抗原表位.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,报告内容,概念,1,研究意义,2,研究方法,3,抗原表位-定义,抗原表位，又称抗原决定簇(,antigenic determinant,，AD,)，是指抗原分子中,决定抗原特异性,的特殊化学基团，因而表位代表了抗原分子上的一个免疫活性区，负责与抗体分子或免疫细胞表面的抗原受体结合。严格说来，抗体的特异性是针对表位而不是针对完整的抗原分子的。,抗原通过抗原表位与相应的淋巴细胞表面的,抗原受体,结合，从而激活淋巴细胞，引起免疫应答；抗原也借表位与相应,抗体或致敏淋巴细胞,发生特异性结合而发挥免疫效应。,抗原表位的,性质、数目和空间构型,决定抗原的特异性。,抗原分子以其,B,细胞表位与抗体分子的抗原结合部位发生互补性结合,A.,抗原,-,抗体复合物的立体构象；,B.,采用电脑技术将抗原和抗体分子分开，可见抗原和抗体分子的相互作用仅发生在抗原分子的,B,细胞表位和抗体分子的抗原结合部位之间，两者呈现结构互补。,C.,抗体的互补决定区与抗原表位结合示意图,C,按表位结构不同，分为连续性抗原表位和不连续性抗原表位。,连续性表位又称线性表位，是由肽链上顺序连续的氨基酸组成通常这种结合比较弱，因为小肽并不含完整天然蛋白的构象，在多数情况下这种表位可能只代表了复杂表位的一部分。对其研究依赖于,多肽固相化学合成技术后者又称构象型抗原表位，是由那些空间邻近但顺序上不连续的氨基酸组成。,分类,按照与抗原受体细胞结合不同，分为B细胞抗原表位和T细胞抗原表位。,分类,研究意义,表位是蛋白质抗原性的基础，研究,蛋白质抗原,表位，对于设计具有,免疫原性,和中和活性的多肽、,新型疫苗,分子及新型诊断试剂具有较大意义。,应用：多在诊断与疫苗的研究中,尤其是在制作良好的特异性诊断试剂盒中更为重要。,抗原表位研究方法,通过化学或生物学方法处理抗原分子以获得多肽碎片，再利用单克隆抗体筛选能与之起阳性反应的片段。,1.1 用化学法或酶“切割”抗原，分离抗原肽段,该法对蛋白质的一级结构不作要求，但测定结果只能是抗原的,线性表位。,化学切割法中常用的试剂：,CNBr,，,NTCB,，,IBA,，,甲醇,。,酶法切割常用的酶有,胰蛋白酶、胃蛋白酶和,V8,蛋白酶,等。,水解后采用各种分离方法如,SDS-PAG,E、凝胶过滤、离子交换将水解片段分开，然后用,Western blot，ELISA,等各种检测手段来检测。结果可通过理论肽段分子量的推断或相应的氨基酸序列分析来判断。,利用该法分析抗原表位的有肌醇激酶、肌细胞增强蛋白、乙酰胆碱酯酶、玻璃体结合蛋白、磷脂酶基质蛋白等。,1,.传统化学“切割”法或酶法,（classical epitope mapping）,研究方法,1.2 水解抗原-抗体复合物,这是一个直接的确定线性及构象性抗原表位的方法，又称为,Protein footprinting,。其理论依据为抗原-抗体复合物的结合部位能抵抗蛋白酶的水解。,根据蛋白质抗原性质的不同常采用3种方法。,对于蛋白酶水解位点较少的抗原，一般先将抗原与等摩尔抗体在PBS中反应，然后酶解，SDS-PAGE分离水解产物，分析结果。,对于蛋白酶水解位点较多的抗原，采用HPLC法，将抗原-抗体复合物的酶解片段和同样条件下的抗原酶解片段分别用HPLC分析。两者图谱对应峰峰高比大于平均数值的片段则推测为抗原表位。,对于能确定为线性表位的抗原可先将抗体连接于固相载体上，并将此固相载体装柱，然后让过量的抗原溶液通过此柱，使抗原-抗体形成复合物。一定条件下，酶溶液过柱，酶解此抗原-抗体复合物，PBS洗去酶解下的不结合片段，再用1.0mol/L的乙酸洗下与抗体结合的肽段。HPLC分析这些片段以确定结果。,近来，质谱技术在这类结果分析中得到了广泛的应用。采用该法已成功地确定了细胞色素C，胃泌素释放肽(GRP)，脂碱性磷酸酶(PLAP)等的抗原表位。,2.合成肽库方法,有机合成法就是直接利用固相肽合成技术，合成含有各种可能序列的短肽。