12基因工程的基本操作程序z4班l.pptx

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基因结构,编码区,非编码区,外显子：能编码蛋白质的序列,内含子：不能编码蛋白质的序列,：调控，上游有启动子，下游有终止子,非编码序列包括非编码区和内含子,编码区,非编码区,非编码区,与RNA聚合,酶结合位点,内含子,外显子,启动子,终止子,编码区上游,编码区下游,原核细胞,真核细胞,不同点,编码区是,_的,编码区是间隔的、_的,相同点,都由能够编码蛋白质的_和具有调控作用的_区组成的,原核细胞与真核细胞的基因结构比较,连续,不连续,编码区,非编码,(一)从基因文库中获取目的基因,1.什么是基因文库？种类？如何构建？,2.怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？,一、目的基因的获取,依据：目的基因的有关信息。,如：,根据基因的核苷酸序列,基因的功能,基因在染色体上的位置,基因的转录产物mRNA,基因翻译产物蛋白质,等特性1有关目的基因的获取和基因文库的理解，不正确的是(),A目的基因可以从自然界中分离，也可以人工合成,B目的基因主要指编码蛋白质的结构基因,C基因文库就是基因组文库,DcDNA文库只含有某种生物的一部分基因,2下列属于获取目的基因方法的是,利用mRNA反转录形成从基因文库中获取,从受体细胞中提取 利用PCR技术扩增,利用DNA转录 人工合成,A B,C D,D,C,(二）利用PCR技术扩增目的基因,PCR技术多聚酶链式反应,原理：,前提：,条件：,DNA双链复制,一段已知目的基因的核苷酸序列,四种脱氧核苷酸,一对引物,热稳定DNA聚合酶(Taq酶）,DNA的两条链为模板,温度控制,一、目的基因的获取,复习：,1、目的基因？,2、获取目的基因的常用方法有哪些?,3、什么是基因文库？种类？,5、原核细胞与真核细胞的基因结构？,6、怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？,4、基因组文库？cDNA文库？,变性：,加热至,90,95,双链DNA解链成为单链DNA,退火：,冷却至,55,60,部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合,延伸：,加热至,70,75,以目的基因为模板，合成互补的新DNA链,退火,变性,延伸,(二）利用PCR技术扩增目的基因,(三),通过DNA合成仪用化学的方法直接人工合成,一、目的基因的获取,前提：基因比较小，核苷酸序列已知。,是获取目的基因的最方便方法,1、在已知序列信息的情况下，获取目的基因的最方便方法是,A、化学合成法 B、基因组文库法,C、cDNA文库法 D、多聚酶链式反应,2、下列获取目的基因的方法中需要模板链的是,从基因文库中获取目的基因 利用PCR技术扩增目的基因 反转录法 通过DNA合成仪利用化学方法人工合成,A B,C D,A,D,3.下表关于基因工程中有关基因操作的名词及对应,的内容，正确的组合是,C,4、在基因工程中，把选出的目的基因（共1000个脱氧核苷酸对，其中腺嘌呤脱氧核苷酸是460个）放入DNA扩增仪中扩增4代，那么，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是,A.540个 B.8100个 C.17280个 D7560个,B,5、目的基因主要是指_的结构基因。获得目的基因的常见方法有三种：（1）从基因文库中获取目的基因，根据基因的_序列，基因在_上的位置，基因的_产物mRNA，基因的_产物蛋白质等获取目的基因。（2）利用PCR技术扩增目的基因，该技术是一项在_完成的核酸合成技术，前提条件是有一段已知目的基因的_序列，以便于合成_。（3）如果基因较小且核苷酸序列已知，可以通过_方法。,编码蛋白质,核苷酸,染色体,转录,表达,体外,核苷酸,引物,人工合成,二、基因表达载体的构建,（核心）,(1)用一定的_切割,质粒，使其出现一个切,口，露出_。,(2)用_切断目,的基因，使其产生_,_。,(3)将切下的目的基因片段插入质粒的_处，,再加入适量_，形成了一个重组,DNA分子（重组质粒）,限制酶,黏性末端,同一种限制酶,的黏性末端,切口,DNA连接酶,相同,1、目的：,2、过程：,基因表达载体的组成：,a、,目的基因,b、,启动子,c、,终止子,d、,标记基因,2、下列关于基因表达载体的叙述不正确的是,A基因表达载体的构建视受体细胞及导入方式不同而有所差别,B启动子和终止子都是特殊结构的DNA短片段，对mRNA的转录起调控作用,C标记基因是为了鉴别受体细胞中是否有目的基因从而便于筛选,D启动子是与RNA聚合酶识别和结合的部位，是起始密码,D,1、（多选）一个基因表达载体的构建应包括,A目的基因 B启动子 C终止子 D标记基因,ABCD,三、将目的基因导入受体细胞,转化,方法,将目的基因导入,植物细胞,将目的基因导入,动物细胞,将目的基因导入,微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,感受态细胞,目的基因进入_内，并且在受体细胞内维持_和_的过程,受体细胞,稳定,表达,1、基因工程中科学家常用细菌、酵母菌等微生物作为受体细胞，原因是,A结构简单、操作方便 B繁殖速度快,C遗传物质含量少、简单 D性状稳定、变异少,2、基因工程常用的受体细胞有,大肠杆菌 枯草杆菌,支原体 动植物细胞,A B,C D,B,D,3.