生物化学甲复习重点-01.03..pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,酶,概念：酶、核酶、同工酶、抗体酶、酶活性中心、米氏常数（Km）、反馈调整、别构酶/别构效应、酶原,酶催化作用特点,酶组成及酶辅因子,酶分类,酶活力与比活力,酶活性部位特点,酶作用机制,及其假说,米氏方程式推导,酶浓度、pH、温度对酶反应速度影响,抑制剂对酶反应影响,1/59,3.酶辅因子,酶辅因子是酶对热稳定非蛋白小分子物质部分，其主要作用是作为电子、原子或一些基团载体参加反应并促进整个催化过程。,(1)传递电子体：如 卟啉铁、铁硫簇；,(2)传递氢（递氢体）：如 FMN/FAD、NAD/NADPC,0,Q、硫辛酸；,(3)传递酰基体：如 C,0,A、TPP、硫辛酸；,(4)传递一碳基团：如 四氢叶酸；,(5)传递磷酸基：如 ATP，GTP；,(6)其它作用：转氨基，如 V,B6,（磷酸砒哆醛）,；传递CO,2,，如 生物素,。,2/59,酶活性部位特点,结合中心,催化中心,与S结合决定酶促,反应,专一性,促进S发生化学改变,决定酶促反应,性质,活性中心,3/59,米氏方程,。,4/59,例1、某酶Km为2.410-4mol/L，在底物浓度为0.05mol/L时，该酶反应速度为128m/min，求在底物浓度为6.310-3mol/L、110-4mol/L时，该酶反应速度分别是多少？从计算结果可得出什么规律？,解析：先求Vmax:因为v=VmaxS/(Km+S)，则Vmax=v(Km+S)/S=(12810-3（mmol/min）0.05)/0.05=0.128mmol/min,当S=6.310-3mol/L时，v=VmaxS/(Km+S)=（0.1286.310-3）/6.310-3=0.128mmol/min,当S=110-4mol/L时，v=VmaxS/(Km+S)=（0.128110-4）/（2.410-4+110-4）=0.038mmol/min,规律：当SKm时，v=Vmax。,5/59,米氏方程意义,米氏常数为反应速度是最大反应速度二分之一时底物浓度，K,m,单位为摩尔浓度（mol/L）,K,m,对于特定反应条件而言是一个特征常数。它只与酶性质相关而与酶浓度无关，不一样酶，含有不一样K,m,值。,K,m,值作为常数只是对固定底物、一定温度、一定pH等条件而言。,K,m,值能够反应酶同底物亲和力。,6/59,反应速度与酶浓度成正比,SEVE,酶反应最适,pH,（,optimum pH,）,在一定pH下,酶含有最大催化活性,通常称此,pH为最适pH,。,7/59,(1)可逆抑制作用：,抑制剂与酶蛋白以非共价方式结合，引发酶活性暂时性丧失。抑制剂能够经过透析等方法被除去，而且能部分或全部恢复酶活性。,根椐抑制剂与酶结合情况，又能够分为以下几类：,竞争性抑制-,丙二酸对琥珀酸脱氢酶抑制作用,非竞争性抑制-,亮氨酸是精氨酸酶非竞争性抑制,反竞争性抑制-,肼类化合物对胃蛋白酶抑制作用,混合性抑制（,mixed inhibition,),(2)不可逆抑制作用,：,烷化剂,可使酶中巯基烷化，从而使酶失活,8/59,激素和信号转导,概念:激素、内分泌、反馈调整、受体/配体、激动剂/拮抗剂、第二信使、核受体、G蛋白,GPCR之G蛋白与小G蛋白异同,蛋白磷酸化在信号转导中作用,活化PKC和PKA信号通路,酪氨酸蛋白激酶路径,9/59,脂质与细胞膜,什么是必需脂肪酸,血浆脂蛋白,胆固醇生理作用,生物膜流动镶嵌模型,生物膜简单扩散、促进扩散、主动转运,生物膜渗透osmosis,）,10/59,核酸,碱基种类 G、A、T、C、U,DNA碱基组成及规律-Chargaff规则,基因与基因组 C值悖论,DNA二级结构 