基因工程的工具及操作程序优品文档.ppt

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基因结构,有调控遗传信息表达的核,苷酸序列，在该序列中，,最重要的是位于编码区上,游的,RNA,聚合酶结合位点。,启动子,补：真核细胞的基因结构,编码区,非编码区,非编码区,与,RNA,聚合酶,结合位点,内含子,外显子,能够编码蛋白质的序列叫做外显子,不能够编码蛋白质的序列叫做内含子,启动子,终止子,编码区上游,编码区下游,内含子：,外显子：,原核细胞,真核细胞,不同点,编码区是,_,的,编码区是间隔的、,_,的,相同点,都由能够编码蛋白质的,_,和具有调控作用的,_,区组成的,原核细胞与真核细胞的基因结构比较,思考,编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？,连续,不连续,编码区,非编码,什么叫基因工程？,基因工程又叫,基因拼接技术,或,DNA,重组技术,。该技术是在,生物体外,，通过对,DNA,分子进行人工“,剪切,”和“,拼接,”，对生物的基因进行,改造,和,重新组合,，然后,导入受体细胞,内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内,表达,，产生出人类所需要的,基因产物,。,（一）基因工程的概念,基因工程的别名,操作环境,操作对象,操作水平,基本过程,实质,结果,基因拼接技术或,DNA,重组技术,生物体外,基因,（,DNA,）分子水平,人类需要的基因产物,剪切,拼接,导入,表达,基因重组,基因工程培育抗虫棉的简要过程：,普通棉花,(,无抗虫特性,),苏云金芽孢杆菌,提取,抗虫基因,与运载体,DNA,拼接,导入,棉花细胞,(,含,抗虫基因,),棉花植株,(,有,抗虫特性,),上述培育抗虫棉的关键步骤是什么？,基因工程培育抗虫棉的关键步骤：,关键步骤一：,抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内,提取出来,关键步骤二：,抗虫基因,与运载体,DNA,连接,关键步骤三：,抗虫基因,导入受体,(,棉花,),细胞,解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？,关键步骤一的工具：,关键步骤二的工具：,关键步骤三的工具：,基因的,剪刀,限制性内切酶,基因的,针线,DNA,连接酶,基因的,运载工具,运载体,1.,限制性核酸内切酶,“,分子手术刀”,限制酶是在生物体,(,主要是,微生物,),内的一种酶，能将外来的,DNA,切断,，由于这种切割作用是在,DNA,分子内部进行的，故名限制性内切酶。（原核细胞内的,限制修饰系统,）,特点：特异性。,即,一种,限制酶,只能识别一种,特定的,核苷酸序列,，并且能在,特定的切点,上切割,DNA,分子。,（二）,DNA,重组技术的基本工具,大肠杆菌,(E.coli),的一种限制酶,能识别,GAATTC,序列,，并在,G,和,A,之间切开。,限制酶,限制酶,什么叫黏性末端？,被限制酶切开的,DNA,两条单链的切口，带有几个,伸出的核苷酸,，他们之间正好,互补配对,，这样的切口叫,黏性末端,。,游的RNA聚合酶结合位点。,A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来,将目的基因导入动物细胞,特点：特异性。,2）噬菌体或某些动植物病毒,最常用的质粒是大肠杆菌的质粒，其中常含有抗药基因，如四环素的标记基因。,再加入适量_，形成了一个重组,2）载体DNA必须有一个或多个限制酶切点，以便目的基因插入到载体上去。,最常用的质粒是大肠杆菌的质粒，其中常含有抗药基因，如四环素的标记基因。,编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？,A、能复制 （）,操作过程麻烦，mRNA很不稳定，要求的技术条件较高,要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？,要切两个切口，产生四个黏性末端。,如果把两种来源不同的,DNA,用同一种限制酶来切割，会怎样呢？,会产生,相同的黏性末端,，然后让两者的黏性末端,黏合,起来，就似乎可以合成重组的,DNA,分子了。,2.DNA,连接酶,“,分子缝合针”,DNA,连接酶,可把黏性末端,之间的缝隙,“,缝合,”起来，即把梯子两边扶手的断口连接起来，这样一个重组的,DNA,分子就形成了。,外源基因,(,如抗虫基因,),怎样才能导入受体细胞,(,如棉花细胞,),？,导入过程需要运输工具,运载体,。,运载体的作用有哪些？