探针杂交,目的基因克隆,70,四、减法杂交技术,又称减数杂交。,71,待去除的一种组织或状况下的,mRNA,称为“驱动,mRNA”,（如不抗病水稻的,mRNA,），以此为模板，以,oligo(dT)25,流动磁珠（结合在流动磁珠上的,oligo(dT)25,）为引物合成驱动,cDNA,。,另一种组织或状况下所含有需要保留的,mRNA,称为“目的,mRNA”,（抗病水稻中的抗病基因），以此为模板合成目的,cDNA双链,72,将目的,cDNA,双链加到过量的驱动,cDNA,单链,流动磁珠中进行分子杂交。,能与驱动,cDNA,杂交的目的,cDNA,分子通过驱动,cDNA,结合在磁珠上，未杂交的分子被分离出来。其中应包括抗病基因的,cDNA,。,73,驱动,cDNA-,磁珠,目的,cDNA,双链,杂交,建库,除去,74,五、,Differential display of mRNAmRNA,差别显示技术,原理与步骤,75,（,4,种核苷酸，两两组合共有,4*4=16,种如下：,）,AA,AU AC AG,，,UA,UU UC UG,，,CA,CU CC CG,，,GA,GU GC GG,其中,Poly(A),上游不包含,poly(A),的两个核苷酸组合有,12,种。,5-AUGCCCGUAUACGGU,A,G,A,AAAAAAA-3,5-AUGCCCGUAUACGGUA,G,U,A,AAAAAA-3,5-AUGCCCGUAUACGGUA,G,C,A,AAAAAA-3,5-AUGCCCGUAUACGGUA,G,G,A,AAAAAA-3,mRNA,上有,12,种组合：,AU,、,AC,、,AG,、,UU,、,UC,、,UG,、,CU,、,CC,、,CG,、,GU,、,GC,、,GG,76,以,oligo(dT)MN,为引物，以,mRNA,为模板反转录合成,cDNA,时，可有,12,种引物，,T11MN,，,M,为,T,以外的任何核苷酸（,A,，,C,，,G,），,N,为任何一种核苷酸（,A,，,T,，,C,，,G,）。,5-AUGCCCGUAUACGGU,AU,AAAAAAAAAAAAAA.A-3,TATTTTTTTTTTT-5,mRNA,上有,12,种组合：,AU,、,AC,、,AG,、,UU,、,UC,、,UG,、,CU,、,CC,、,CG,、,GU,、,GC,、,GG,对应,12,种引物：,T11,分别加上,TA,、,TG,、,TC,、,AA,、,AG,、,AC,、,GT,、,GG,、,GC,、,CT,、,CG,、,CC,称为锚定引物。,77,用上述,12,种引物的任何一种均可将mRNA,群体的,1/12,分子转录成,mRNA-cDNA,杂交分子。,5-AUGCCCGUAUACGGUAUAAAAAAAAA-3,3-TACGGGCATAACCCATATTTTTTTTTTT-5,然后，以一种由,10bp,的,5,端随机引物和上述,3,端锚定引物做,PCR,。,用,12,种,3,端锚定引物和,20,种,5,随机引物进行,PCR,，可有,240,组引物，大约能得到,20000,条,DNA,条带，大体可涵盖某种细胞中的全部,mRNA,种类。,78,抗病种,感病种,一对引物可扩增,60-160,条,DNA,片段，大小,100500bp,，两个样品的,PCR,产物采用,PAGE,分析，只有一个样品表达的,DNA,可鉴定出来。,特异性条带,从凝胶中切下基因，纯化,cDNA,标记,cDNA,作为探针筛选基因文库。,79,优点：,1),方法快速,2),采用,PCR,法，适用低丰度基因,3),可同时分析多个样本,80,三、cDNA文库的构建及目的基因的分离,B、末端转移酶加尾或加适当的衔接头 与适当方法处理的载体连接。,2)采用PCR法，适用低丰度基因,再加入抗体1的抗体进行免疫反应。,mRNA上有12种组合：AU、AC、AG、UU、UC、UG、CU、CC、CG、GU、GC、GG,为了获得全部可能的顺序，通常要合成一组混合的核苷酸探针，其中只有一条是和目的基因完全互补，在筛选时可能出现多个假阳性反应。,筛选困难：杂交检测难度大，携带外源片段大，复制困难，拷贝数少。,1、cDNA基因文库的概念,另一种组织或状况下所含有需要保留的mRNA称为“目的mRNA”（抗病水稻中的抗病基因），以此为模板合成目的cDNA双链,以mRNA为模板，在逆转录酶的作用下，利用适当的引物合成的。,只包含特定组织、特定发育阶段的基因。,切割后通过凝胶电泳或密度梯度离心，回收一定大小范围的DNA片段。,缺点：,差别条带多，假阳性率高，重复性差，对高拷贝数的,mRNA,有强的倾向性。,在差异片段中不知道哪些是未知基因。,得到的差异条带短，一般为,110,450bp,；,以,poly(A),为引物，只适合真核生物。,12,种,T12MN,，,20,种随机引物，要进行,240,次,PCR,，工作量大。,6,）,PAGE,可检测,500bp,的片段，可能漏检。,81,复习题,mRNA,差别显示技术的基本原理。,已获得一个抗病烟草品种和一感病烟草品种，如何克隆抗病品种中的抗病基因？（三套方案）,已获得某生物中的一种蛋白质，如何克隆该蛋白质的基因？（三套方案）,82,感谢观看,