DNA双螺旋结构,人类基因组计划内容及其意义,真核生物染色体,原核生物和真核生物特点,RNA与其它小分子RNA,DNA和RNA理化性质,核酸理化性质 紫外吸收特征、变性和复性、分子杂交、Tm、增色效应,11/59,Discovery of DNA Structure,Erwin Chargaff,showed the amounts of the four bases on DNA(A,T,C,G),In a body or somatic cell:,A=30.3%T=30.3%,G=19.5%C=19.9%,Chargaffs Rule,Adenine,must pair with,Thymine,Guanine,must pair with,Cytosine,12/59,碱基同分异构形式,内酰胺型（酮式）,内酰亚胺型（烯醇式）,双内酰亚胺型,游离碱基因pH不一样而有以下集中同分异构体：,我们通常指是pH=7 内酰胺型嘌呤和嘧啶,13/59,DNA,双螺旋结构特点,DNA分子由两条多聚脱氧核糖核苷酸链(简称DNA单链)组成。两条链沿着同一根轴平行盘绕，形成右手双螺旋结构。螺旋中两条链方向相反，即其中一条链方向为53，而另一条链方向为35。,螺旋横截面直径约为2 nm，每条链相邻两个碱基平面之间距离为0.34 nm，每10个核苷酸形成一个螺旋，其螺矩（即螺旋旋转一圈）高度为3.4 nm。,链之间螺旋形凹槽，一条较浅，宽度为0.6nm，深度为0.75nm；另一条较深，宽度为1.2nm，深度为0.85nm。,14/59,DNA,二级结构其它形式,B-DNA 是生物体内最常见右手双螺旋结构。,A-DNA 依然是右手双螺旋结构，但每个碱基对上升0.28nM，每个螺旋11个碱基对，同一个DNA分子A型要比B型短，而螺旋直径大。在正常生理状态下还未发觉A-DNA。,Z-DNA 左手双螺旋结构。是Alexander Rich在1979年研究CGCGCGDNA寡聚体发觉了左手螺旋，呈“锯齿状”Z-DNA，每个螺旋有12个碱基对，每个碱基对上升0.37；只有一条大沟，而无小沟。有证据表明在生理状态下有Z-DNA片段存在，并可能调整一些基因表示或在遗传重组中起作用,15/59,HGP主要任务及内容,代表性论文：美国 Science,Vol.291,No.5507 英国 Nature,Vol.409,p.860,16/59,酸水解,糖苷键和磷酸酯键都能被酸水解,碱水解,RNA,磷酸酯键易被碱水解；强碱可将RNA水解成3-单核苷酸和2-单核苷酸。,但,DNA,磷酸酯键不易被碱水解，因为DNA2位置上没有游离-OH（DNA五碳糖是去氧核糖），以致无法形成2和3-环形磷酸盐之中间产物，所以不能和碱发生反应。,酶水解 核酸外切酶、内切酶、限制性内切酶,粘性未端（,cohesive end/sticky end,）,平整末端（,blunt end,）,核酸水解,17/59,核苷酸、RNA、DNA紫外吸收区分,吸光度,波长,260nm,游离核苷酸,RNA或单链DNA,DNA,18/59,紫外分光光度法,首先依据A,260,/A,280,比值判断核酸样品纯度,纯DNA：A,260,/A,280,=1.8,纯RNA：A,260,/A,280,=2.0,（若样品中含有杂蛋白或苯酚，则A,260,/A,280,比值显著降低）,纯核酸样品可依据260nm光吸收值算出其含量,若260nm光吸收值为1相当于50g/ml双螺旋DNA,或相当于40g/ml单链DNA或RNA,或相当于20g/ml寡核苷酸。,19/59,热变性和Tm,DNA变性过程是突变性，它在很窄温度区间内完成。所以，通常将紫外吸收增加量达最大量二分之一时温度称熔解温度，用,T,m,表示。,普通DNA,T,m,值在70-85,C之间。DNA,T,m,值与分子中G和C含量相关。