通过这种合成可以保证各种序列的多肽等机率出现，每个载体上只含有一种序列的短肽。,优点,是构建方法简单，迅速。,缺点,是不能扩增，筛选比较麻烦，需进行荧光标记或ELISA，在显微镜下操作工作量比较大。在研究构象性表位时的minotopes方法即采用类似的方法，通常从二肽开始合成并逐渐增加肽链长度及置换氨基酸种类，直至达到与抗体的最大结合为止。,研究方法,2.1 有机合成法,肽库是大量某一长度(如六肽)的短肽的集合，它包括了该长度的短肽的各种可能序列或其中的绝大部分,。,该法先利用基因克隆技术将合成的一组寡核苷酸混合物（小肽基因混合物）克隆至线性噬菌体基因组中，使之以融合蛋白的形式在噬菌体的外壳蛋白的氨基端表达。再利用生物素或酶标记的抗体筛出特异的噬菌体，并进行扩增，再筛选，从结合特异抗体的噬菌体DNA序列推断出氨基酸序列，并合成相应的短肽，验证筛选结果。,用此法检测的抗原表位有人H铁蛋白蓝舌病病毒的外壳蛋白VP5等,。,研究方法,2.2,基因工程法（噬菌体随机肽筛选法）,此技术于1992年由R.Frank发展出来，它主要是将涵盖所有抗原氨基酸序列的缩氨酸合成于固定的表面，并与抗血清标定，此法可鉴定线性抗原表位。,应用肽合成技术合成连续的重叠的57肽，将这些合成的肽与相应的抗体反应，分析检测结果，以确定阳性反应片段。,这一技术要求有明确的抗原的一级结构，并且检测结果为抗原,线性表位,。,该法应用广泛，已研究抗原表位的蛋白有HIVgp41、寄生虫蛋白、烟草花叶病毒(TMV)、Fy6蛋白、鸭肝炎B病毒,(DHBV),等。,3,缩氨酸扫描技术,(,Peptide Scan technology,),研究方法,4 表位作图,早期表位作图或定位(epitopemapping)是基于蛋白质修饰和降解的原理，可经侧链化学修饰法选择性地标记氨基酸，失去结合的部分将被测出。蛋白质抗原被降解为小片段，经测序后确定抗体结合的位点。,要确定某一抗原的全部表位需要大量的时间。,现已可以通过,诱变、蛋白质合成或蛋白竞争结合,方法鉴定其表位。此外，表位序列测定的应用对抗体结合表位的分析具有显著的优越性。,研究方法,研究方法-表位作图,推荐使用表位作图方法和基本条件,研究方法,从80年代Hopp和Woods提出亲水性参数对抗原表位预测的方法以来，已有许多参数、算法发表，对B细胞蛋白抗原表位研究起到巨大的推动作用。现已被大众认可并具有较好预测效果的方法，主要有以下6种：,5 抗原表位的预测法,(1)亲水性方案(Hydrophilicity),Nozaki-Tanford scale，Eisenberg scale，Kyte-Doolittle scale，HPLC scale，,Hopp-Woods scale,Hopp-Woods 方案认为：蛋白质抗原的氨基酸残基可分为疏水性和亲水性两类。在机体内，疏水性残基一般埋在蛋白内部，而亲水性残基位于表面，因此蛋白的亲水部位与蛋白抗原表位有密切的联系。,Hopp-Woods方案是以残基由有机相环境转移到水相环境的自由能为依据计算各个氨基酸的亲水性。现已明确，亲水性部位与抗原表位并无很好的一致性，即高亲水性部位不一定是表位，表位也不一定是亲水性部位。,抗原表位的预测法,(2)可及性方案(Accessibility),如Janin可及性参数，指蛋白质抗原中氨基酸残基被溶剂分子接触的可能性。它反映了蛋白质抗原内、外各层残基的分布情况。,B细胞抗原表位的预测法,(3)抗原性方案(,Antigenicity,),对20个已研究得很透的蛋白质的69个连续位点的606个氨基酸统计分析，Welling建立了抗原性刻度。每个氨基酸用出现在抗原区的频率描述，此频率除以各氨基酸在所有蛋白质中的频率就可推出此刻度值。,该法研究表明，疏水性氨基酸残基对抗原表位形成亦有贡献。,缺点是其所用的数据库有限，并且连续位点内的残基被认为是同等重要的。显然那些不重要的残基归入计算会明显降低相关性。,抗原表位的预测法,(4)可塑性方案(Flexibility),指蛋白抗原构象不是刚性不变的，其多肽链骨架有一定程度的活动性，活动性强的氨基酸残基即,可塑性大的位点,，易形成抗原表位。