,作用一,：作为运载工具，将外源基因,(,抗虫基因,),转移,到受体细胞,(,棉花细胞,),中去。,作用二,：利用运载体在受体细胞,(,棉花细胞,),内，,对外源基因,(,抗虫基因,),进行,大量复制,。,作为运载体必须具备哪些条件？,1,）能够在宿主细胞中,复制,并稳定地,保存,。,2,）载体,DNA,必须有一个或多个,限制酶切点,，以便目的基因插入到载体上去。,3,）具有某些,标记基因,，便于进行,筛选,。,如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等。,载体,DNA,必须是安全的,不会对受体细胞有害,或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去,;,3.,基因进入受体细胞的运载,”,分子运输车”,常用的运载体主要有两类：,1,）细菌细胞质的,质粒,2,）,噬菌体,或某些,动植物病毒,质粒：,质粒是染色体外能够进行,自主复制,的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中核区外的,DNA,分子。现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中,核以外的,DNA,分子,。,质粒,是基因工程,最常用,的,运载体,。,绝大多数细菌质粒都是,闭合环状,DNA,分子,。有的一个细菌中有一个，有的一个细菌中有多个。,大肠杆菌的质粒：,最常用的质粒,是,大肠杆菌的质粒,，其中常含有,抗药基因,，如四环素的标记基因。质粒的,存在与否对宿主细胞生存没有决定性作用,，但,复制只能在宿主细胞内成,。,基因工程基本操作的四个步骤,1,、目的基因的获取,2,、基因表达载体的构建,3,、将目的基因导入受体细胞（并筛选）,4,、目的基因的检测与鉴定,一、目的基因的获取,1,、目的基因主要是指,_,编码蛋白质的结构基因,请举出三个以上的例子,2,、获取目的基因的常用方法有哪些,1,）鸟枪法,（,2,）反转录法,（,3,）化学合成法,(,一,),从基因文库中获取目的基因,将含有某种生物不同基因的许多,DNA,片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库,基因文库,基因组文库,部分基因文库,（如,:cDNA,文库）,1.,基因文库,基因组文库与部分基因文库的关系,怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢,?,2.,基因文库的构建方法,鸟枪法：,供体细胞中的,DNA,许多,DNA,片段,运载体,限制酶,与载体连接,载入,受体细胞,产生特定性状,导入,外源,DNA,扩增,目的基因,分离,(,直接分离法,),(,一,),从基因文库中获取目的基因,反转录法：,以目的基因转录成的信使,RNA,为模板，反转录成互补的单链,DNA,，然后在酶的作用下合成双链,DNA,，从而获得所需的基因。,目的基因的,mRNA,杂交双链,(,单链,RNA/,单链,DNA),单链,DNA,反转录酶,核酸酶,H,2.,基因文库的构建方法,DNA,聚合酶,双链,DNA,(,目的基因,),根据已知的氨基酸序列合成,DNA,法：,根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使,RNA,序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。,蛋白质的氨基酸序列,mRNA,的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列推测,推测,目的基因,化学合成,2.,基因文库的构建方法,上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？,优点,缺点,鸟枪法,反转录法,根据已知氨基酸合成,DNA,法,操作简便广泛使用,工作量大，盲目，分离出来的有时并非一个基因,专一性强,操作过程麻烦，,mRNA,很不稳定，要求的技术条件较高,专一性最强,仅限于合成核苷酸对较少的简单基因,(,二,),利用,PCR,技术扩增目的基因,概念：,PCR,全称为,_,，是一项,在生物,_,复制,_,的核酸合成技术,条件：,_,、,_,、,_(,做启动子,),、,_.,前提条件：,原理：,_,方式：,以,_,方式扩增，即,_,（,n,为扩增循,环的次数）,结果：,聚合酶链式反应,体外,特定,DNA,片段,DNA,复制,已知基因的核苷酸序列,四种脱氧核苷酸,一对引物,DNA,聚合酶,指数,2,n,使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增,(,二,),利用,PCR,技术扩增目的基因,过程：,a,、,DNA,变性,（,90-96,）：双链,DNA,模板,在热作用下，,_,断裂，形成,_,b,、退火,（,复性,25-65,）：系统温度降低，引 物与,DNA,模板结合，形成局部,_,。