,G和C含量高，,T,m,值高。因而测定Tm,值，可反应DNA分子中G,C含量，可经过经验公式计算：（G+C)%=(Tm-69.3)X2.44,20/59,核酸复性,变性核酸互补链在适当条件下重新缔合成为双螺旋结构过程称为复性。,DNA复性后，一系列性质将得到恢复，不过生物活性普通只能得到部分恢复，含有减色效应。,将热变性DNA骤然冷却至低温时，DNA不可能复性。变性DNA迟缓冷却时可复性，所以又称为“退火”。,退火温度,T,m,25,复性影响原因,片段浓度/片段大小/片段复杂性（重复序列数目）/溶液离子强度,21/59,分子杂交,当两条不一样起源DNA（或RNA）链或DNA链与RNA链之间存在互补碱基序列时，在一定条件下能够经过相互配对形成双螺旋分子，这种分子称为杂交分子。形成杂交分子过程称为分子杂交（molecular hybridization）。,核酸探针（nucleic acid probe）:某一含有特定序列而且用同位素或其它化学方法标识DNA或RNA片段。通常是人工合成。,核酸杂交在分子生物学和遗传学研究中含有主要意义。,分子杂交图,22/59,氨基酸、核苷酸及脂肪酸生物合成,必需氨基酸中Arg、Met和Phe主要性,芳香氨基酸Phe、Trp、Tyr合成-莽草酸路径,合成氨基酸主要路径,嘌呤核苷酸生物合成,乙酰CoA穿膜转运,脂肪酸合成酶及脂肪酸从头合成,胆固醇在体内代谢路径,脂类代谢调整,23/59,嘌呤核苷酸生物合成,-从头合成路径（,De novo synthesis,）,首先合成,IMP,定义：5-磷酸核糖+aa+CO,2,嘌呤核苷酸,场所：主要在肝脏,百分比：通常占95%,AMP,GMP,IMP,全部嘌呤核苷酸均由IMP（次黄嘌呤核苷酸）合成,24/59,全部嘌呤核苷酸均由IMP（次黄嘌呤核苷酸）合成；,PRPP：5-磷酸核糖焦磷酸；,5-磷酸核糖+PPi PRPP,磷酸核糖焦磷酸合成酶,25/59,尿苷酸（,UMP,）合成：,-从头合成路径（De novo synthesis）,第一阶段：合成氨甲酰磷酸,第二阶段:嘧啶核形成，包含反应2，3，4,第三阶段：形成尿苷酸,包含反应5，6,氨甲酰磷酸合成酶：线粒体 尿素合成,氨基酸代谢,氨甲酰磷酸合成酶：细胞质 嘧啶合成,核苷酸代谢,26/59,乙酰CoA穿膜转运,乙酰CoA进入细胞质-柠檬酸穿梭系统,碳源乙酰CoA（多存在于线粒体）,脂肪酸合成部位细胞质中,脂酰CoA进入线粒-肉毒碱(,carnitine,)作为载体,27/59,脂肪酸合成酶复合体,（Fatty acid synthase complex）,一个拥有,ACP,和6个酶组成酶复合体,酰基载体蛋白（,Acyl carrier protein/ACP,）,-酮基酰基-ACP合成酶（,-Ketoacyl-ACP synthase,）,二酰-辅酶A-ACP转移酶（,Malonyl-CoA-ACP transferase,）,-酮基酰基-ACP还原酶（,-Ketoacyl-ACP reductase,）,-羟脂酰ACP脱水酶（,-Hydroxacyl-ACP dehydratase,）,烯脂酰ACP还原酶（,Enoyl-ACP reductase,）,乙酰CoAACP转酰基酶,（,Acetyl-CoA-ACP transacetylase,）,在细菌及植物细胞中，这种复合体是由7个分离多肽（分别为7个活化位置）组成,在酵母菌中则是分成2个多肽,脊椎动物而言，7个活化位置是分布于单一一个多肽之上,28/59,脂酸合成总结：,脂酸合成和脂酸降解比较,区分点,合成,分解(-OX）,亚细胞部位,胞液,线粒体,酰基载体,ACP,CoA,二碳片段,丙二酰CoA,乙酰CoA,还原当量,NADPH,FAD、NAD,+,HCO,3,-,和柠檬酸,需要,不需要,能量改变,消耗7ATP14NADPH,产生106ATP,FAD,（黄素腺嘌呤二核苷酸）,还原型辅酶(,NADPH,)，学名烟酰胺腺嘌呤二核苷酸,29/59,DNA复制,概念：复制/复制叉、复制原点、冈崎片段、前导链/滞后链、DNA聚合酶、反转录、端粒/端粒酶、引物酶/解螺旋酶/拓扑异构酶,中心法则含义,DNA半保留、不连续复制,DNA复制相关酶和因子,原核和真核DNA聚合酶比较,反转录（,reverse