采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的做法正确的是,将毒素蛋白质注射到棉受精卵中 将编码毒素蛋白的DNA序列注射到棉受精卵中 将编码毒素蛋白的DNA序列与细菌质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵中 将编码毒素蛋白的DNA序列与质粒重组，导入细菌感染棉的体细胞，再进行组织培养,A B C D,C,4.下列属于基因工程中导入目的基因方法的是,农杆菌转化法 基因枪法 花粉管道法 显微注射法 胚胎移植 DNA分子杂交法,A B,C D,C,四、目的基因的检测与鉴定,检测,鉴定,是否插入了目的基因,是否转录出了mRNA,是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定,活性鉴定等,方法,方法,方法,DNA分子杂交,mRNA与DNA分子杂交,抗原-抗体杂交,个体生物学水平的鉴定,知识延伸,DNA分子杂交技术,标记,待检测,1.比较载体与基因表达载体的区别。,2.切割DNA获取目的基因和切割载体时一般情况下为什么,要选用同一种限制性核酸内切酶？经过重组过程后会形,成几种DNA分子？,3.分析为什么动物的受体细胞不能为体细胞？,4.讨论大肠杆菌细胞转化时为什么要用Ca2+处理细胞。,5.目的基因进入受体细胞内并在受体细胞内稳定保存的实,质是什么？,6.基因探针的实质是什么？,7.若使农杆菌也能感染单子叶植物，应如何操作？,8.基因工程操作的四个步骤中，有哪几个步骤涉及到碱基,互补配对？,小结:,基因工程的基本操作程序,获取目的基因,从基因文库,利用PCR化学方法人工合成,构建基因表达载体,目的基因、启动子、终止子、标记基因,将目的基因导入受体细胞,农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法、显微注射技术、感受态细胞,目的基因的检测与鉴定,检测：是否插入、转录、翻译,鉴定,1.细菌的质粒分子带有一个抗菌素抗性基因，该抗性基因在基因工程中的主要作用是,A提高受体细胞在自然环境中的耐药性,B有利于对目的基因是否导入进行检测,C增加质粒分子的分子量,D便于与外源基因连接,2.有关基因工程的叙述正确的是,A限制酶只在获得目的基因时才用,B重组质粒的形成是在细胞内完成的,C质粒都可作为运载体,D蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料,B,D,3.哪项不是基因表达载体的组成部分,A.启动子 B.终止密码子,C.标记基因 D.目的基因,4.下列哪项不是将目的基因导入植物细胞的方法,A基因枪法 B显微注射法,C.农杆菌转化法 D花粉管通道法,B,B,5、有关基因工程的叙述中，错误的是,A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来,B、限制性内切酶用于目的基因的获得,C、目的基因须由运载体导入受体细胞,D、人工合成目的基因不用限制性内切酶,A,6.将ada(腺苷酸脱氨酶基因)通过质粒pET28b导入大肠杆菌并成功表达腺苷酸脱氨酶。下列叙述错误的是,A.每个大肠杆菌细胞至少含一个重组质粒,B.每个重组质粒至少含一个限制性核酸内切酶识别位点,C.每个限制性核酸内切酶识别位点至少插入一个ada,D.每个插入的ada至少表达一个腺苷酸脱氨酶分子,C,7.农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下感染植物，因而在植物基因工程中得到了广泛的应用。下图为农杆菌转化法的示意图，试回答下列问题：,(1)一般情况下农杆菌不能感染的植物是_，利用农杆菌能在自然条件下感染植物的特点，能实现_。具体原理是在农杆菌的Ti质粒上存在T-DNA片段，它具有可转移到受体细胞并整合到受体细胞的_上的特点，因此只要将携带外源基因的DNA片段插入到_(部位)即可。,(2)根据T-DNA这一转移特点，猜测该DNA片段上可能含有控制_(酶)合成的基因。,(3)图中c过程中，能促进农杆菌移向植物细胞的物质是_ _类化合物。,(4)植物基因工程中将目的基因导入受体细胞的方法除了农杆菌转化法之外，还可采取_。