,c,、延伸,（,70-75,）：在,Taq,酶的作用下，从,引物的,5,端,3,端,延伸，合成与模板互补,的,_,。,氢键,单链,DNA,双链,DNA,链,1.,用一定的,切割,质粒，使其出现一个切,口，露出,_,。,2.,用,_,切断目,的基因，使其产生,_,_,。,(,二,),基因表达载体的构建,核心,3.,将切下的目的基因片段插入质粒的,_,_,处，,再加入适量,_,，形成了一个重组,DNA,分子（重组质粒）,限制酶,黏性末端,同一种限制酶,的黏性末端,切口,DNA,连接酶,相同,质粒,DNA,分子,限制酶处理,一个切口,两个黏性末端,两个切口,获得目的基因,DNA,连接酶,重组,DNA,分子（重组质粒）,核心,同一种,(,二,),基因表达载体的构建,4.,过程,:,5.,基因表达载体的组成：,复制原点,+,启动子,+,目的基因,+,终止子,+,标记基因,它们有什么作用？,(,三,),将目的基因导入,受体细胞,转化,方法,将目的基因导入,植物细胞,将目的基因导入,动物细胞,将目的基因导入,微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,感受态细胞法,将含有目的基因的重组载体与相应的受体细胞放在一起培养，通过一定的方式进行诱导，进入受体细胞的过程。,受体细胞的选择？,1,、将目的基因导入植物细胞的方法：农杆菌转化法,（,1,）农杆菌介绍,（,2,）原理及适用范围,(,三,),将目的基因导入受体细胞,2,、将目的基因导入动物细胞,（,1,）方法：显微注射法,（,2,）程序：,(,三,),将目的基因导入受体细胞,将目的基因导入动物细胞,(,三,),将目的基因导入受体细胞,3,、将目的基因导入微生物细胞,（,1,）思考：为什么选用微生物作为受体细胞？,（,2,）方法：,3.,将目的基因导入微生物细胞,大肠杆菌细胞最常用的转化方法是,:,首先用,Ca,2+,处理细胞,以,增大,细菌,细胞壁的通透性,使细胞处于一种能吸收周围环境中,DNA,分子的生理状态,这种细胞称为感受态细胞,.,第二步是将重组表达载体,DNA,分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合,在一定的温度下促进感受态细胞吸收,DNA,分子,完成转化过程,.,第三步,目的基因在受体细胞内，随其繁殖而,复制,，由于细菌,繁殖的速度,非常快，在很短的时间内就能获得,大量,的目的基因。,1,）将细菌用,CaCl,2,处理,，以,增大,细菌,细胞壁的通透性,。,2,）使含有目的基因的,重组质粒进入,受体细胞。,3,）目的基因在受体细胞内，随其繁殖而,复制,，由于细菌,繁殖的速度,非常快，在很短的时间内就能获得,大量,的目的基因。,限制性核酸内切酶“分子手术刀”,都由能够编码蛋白质的_和具有调控作用的_区组成的,基因工程的理论基础：思考？,将目的基因导入动物细胞,如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等。,检测目的基因是否翻译成蛋白质,C、目的基因须由运载体导入受体细胞,用一定的_切割,游的RNA聚合酶结合位点。,大肠杆菌细胞最常用的转化方法是:,a、DNA变性（9096）：双链DNA模板,基因进入受体细胞的运载”分子运输车”,即一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子。,最常用的质粒是大肠杆菌的质粒，其中常含有抗药基因，如四环素的标记基因。,在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是 （）,基因工程又叫基因拼接技术或DNA重组技术。,常用的运载体主要有两类：,(,四,),目的基因的检测与鉴定,检查是否成功,检测,鉴定,检测转基因生物染色体的,DNA,上是否插入了目的基因,检测目的基因是否转录出了,mRNA,检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,方法,方法,方法,DNA,分子杂交（,DNADNA,）,分子杂交（,mRNA-cDNA,）,（注意与上不同之处）,抗原,-,抗体杂交,DNA,分子杂交示意图,采用一定的技术手段，将两种生物的,DNA,分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。