transcription）,真核生物DNA复制与原核生物DNA复制大致相同，但有差异,DNA损伤和修复,30/59,中心法则（,The Central Dogma,）,General Transfers：,DNA DNA,DNA RNA,RNA Protein,Special Transfers：,RNA RNA,RNA DNA,DNA Protein,Unknown Transfers（never occur）：,Protein Protein,Protein DNA,Protein RNA,31/59,前导链,冈崎片段,滞后链,DNA半保留不连续复制,semi-discontinuous replication,32/59,DNA聚合酶（DNA polymerase）,DNA聚合酶催化反应,在大肠杆菌中最少发觉了五种DNA polymerase，分别是DNA polymerase I、II、III、IV和V，其中Polymerase I发觉最早（1956年），而polymerase IV和V直到1999年才发觉。,DNA聚合酶作用机理-,多聚核苷酸是经过一个核苷酸C,3,-OH 与另一分子核苷酸5-磷酸基形成3,5-磷酸二酯键相连而成链状聚合物。,ndATP,ndGTP,ndCTP,ndTTP,模板（DNA），引物（RNA，DNA），Me2+,DNA聚合酶,DNA 4nPPi,33/59,用胰蛋白酶或其它蛋白水解酶处理DNA pol I能够得到两个片段,。,A.大片段：第324928氨基酸残基组成，,M,r68000，,含有聚合酶活性和35核酸外切酶,活性，这大片段称Klenow fragment。,B.小片段：第1323个氨基酸残基组成，,M,r 35000，,含有53核酸外切酶活性。,34/59,大肠杆菌三种DNA聚合酶比较,pol I,pol II,pol III,分子量,103Kd,88Kd,900Kd,不一样种类亚基数目,1,7,10,每个细胞分子数,400,100,10,生物学活性,1,0.05,15,53聚合酶活性,35外切酶活性,53外切酶活性,功效,校正，修复，去除RNA引物,修复,复制（53聚合作用）,35/59,哺乳动物DNA聚合物,定位,细胞核,细胞核,线粒体,细胞核,细胞核,聚合方向：53外切酶活性35,功效,引物,合成,修复,线粒体DNA合成,核DNA,合成,修复,36/59,真核生物中复制起始区,酿酒酵母基因组DNA片断插入到无复制功效质粒中，发觉了能够使重组DNA分子在酵母中自主复制酵母基因组次序，称为自主复制次序（autonomously replicating sequences）或叫ARS元件。,在一个180 bpARS（ARS1）中判定出了一个复制起始必需元件，即15 bp元件A,和另外三个能够提升起始效率短片断，分别称为B1、B2和B3。,比较一下酵母中各种ARS元件可发觉有11bp保守次序:,A/TTTTATA/GTTTA/T,A和B1是由6个蛋白质亚基组成起始识别复合物（origin recognition complex，ORC）结合部位。一旦被CDKs(Cyclin-dependent kinases)激活，ORC允许DNA双链打开，为DNA聚合酶提供模板。