(至少写出两种),单子叶植物,目的基因导入到植物细胞,染色体DNA,T-DNA片段(内部),DNA连接酶、限制酶,酚,基因枪法、花粉管通道法,1、将目的基因导入植物细胞的方法：,农杆菌转化法,三、将目的基因导入受体细胞,花粉管通道法,1、将目的基因导入植物细胞的方法：,三、将目的基因导入受体细胞,基因枪法,2、将目的基因导入动物细胞,显微注射法,目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵）显微注射受精卵 移植到输卵管或子宫 新性状动物,3、将目的基因导入微生物细胞,用Ca,2+,处理细胞,感受态细胞,表达载体与感受态细胞混合 感受态细胞吸收DNA分子,处理物质：,常用菌：,微生物作受体细胞原因：,Ca,2+,处理,大肠杆菌,繁殖快、,多为单细胞、,遗传物质相对少,过程：,思考与探究：,2.根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理,你能分析出不能导入单子叶植物的原因吗?若将一个抗病基因导入小麦中,理论上讲你应该怎样做?,要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的Vir区（诱导）的基因，使T-DNA转移并插入到染色体DNA上。,3.利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？,有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。,4.-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的-珠蛋白，想一想，应如何进行设计？,（,1,）从小鼠中克隆出,-珠蛋白基因的编码序列（cDNA)。,（2）将cDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。,（3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明-珠蛋白基因已进入其中。,（4）培养进入了-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取-珠蛋白。,补：原核细胞的基因结构,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,与RNA聚合酶结合位点,启动子,终止子,RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。,转录开始后，RNA聚合酶沿DNA分子移动，并以DNA分子的一条链为模板合成RNA。,转录完毕后，RNA链释放出来，紧接着RNA聚合酶也从DNA模板链上脱落下来。,结构基因,外显子,内含子,转录、加工修饰,mRNA,详细过程,一、获取目的基因（,指编码蛋白质结构基因,）,鸟枪法,供体DNA,DNA片段,目的基因,逆转录法,信使RNA,目的基因,化学合成法,肽链氨基酸序列,信使RNA序列,基因DNA序列,目的基因,合成,推测,逆转录合成,直接提取法（原核生物）,人工合成法（真核生物）,聚合酶链式反应（PCR）,变性、退火、延伸三步曲,变性,：,双链DNA解链成为单链DNA,退火,：,部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合,延伸,：,以目的基因为模板，合成互补的新DNA链,PCR(多聚酶链式反应),PCR技术的发明,PCR的发明是DNA操作技术的革命,美国Mullis教授 开汽车时的联想,逶迤崎岖的山路DNA双螺旋,行驶的汽车一小段DNA引物,1988年发明了PCR技术,1993年获得诺贝尔奖,检测是否插入目的基因，,利用,DNA分子杂交技术,，目的基因DNA一条链（作探针）与受体细胞中提取的DNA杂交，看是否有杂交带。,检测是否转录出了mRNA，,利用,DNA分子杂交技术，,目的基因DNA一条链（作探针）与受体细胞中提取的mRNA杂交，看是否有杂交带。,检测目的基因是否翻译成蛋白质。,抗体与蛋白质进行抗原抗体杂交，看是否有杂交带。,还可以进行个体水平的鉴定，根据其性状。,提示：DNA分子杂交技术首先提取受体细胞中的DNA，然后高温解成单链，再与同位素标记的DNA探针杂交；抗原抗体杂交所用到的抗体是用表达出的蛋白质注射动物进行免疫，产生相应的抗体，并提取出而来的。,不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：,（1）生物之间进行基因交流，只有使用,受体生物自身基因,的启动子才能比较有利于基因的表达；,（2）通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；,（3）目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记；,（4）为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等；,（5）有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。,1.2 基因工程的基本操作程序,目的基因的获取,基因表达载体的构建,将目的基因导入受体细胞,目的基因的检测与鉴定,cDNA文库,演讲完毕，谢谢观看！,