微生物的保藏技术.ppt

Click to edit Master title style,*,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,主要内容,常用的保藏方法,1,保藏原理,2,注意事项,3,菌种保藏的原因,通过分离纯化得到的微生物纯培养物，还必须通过各种保藏技术使其在一定时间内不死亡，不会被其他微生物污染，不会因发生变异而丢失重要的生物学性状，否则就无法真正保证微生物研究和应用工作的顺利进行。,菌种保藏就是根据菌种特性及保藏目的的不同，给微生物菌株以特定的条件，使其存活而得以延续。,菌种保藏原理,根据微生物的菌种生理、生化特性，在人工创造的条件下尽量降低微生物细胞的代谢强度，使细胞基本处于休眠状态，生长繁殖受到抑制但又不至于死亡，以减低菌种的变异率。低温、干燥、缺氧、缺乏营养等环境条件都有抑制微生物的代谢作用。,低温、干燥、真空是用于菌种保藏的重要手段。,中国菌种保藏管理中心,中国菌保会是国际认可的菌种保藏机构，下设7个全国性菌种保藏管理中心：,（1）,普通,微生物菌种保藏管理中心；,（2）,农业,微生物菌种保藏管理中心；,（3）,工业,微生物菌种保藏管理中心；,（4）,医学,微生物菌种保藏管理中心；,（5）,抗生素,菌种保藏管理中心；,（6）,兽医,微生物菌种保藏管理中心；,（7）,林业,微生物菌种保藏管理中心。,（1984 年增加）,中国标准生物保藏中心,我国唯一的国家级工业微生物菌种资源保藏管理中心，中国微生物菌种保藏管理委员会和国际菌种保藏联合会成员之一，隶属于中国食品发酵工业研究院，专业从事工业微生物菌种资源保藏管理的公益基础性资源保藏机构，负责全国工业生产与研究应用微生物菌种资源的收集、整理、鉴定、保藏、供应与国际交流。,中国工业微生物菌种保藏管理中心（,CICC,）保藏各种工业微生物菌种资源包括：细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌和大型真菌，共,67,个属,251,种，近,3000,株，库藏备份,80000,余支。,中国标准生物保藏中心,中国农业微生物菌种保藏管理中心,Agricultural Culture Collection of Chin,（,ACCC,）,ACCC,是中国国家级农业微生物菌种保藏管理专门机构,负责全国农业微生物菌种的收集、鉴定、评价、保藏、供应及国际交流任务,.,库藏菌种,2490,株,其中细菌,1004,株,放线菌,69,株,丝状真菌,355,株,酵母菌,124,株,食用菌,582.,中国标准生物保藏中心,中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心成立（英文缩写：,CGMCC,，设立在中国科学院微生物研究所）,1985,年，开始用于专利程序的微生物保存,1995,年，获得布达佩斯条约国际保藏中心（,IDA,）的资格,1995,年，加入中国科学院典型培养物保藏委员会 宗旨和任务。,作为一个非赢利性、公益性、服务性技术支撑机构，,CGMCC,的宗旨是广泛收集国内外的微生物资源，妥善保存，以公开的保藏机构的名义为工农业生产、卫生健康、环境保护、科研教育提供标准化的实验材料,在保证生物安全和保护知识产权的前提下，为第三者能够自由地利用各种微生物材料提供服务，最大限度的实现微生物资源的保护、共享和持续利用。,德国与韩国标准生物保藏中心,德国微生物菌物保藏中心,(DSMZ),，保藏有,9400,种细菌、,2400,种真菌、,500,种酵母菌、,300,种质粒、,500,种动物细胞、,500,种植物细胞、,170,种动物杂肿瘤、,600,种植物病毒、,90,种细菌病毒等（德文，英文）。,韩国国家农业生物技术研究所,农业微生物菌种保藏（,KACC,），保藏有细菌,890,种、真菌,1581,种、酵母菌,62,种、,cDNA 600,种（英文）。