,37/59,反转录（逆转录，reverse transcription）,DNA,转录,反,转录,RNA,反转录酶催化反应:,n,1,dATP,n,2,dGTP,n,3,dCTP,n,4,dTTP,RNA，引物，Mg,2+,还原剂，反转录酶,cDNA+(n,1,+n,2,+n,3,+n,4,)PPi,38/59,RNA生物合成（转录）,概念：转录、有意义链、RNA聚合酶/全酶/关键酶、开启子/TATA盒/增强子、,因子/,因子、内含子/RNA剪接（splicing）、snRNA/hnRNA,转录生成RNA主要是rRNA，tRNA，mRNA,RNA转录合成特点,真核生物与原核生物开启子,RNA转录起始、延长和终止,真核生物与原核生物转录主要区分,39/59,RNA转录合成特点,转录不对称性,转录连续性,转录单向性,有特定起始和终止位点,40/59,RNA转录合成条件,（8）RNA聚合酶-,DNA directed/dependent RNA,polymerase(DDRPase),催化反应：,n,1,ATP,+,n,2,GTP,+,n,3,CTP,+,n,4,UTP,DNA指导RNA聚合酶,DNA（模版），Mg,2+,RNA+(n,1,+n,2,+n,3,+n,4,)PPi,模板：DNA,引物：不需要,底物：4种NTP,合成方向：53,辅助因子：Mg,2+,or Mn,2+,（促进聚合反应）,41/59,原核RNA聚合酶,组成：RNA聚合酶由5个亚基组成，2为全酶（,分子量为480kD,），2为关键酶,作用：,识别开启子,解开双链,延长,识别转录中止信号,与调整蛋白作用,42/59,真核生物RNA聚合酶,核仁,核基质,核基质,43/59,开启子：RNA聚合酶结合DNA部位，包含一些转录调控组件,TTGACA盒子,TATA盒子,开启子区,结构基因,-10bp,+1,转录,初级转录物RNA,-35bp,真核开启子结构,原核开启子结构,44/59,转录后加工,原核RNA不需加工，边转录边翻译,真核RNA需要加工,rRNA,tRNA,mRNA,5加帽,3加尾,剪接,在转录过程中,转录后进行,RNA前体,（初级转录产物，primary transcript）,加工（断裂、修剪、修饰）,成熟RNA,45/59,蛋白质生物合成（翻译）,概念：遗传密码/密码子/反密码子、开放阅读框架（ORF）、起始密码/终止密码、同义密码子、rRNA/核糖体、粗面内质网、移码突变、SD序列、信号肽,mRNA、rRNA、tRNA在蛋白质合成中作用,密码子特点,原核生物和真核生物核糖体比较,蛋白质合成过程,原核细胞和真核细胞蛋白合成比较,蛋白质生物合成所需能量,蛋白质生物合成抑制剂,46/59,密码子特点,连续性,:,两个密码子之间无任何核苷酸加以隔开和重合，如插入/删除碱基，可发生移码突变或框移.,简并性,:,除Met，Trp外，其余氨基酸均由2个以上密码子编码。其中,UAG,UAA,UGA是终止密码子,AUG是起始密码子同时又编码蛋氨酸；但细菌例外，在细菌中GUG表示起始甲酰蛋氨酸。,通用性,:全部生物使用同一套密码子，仅有少数例外，比如：线立体起始密码子为AUG、AUU;终止密码为AGA，AGC；色氨酸为UGA等。,摆动性,：,一个氨基酸可有多个密码子,反密码子与mRNA第三个核苷酸配对时，不严格遵从碱基配对标准，可出现U-G,I-C,I-A,此种配对为不稳定配对，又称摇摆性。普通前两个碱基决定其专一性，第三位碱基可有变异,47/59,原核生物核糖体,真核生物核糖体,80S,60S,40S,5SrRNA，5.8SrRNA，28SrRNA,49种蛋白质,18SrRNA,33种蛋白质,48/59,tRNA,1.结合氨基酸:,氨基酸各有其特异tRNA携带，一个氨基酸有几个tRNA携带，结合需要ATP供能,氨基酸结合在tRNA3-CCA位置,2.