第一节酶生物合成的调节.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,Chapter 3 The production of Enzyme by Fermentation of Microorganism,微生物发酵产酶,1/62,酶生产方法,提取分离法,(Extraction),生物合成法,(Biosynthesis),化学合成法,(chemicalsynthesis),SOD-blood,Papain-Papaya,Chymotrypsin-Pancrea,organ/tissue/cell,Amylase from Bacillus,Protease from Bacillus,Phosphatase from Bacillus,Glucoamylase from Aspergillus,Plant cell culture,Animal cell culture,Few example,酶生产：指经过各种方法取得人们所需酶技术过程,2/62,一、提取分离法,酶提取：在一定条件下，用适当溶剂处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂中过程。,主要提取方法：,盐溶液提取,酸溶液提取,碱溶液提取,有机溶剂提取等,注意选择适当,溶剂！,3/62,优点：提取方法简单方便,缺点：,必须先取得含酶组织或细胞,受气候环境影响,若培养细胞则工艺路线变复杂,产品含杂质较多，分离纯化较困难,4/62,适用范围,在动植物资源丰富地域,从动物胰脏中提取各种胰蛋白酶，小肠中提取碱性磷酸酶,5/62,二、生物合成法（发酵法）,利用微生物细胞、植物细胞或动物细胞生命活动而取得人们所需酶技术。,6/62,细胞,培养,方式,不一样,液体,深层,培养,发酵,固体,培养,发酵,固定化,细胞,发酵,固定,化原,生质体,发酵,酶发酵生产：经过预先设计，经过人工操作，利用微生物生命活动取得所需酶技术过程。,7/62,1,、固体培养发酵,培养基以麸皮、米糠等为主要原料，加入其它必要营养成份，制成固体或半固体曲麸，经过灭菌、冷却后，接种产酶微生物菌株，在一定条件下进行发酵，以取得所需酶。,8/62,优点设备简单，操作方便。麸曲中酶浓度尤其高，尤其适合用于各种霉菌培养和发酵产物。,缺点：劳动强度大，原料利用率低，生产周期长。,9/62,2,、液体深层发酵,将液体培养基置于生物反应器中，经过灭菌、冷却后，接种产酶细胞，在一定条件下进行发酵，生产得到所需酶。,优点：机械化程度较高，技术管理较严格，酶产率较高，质量较稳定，产品回收率较高。是当前酶发酵生产主要方式。,10/62,优点：,生产周期短,酶产率较高,不受资源限制,缺点：对发酵设备和工艺条件要求较高,11/62,三、化学合成法,是一个新兴技术,不足,单体底物要求纯度高,成本高昂,只能合成已经清楚化学结构酶,12/62,化学合成法新进展,模拟酶,13/62,第一节 酶生物合成过程及调整,14/62,Reverse,transcription,1,、中心法则,-Central Dogma,15/62,Replication,复制,：,亲代,DNA,或,RNA,在一系列酶作用下，生成与亲代相同子代,DNA,或,RNA,过程。,Transcription,转录,：,以,DNA,为模板，按照碱基配对标准将其所含遗传信息传给,RNA,，形成一条与,DNA,链互补,RNA,过程。,Translation,翻译,：,亦叫转译，以,mRNA,为模板，将,mRNA,密码解读成蛋白质,AA,次序过程。,Reverse translation,逆转录,以,RNA,为模板，在逆转录酶作用下，生成,DNA,过程。,16/62,2,、,RNA,生物合成,(,转录,)-Transcription,细胞内,RNA,生物功效,(1),在一些,RNA,病毒中，其所含双链,RNA,作为遗传信息载体。,(2),在蛋白质生物合成过程中，各种,RNA,起着主要作用。,tRNA,作为氨基酸载体，并由其上反密码子识别,mRNA,分子上密码子；,mRNA,作为蛋白质合成模板，由其分子上三联体密码控制蛋白质分子中氨基酸排列次序；,rRNA,与蛋白质一起组成核糖核蛋白体（核糖体），作为蛋白质生物合成场所。