Karplas 和Schulz基于已知结构的31个蛋白质，发展了一种预测蛋白质片段活动性的方法。,(5)电荷分布方案(Charge distribution),认为对碱性抗原特异的抗体多趋于酸性，对酸性抗原特异的抗体多趋于碱性。,抗原表位的预测法,(6)二级结构预测方案(Secondary structure),认为转角结构为凸出结构，多出现在蛋白质抗原表面，利于与抗体嵌合，较可能成为抗原表位。而螺旋、片层结构规则不易形变，较难嵌和抗体，一般不作为抗原表位。,可预测蛋白质转角的有Chou-Fasman，Garnier，Cohen等方法。其中各种方法预测的成功率均不超过65%。一般认为,Cohen,方法对转角的预测正确率很高，对于已知折叠类型的蛋白质(类，类，/类)正确率高达95%，对于未知结构类型的蛋白质，可用3种类型分别预测，3类预测一致的转角对预测表位有帮助。,抗原表位的预测法,对上述各种参数的预测比较表明，各种方案预测的正确率均不高。一般将上述多种方案综合考虑，尤以可及性方案、可塑性方案、抗原性方案及二级结构预测为重要。,已经有一些文献提出了各自不同的综合分析方法。1988年Jameson和Worf提出一种综合预测方案。权重选择为：40%来自二级结构成分，可及性、柔韧性各15%，30%来自亲水性。在吴加金等编的Goldkey软件中，以六种参数Hopp-Woods，HPLC，Accessibility，Flexibility，Charge，Antigenivity综合考虑，得出综合判断图，阈值以上的峰即认为是预测的抗原表位。,从软件预测出的抗原表位须用实验来进一步验证。,抗原表位的预测法,以往合成的序列肽仅模拟蛋白质的线性表位，这无疑会遗漏众多的构象性表位信息。近些年来,随着生物信息学和分子生物学技术的飞速发展，采用计算机预测和试验相结合的方法进行构象性表位分析和定位得到了迅速发展，一些可用的基于Web的预测软件已经公布，如 CEP软件、DiscTope 软件和 MEPS软件。,应用,噬菌体展示肽库技术结合计算机建模进行构象性表位预测,是另一类预测 B 细胞构象性表位的方法。即利用抗体筛选噬菌体肽库，获取抗体亲和性模拟肽，对模拟肽集合进行比对处理，获得探针基序，然后利用探针基序在抗原蛋白表面搜索最佳匹配的氨基酸序列，获得的序列即作为预测结果。,1990 年 Scott首次将噬菌体随机肽库技术应用于抗原定位。,目前提供的基于 Web 的预测服务算法有 Pepitope 算法、3DEX 算法和 MIMOX 算法。,B 细胞,构象表位,的预测,T细胞表位预测主要基于候选肽能否和MHC 分子结合。,T细胞表位预测分CTL表位预测和Th 表位预测两类,其中 CTL 表位预测主要涉及 MHC类分子肽预测,Th 表位预测涉及 MHC类分子的亲和肽预测。,与 MHC类分子结合的多肽长度通常为 811 个氨基酸,一般为 9个,在序列特定位置上有锚点存在。而 MHC 分子亲和肽长度可达 30 个氨基酸以上,其结合基序存在不同程度的退化。,目前公布的预测软件有 NetCTL、WAPP、EpiJen、,WHATIF,DSSP,NACESS,、PHD、JPRED、PredAcc(c)、ACCpro等软件,这种综合预测方法明显优于单个预测方法,大大提高了预测的准确度。,T 细胞表位的预测,利用在线软件BepiPred 1.0 Server（,www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/,）,用蛋白序列直接预测抗原表位，这个网站预测出的抗原表位比较多。,还有其他在线预测网站,www.imtech.res.in/raghava/abcpred/index.html,输入蛋白质序列，从6种计算方式中选择一种，预测B细胞抗原表位，比较直观。,beta.immuneepitope.org/home.php,immunax.dfci.harvard.edu/Tools/antigenic.html,谢谢大家！,A,B,