微生物的分子生物学检测方法.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,1,2,3,目录,PCR,核酸技术,核酸分子技术,结语,PCR,核酸技术,聚合酶链反应(PCR)技术自1985年发明以来,各种各样以PCR 为基础的DNA序列的扩增和检测方法得到了迅猛发展。各种衍生技术如反转录PCR(RTR)、多重PCR、巢式PCR、PCR单链构象多态性(PCRSSCP)、限制性片段长度多态性（RFLP）、随机扩增的多态性DNA 技术(RAPD)和重复序列PCR技术(Rep-PCR)、荧光定量PCR等。其中定量PCR 既可以用于临床感染性疾病的诊断,又可用于监测其疗效，PCR及其衍生的技术近年来在病原微生物分型研究上得到了广泛应用。,简介,随机扩增的多态性DNA 技术,重复序列PCR技术,免疫PCR,优点,添加标题,随机扩增的多态性DNA 技术,RAPD是目前最简单的DNA分型方法,分辨力高于RFLP,但低于RepPCR，RAPD技术的使用范围也非常广,分辨结果也有较好的实验室再现性,，,在疾病暴发流行时,PAPD仍是一种分析相关菌株和排除不相关菌株的良好技术。,缺点,由于其对引物和DNA浓度、DNA模板质量、凝胶电泳和DNA聚合酶类型的变化高度敏感,故RAPD的重复性不够理想。虽然RAPD的分型结果在不同实验室间变化较大,分辨力不如PFGE技术,。,随机扩增的多态性DNA技术（RAPD,）,是一种典型PCR衍生技术,在低复性温度下用短任意序列引物(1015m ers)扩增有密切同源性的基因组DNA序列,模板上任意引物杂交点的数目和位置因种的不同株而异,理论上特定株形成特定图谱。反应出不同菌株基因组的DNA特点,从而对他们进行分型,具有一定互补序列的核苷酸单链在液相或固相中按碱基互补配对原则缔合成异质双链的过程叫核酸分子杂交。具有一定同源性的原条核酸单链在一定的条件下（适宜的温室度及离子强度等）可按碱基互补原成双链。杂交的双方是待测核酸序列及探针（probe）,待测核酸序列可以是克隆的基因征段，也可以是未克隆化的基因组DNA和细胞总RNA。,核酸分子杂交技术,特点,应用,（1）灵敏度高、特异性强；,（2）用于 DNADNA和RNARNA的定性、定量检测。,（1）检测特异 DNADNA序列,（2）特异基因克隆的筛选；,（3）核酸序列的初略分析；,（4）PCR技术的分子基础。,02,04,01,03,05,Northern印迹杂交：基本原理与Southern印迹杂交相同，不同的是它检测mRNA而不是DNA，因此可分析和了解基因的表达状态。,Southern印迹杂交：根据基因探针与待测DNA限制酶酶解片段杂交的带谱，可以直接确定宿主基因的缺陷所在或病原体的存在状态,原位杂交：直接在组织切片或细胞涂片上进行杂交反应。该技术可检出细胞中单拷贝mRNA，估算病毒在宿主细胞中复制和转录的程度，对于病毒感染（特别是具有长潜伏期的病毒感染）和其它退行性疾病的诊断很有用。,斑点杂交将待测DNA或细胞裂解物变性后直接点在硝酸纤维素膜上（无需限制酶酶解），与探针进行杂交反应。,核酸打点杂交：它是将一定量的病毒核酸(DNA或RNA)打点在固相支持膜上,然后与放射性或非放射性标记的(DNA或RNA)探针进行杂交,杂交后通过放 射自显影或显色反应检测杂交信号。,原位杂交,核酸杂交,斑点杂交,Southern印迹杂交,Northern印迹杂交,原位杂交,斑点杂交,核酸杂交,原位杂交,长期以来,人们试图找到一种既简便又快速、又有足够分辨力的技术来鉴别和区分各种病原微生物，各种新方法和新技术不断涌现，但每一种方法都有其局限性，为了弥补各自的不足，使用一种以上的技术即采用多种方法联合使用的策略,一种技术的缺点会被其他技术的优点所代替。选择检测方法应考虑到自身所拥有的条件,检测所要求达到的灵敏度,而提高灵敏度和去除假阳性是检测方法发展的趋势。近年来,随着计算机技术的不断发展,临床病原菌检测将向着简便、快速、高通量、自动化的方向发展。分子生物学技术通过自动化仪器的使用,将在病原菌诊断、鉴定和耐药基因检测方面越来越广泛地应用于临床。,结 语,