,法国标准生物保藏中心,法国国家历史自然博物馆,Algotheque du,实验室菌种保藏中心,Algotheque du Laboratoire de Cryptogamie,Museum National dHistoire Naturelle,（,ALCP,）,ALCP,隶属于法国国家历史自然博物馆，主要从事于工业微生物学，应用微生物学，微生物系统分类学，培养和保藏方法等方面的研究，以及藻类等微生物的分离，鉴定，保藏工作。保藏有藻类,600,种、细菌,200,种。该中心保藏的菌种可出售。,各国标准生物保藏中心,法国巴斯德研究所,LInstitut Pasteur,菌物保藏中心,Collection de LInstitut Pasteur Of Institut Pasteur(CIP),加拿大国家微生物健康实验室微生物菌种保藏中心,National Microbiology Laboratory Health Canada Culture Collections,（,NML-HCCC,）,日本生物技术研究所微生物菌种保藏中心,Marine Biotechnology Institute Culture Collection,Marine Biotechnology Instituten(MBIC),传代培养保藏,一、传代培养保藏,原理,1,优缺点,2,注意事项,3,传代培养的原理,有些微生物当遇到冷冻或干燥等处理时，会很快死亡，因此在这种情况下，只能求助于传代培养保存法。传代培养就是要定期地进行菌种转接、培养后再保存，它是最基本的微生物保存法，例如酸奶等常用生产菌种的保存。,传代培养优缺点,传代培养保存法虽然简便，但其缺点也很明显，如：菌种管棉塞经常容易发霉；菌株的遗传性状容易发生变异；反复传代时，菌株的病原性、形成生理活性物质的能力以及形成孢子的能力等均有降低；需要定期转种，工作量大；杂菌的污染机会较多。,传代培养的注意事项,传代保存时，培养基的浓度不宜过高，营养成分不宜过于丰富，尤其是碳水化合物的浓度应在可能的范围内尽量降低。培养温度通常以稍低于最适生长温度为好。若为产酸菌种，则应在培养基中添加少量碳酸钙。,一般地，大多数菌种的保藏温度以,5,为好，像厌氧菌、霍乱弧菌及部分病原真菌等微生物菌种则可以使用,37,进行保存，而蕈类等大型食用菌的菌种则可以室温直接保存。,二、冷冻保藏原理,适用于抗冻力强的微生物。这些微生物可在其菌体细胞外遭受冻结的情况下而不受损伤，而对其它大多数微生物而言，无论在细胞外冻结还是在细胞内冻结，都会对菌体造成损伤，使其代谢作用停止，可达到保藏的目的。,常用的冷冻保藏法,液氮保藏法,1,低温冰箱保存法,2,干冰保存法,3,液氮保存法,一、适用范围,液氮温度在-196以下,用于快速制冷,速冻,机械安装等,一般不用于日常生活,此法除适宜于一般微生物的保藏外，对一些用冷冻干燥法都难以保存的微生物如支原体、衣原体、氢细菌、难以形成孢子的霉菌、噬菌体及动物细胞均可长期保藏，而且性状不变异。缺点是需要特殊设备。,二、保藏方法,a、装,安瓶,管：使用尽量浓厚的菌体悬浮于含有适当防冻剂（保存霉菌不用防冻剂）的灭菌溶液中，将0.21ml的这种溶液分装于安瓶中，或在装有分散剂的安瓶中直接接种，或将菌丝体琼脂块直接悬浮于分散剂中。,b、熔封安瓶管：若直接贮存于气相液氮中（150170）时，则不需熔封。,c,、检查安瓶管是否熔封良好：即在,4,下，将熔封安瓶管在适当的色素溶液中浸泡,2,30,分钟后，观察有无色素进入安瓶。,d,、缓慢冷却：将熔封安瓶管置于小罐中，然后用液氮气以约,1/min,的速度冷却至,25,左右，也可在,20,25,的冰箱内缓慢冷却,30,60min,。,e,、速冷：最后浸入液氮中快速冷却至,196,。,这种方法适用范围广，而且是目前常用的较理想的，繁而高效。保藏期23年，甚至长达9年。,低温冰箱保存法,一、适用范围,20、50或85,二、保藏方法,低温冷冻保存时使用螺旋口试管较为方便，也可在棉塞试管外包裹塑料薄膜。保存时菌液加量不宜过多，有些可添加保护剂。此外，也可用,5mm,的玻璃珠来吸附菌液，然后把玻璃珠置于塑料容器内，再放入低温冰箱内进行保存的。,干冰保存法,一、适用范围,70左右,二、保藏方法,将菌种管插入干冰内，再置于冰箱内进行冷冻保存。