,基因探针：,是一段带有放射性同位素或荧光标记，含有目的基因的,DNA,单链。,使探针与转基因生物的基因组,DNA,杂交，如果显示出杂交带，就表明目的基因已插入染色体,DNA,中。,1.,限制性核酸内切酶,“,分子手术刀”,一，基因工程的基本工具,2.NDA,连接酶,“,分子缝合针”,3运载体,“,分子运输车”,知识梳理：,二，基因工程基本操作的四个步骤,1,、目的基因的获取,2,、基因表达载体的构建,3,、将目的基因导入受体细胞（并筛选）,4,、目的基因的检测与鉴定,（一）目的基因的获取,1,、目的基因主要是指,_,编码蛋白质的结构基因,请举出三个以上的例子,2,、获取目的基因的常用方法有哪些,?,（,1,）鸟枪法,（,2,）反转录法,（,3,）化学合成法,上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？,优点,缺点,鸟枪法,反转录法,根据已知氨基酸合成,DNA,法,操作简便广泛使用,工作量大，盲目，分离出来的有时并非一个基因,专一性强,操作过程麻烦，,mRNA,很不稳定，要求的技术条件较高,专一性最强,仅限于合成核苷酸对较少的简单基因,1.,用一定的,_,切割,质粒，使其出现一个切,口，露出,_,。,2.,用,_,切断目,的基因，使其产生,_,_,。,(,二,),基因表达载体的构建,核心,3.,将切下的目的基因片段插入质粒的,_,_,处，,再加入适量,_,，形成了一个重组,DNA,分子（重组质粒）,限制酶,黏性末端,同一种限制酶,的黏性末端,切口,DNA,连接酶,相同,质粒,DNA,分子,限制酶处理,一个切口,两个黏性末端,两个切口,获得目的基因,DNA,连接酶,重组,DNA,分子（重组质粒）,核心,同一种,(,二,),基因表达载体的构建,4.,过程,:,基因表达载体的组成：,复制原点,+,启动子,+,目的基因,+,终止子,+,标记基因,它们有什么作用？,(,三,),将目的基因导入,受体细胞,转化,方法,将目的基因导入,植物细胞,将目的基因导入,动物细胞,将目的基因导入,微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,感受态细胞法,将含有目的基因的重组载体与相应的受体细胞放在一起培养，通过一定的方式进行诱导，进入受体细胞的过程。,受体细胞的选择？,筛选,利用选择培养基进行筛选（标记基因）,(,四,),目的基因的检测与鉴定,检查是否成功,检测,鉴定,检测转基因生物染色体的,DNA,上是否插入了目的基因,检测目的基因是否转录出了,mRNA,检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,方法,方法,方法,DNA,分子杂交（,DNA-DNA,）,分子杂交（,RNA-cDNA,）,（注意与上不同之处）,抗原,-,抗体杂交,基因工程的理论基础：思考？,所有生物的,DNA,都由相同的四种脱氧 核苷酸组成,所有的生物共用一套遗传密码,探究活动：,DNA,分子的提取与鉴定,教科书把,DNA,的提取与鉴定放在基因工程的内容中，目的是让学生理解,DNA,的,提取与鉴定是开展基因工程的基石，只有将,DNA,分子从细胞中提取出来，才能进一步对其进行检测、,“,切割,”,、插入目的基因、,“,缝合,”,、最后导入受体细胞使之表达,通过探究活动培养学生的实际操作能力和科学探究能力,1,）以下说法正确的是 （）,A,、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列,B,、质粒是基因工程中唯一的运载体,C,、运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接,D,、基因控制的性状都能在后代表现出来,C,练习,2,）不属于质粒被选为基因运载体的理由是,A,、能复制,（）,B,、有多个限制酶切点,C,、具有标记基因,D,、它是环状,DNA,D,练习,3,）有关基因工程的叙述中，错误的是（）,A,、,DNA,连接酶将黏性末端的碱基对连接起来,B,、限制性内切酶用于目的基因的获得,C,、目的基因须由运载体导入受体细胞,D,、人工合成目的基因不用限制性内切酶,A,练习,4,）有关基因工程的叙述正确的是 （）,A,、限制酶只在获得目的基因时才用,B,、重组质粒的形成在细胞内完成,C,、质粒都可作为运载体,D,、蛋白质的结构可为合成目的基因提供,资料,D,练习,5,）基因工程是在,DNA,分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是 （）,A,、人工合成目的基因,B,、目的基因与运载体结合,C,、将目的基因导入受体细胞,D,、目的基因的检测和表达,C,练习,感谢观看,