反密码子:,每种tRNA反密码子，决定了所带氨基酸能准确在mRNA上对号入座,3.,起始密码子：,AUG表示甲硫氨酸，又是起始密码,真核生物有两种，tRNA,i,met,tRNA,e,met,原核为甲酰化甲硫氨酸，用tRNA,fmet,表示,tRNA,fmet,甲酰基由一碳单位提供,49/59,蛋白质合成过程:,1、氨基酸活化与转运,2、翻译起始（以原核为例）,3、肽链延长,4、肽链合成终止,蛋白质生物合成方向：N端C端,mRNA翻译方向：53,蛋白质合成除需要aa外，还需要ATP、GTP，一系列酶 和许多辅助因子。,氨基酸活化和转运:,由高度特异氨酰-tRNA合成酶催化:,50/59,参加翻译蛋白质因子,阶段原核 真核 功 能,IF1,IF2,e,IF2 参加起始复合物形成,IF3,e,IF3、,e,IF4C,起始 CBP I 与mRNA帽子结合,e,IF4A B F 参加寻找第一个AUG,e,IF5,帮助eIF2、eIF3、eIF4C释放,e,IF6,帮助60S亚基从无活性核糖体上解离,EF-Tu,e,EF1,帮助氨酰-tRNA进入核糖体,延长EF-Ts,e,EF1,帮助EF-Tu、eEF1,周转,EF-G,e,EF2 移位因子,终止 RF-1,e,RF 释放完整肽链,RF-2,因子前加“,e,”表示真核生物(,eukaryotic,),51/59,蛋白质合成总结,需很多酶和辅助因子参加。,需很多酶和辅助因子参加。,折叠和加工,终止密码,eRF,GTP,终止密码,RF-1,RF-2,RF-3,GTP,肽链终止和释放,EF-1，EF-1r，GTP,肽酰转移酶,EF-2，GTP,EF-Tu，EF-Ts,GTP,K,+,肽酰转移酶,EF-G，GTP,肽链延长,（1）氨酰tRNA结合,（2）肽键形成,（3）位移,起始密码,Met-tRNA,i,Met,eIF-1eIF-6,GTP,ATP,起始密码，SD序列fMet-tRNA,IF-1,IF-2,IF-3,GTP,肽链起始,氨酰tRNA合成酶，ATP，Mg,2+,氨酰tRNA合成酶，ATP，Mg,2+,aa活化,真核生物所需因子,原核生物所需因子,过程,52/59,蛋白质生物合成抑制剂,53/59,基因表示与调控,概念：基因表示、操纵子/开启子/操纵基因、阻遏蛋白/激活蛋白、,弱化子/前导序列、,基因扩增/基因重排、顺式作用元件/反式作用因子、,锌指结构/亮氨酸拉链、常染色质/异染色质,乳糖操纵子调控,IPTG和X-gal,色氨酸操纵子调控,真核基因组结构特点,真核生物基因表示调控,54/59,乳糖操纵子结构和调控,操纵子三个结构基因为,-半乳糖苷酶、-半乳糖苷通透酶和-半乳糖苷乙酰转移酶。,在无乳糖时，,阻遏蛋白与O区结合，阻止RNA聚合酶转录,在有乳糖时，乳糖与阻遏蛋白结合后，改变了阻遏蛋白结构，使其不能与O区结合。,55/59,Trp 操纵子调控,低Trp时：,阻遏物不结合操纵基因;,高Trp时：,阻遏物+Trp 结合操纵基因56/59,转录水平调控,顺式作用元件（cis-actingelement）又称分子内作用元件，指存在于DNA分子上一些与基因转录调控相关特殊次序。主要包含开启子、增强子、缄默子。,反式作用因子（trans-actingfactor）又称为分子间作用因子，指一些与基因表示调控相关蛋白质因子。真核生物反式作用因子通常属于转录因子（transcriptionfactor，TF）反式作用因子与顺式作用元件之间共同作用，才能够到达对特定基因进行调控目标。,其中DNA结合功效域模式主要有三种：,-HTH(helix-turn-helix)和HLH(helix-,loop-helix,HLH)结构,-锌指结构(zinc finger motif),-亮氨酸拉链结构(leucine zipper),57/59,58/59,59/59,