,菌种保藏的共同注意点：,1,、严格的无菌操作；,2,、用于保存的微生物在生长前必须处于它生长良好的状态；,3,、保藏过程中要防止退化的发生（不同的保藏方法，分别有不同的保存时间。）,注意事项,要选择适于冷冻干燥的菌龄细胞；,要选择适宜的培养基，因为某些微生物对冷冻的抵抗力，常随培养基成分的变化而显示出巨大差异；,要选择合适的菌液浓度，通常菌液浓度越高，生存率越高，保存期也越长；,最好在菌液内不添加电解质（如食盐等）；,可在菌液内添加甘油（甘油管冷冻保藏法）等保护剂，以防止在冷冻过程中出现菌体大量死亡的现象。同样，也可添加各种糖类、去纤维血液和脱脂牛乳等具有良好保护效果的溶剂，但对有些微生物而言，不加保护剂时更有效。,原则上应尽快进行冷冻处理，但当加入保护剂时，可静置一段时间后再进行处理。,就动物细胞而言，应在,20,范围内以,1/min,左右的速度缓慢降温，此后必须尽快降到贮藏温度；而对绝大多,数微生物而言，则不必如此，如结构较为复杂的原虫则可在,35,范围内进行缓慢降温，而噬菌体则必需采用上述的二阶段法进行冷冻,；,若进行长期保存，则贮藏温度越低越好；,取用冷冻保存的菌种时，应采取速融措施，即在,35,40,温水中轻轻振荡使之迅速融解。而就厌氧菌来说，则应选择静置融化的措施。当冷冻菌融化后，应尽量避免再次冷冻，否则菌体的存活率将显著下降。,总之，首先保持原菌优良性状长期稳定，同时考虑方法的通用性、操作的简便性和设备的普及性。,三、干燥保藏法,1,、沙土管保存,2,、,冷冻真空保藏,沙土管保存,1,、主要用于能形成孢子或孢囊的微生物菌种的保藏，如：芽孢杆菌、放线菌等。,2,、方法：将菌种接种斜面，培养至长出大量的孢子后，洗下孢子制备孢子悬液，加入无菌的沙土管中，减压干燥，直至将水分抽干，最后用石蜡、胶塞等封闭管口，置冰箱保存。,沙土管保藏：用棉塞塞住安瓿管，放在能够抽真空的干燥器中，然抽干后将真空干燥器的旋塞关闭即可。不用火焰封口，用时将真空干燥器放气打开取出，剩余的继续抽真空，抽至真空后关闭旋塞保藏即可。,此法简单易行，并可以将微生物保藏较长时间，适合一般实验室及以放线菌等为菌种的发酵工厂采用。,冰冻真空保藏,原理是首先将加有保护剂的细胞样品先预冷，使其冻结，然后在减压下利用升华现象除去水分。事实上，从菌体中除去大部分水分后，细胞的生理活动就会停止，因此可以达到长期维持生命状态的目的。该方法适用于绝大多数微生物菌种（包括噬菌体和立克次氏体等）的保存。,达到干燥的样品可在真空或惰性气体的密闭环境中置低温保存，从而使微生物处于干燥、缺氧及低温的状态，生命活动处于休眠，可以达到长期保藏的目的。,用冰升华的方式除去水分，手段比较温和，细胞受损伤的程度相对较小，存活率及保藏效果均不错，而且经抽真空封闭的菌种安瓿瓶的保存、邮寄、使用均很方便。因此冷冻真空干燥保藏是目前使用最普遍、最重要的微生物保藏方法。,注意事项,a,、冷冻干燥前的培养条件：首先检验菌种纯度。一般地说，将待保存的微生物在营养丰富且容易增菌的培养基上进行培养为宜；菌龄以达到对数生长期为好；若为有芽孢或孢子的微生物，则以芽孢和孢子形成以后进行保存为好；菌液浓度以高为好，如细菌应达到,109,1010/ml,。,b,、菌株号码等的标记：可在安瓶外侧标记或在安瓶内封入标签。,c,、安瓶的准备：将安瓶在,2%HCl,中浸泡过夜，自来水冲洗,3,次后，蒸馏水刷净，干燥，塞棉塞，贴标签，干热灭菌或温热灭菌后，,60,恒温干燥。,d,、添加保护剂：常用的保护剂有脱脂乳、,12%,蔗糖、加,7.5%,葡萄糖的普通肉汤以及加,7.5%,葡萄糖的血清等等。,总结,除上述方法外，各种微生物菌种保藏的方法还有很多，如纸片保藏、薄膜保藏、寄主保藏等。,由于微生物的多样性，不同的微生物往往对不同的保藏方法有不同的适应性，迄今为止尚没有一种方法被证明对所有的微生物适宜。,因此，在具体选择保藏方法时必须对被保藏菌株的特性、保藏物的使用特点及现有条件等进行综合考虑。对一些比较重要的微生物菌株，则要尽可能多的采用各种不同的手段进行保藏，以免因某种方法的失败而导致菌种的丧失。,