,(3),一些,RNA,含有生物催化活性，属于核酸类酶，在一定条件下，能够催化相关生化反应。,(4),各种小分子,RNA,在分子修饰和代谢调整等方面有主要作用。,17/62,转录过程特点,1,、转录不对称性,反义链,antisense strand,（无意义链，负链）,有义链,coding strand,（编码链，正链）,2,、转录所需酶,18/62,转录过程,起始位点识别,recognition,转录起始,initiation,链延伸,elongation,转录终止,termination,转录后加工,modification,19/62,The,E.coli,RNA polymerase holoenzyme consists of,six subunits:,a,2,bb,s.,Possible catalytic subunits,Promoter,specificity,Enzyme assembly,promoter recognition,activator binding,Role unknown,(not needed,in vitro,),36.5 kDa,151,155,11 kDa,(32-90 kDa),20/62,转录起始,关键酶与,因子结合成全酶,全酶与,DNA,模板结合生成不稳定复合物，沿模板移动寻找到开启子,生成酶与开启子复合物,DNA,双螺旋部分解链,因子释放,21/62,转录延伸,22/62,RNA,链合成终止,RNA,聚合酶抵达终止密码子，,RNA,与酶从,DNA,上脱离，,RNA,链合成终止,RNA,前体加工,剪切反应,剪接反应,末端连接反应,核苷修饰反应,23/62,24/62,3,、蛋白质合成,(,翻译,)-Translation,翻译,:,以,RNA,中,mRNA,为模板,按照其,核苷酸次序所组成密码指,导蛋白质合成过程,.,mRNA,蛋白质,翻译,各种信息 各种蛋白质,（核苷酸排列次序）（氨基酸排列次序）,25/62,蛋白质合成几个要素,-mRNA(,模板，,template),mRNA,是带有,DNA,遗传信息指导蛋白质合成直接模板。,以,mRNA,为模板,合成一定结构多肽链过程,翻译,),，就是将,mRNA,分子中核苷酸排列次序转变成蛋白质分子中氨基酸排列次序。,26/62,蛋白质合成几个要素,-,遗传密码，,nucleotide triplet codon,mRNA,分子中,每三个相邻核苷酸组成三联体代表某种氨基酸或其它信息，称为,密码子,或,三联密码,。,四种核苷酸编成三联体可形成,4,3,个即,64,个密码子。其中：,一个起始密码,:,AUG,三个终止密码,:,UAA UGA UAG,多数氨基酸拥有,2-4,个密码,27/62,28/62,29/62,蛋白质合成几个要素,-,转运,RNA(,transporter,),tRNA,是氨基酸转运工具，携带活化氨基酸到核蛋白体。,tRNA,有特异性，最少有,20,种以上。每种,tRNA,反密码环顶端都有由三个核苷酸组成,反密码,，能与,mRNA,上对应密码互补结合。,30/62,酪,5,5,3,AUG,GUU UAC ACA,酪氨酰,-,tRNA,反密码,mRNA,密码,(codon),与反密码,(anticodon),碱基配对,31/62,蛋白质合成几个要素,-,核糖体，,ribosome,核糖体（或称核糖核蛋白体）由蛋白质和,rRNA,组成。是存在于细胞质内微小颗粒。,32/62,The ribosome composition of prokaryotic and eukaryotic cell,33/62,蛋白质合成几个要素,-,其它因子和酶,其它辅助因子,工具酶,34/62,蛋白质合成过程,肽链合成起始,initiation,肽链合成延伸,elongation,肽链合成终止与释放,termination and release,合成多肽输送和加工,transport and modification,蛋白质分子折叠,folding,35/62,氨基酸活化生成氨酰,-tRNA,反应式,A.A,+,tRNA,+,ATP,氨酰,tRNA,合成酶,氨酰,-tRNA,+,AMP,+,PPi,普通而言，原核生物第一个氨基酸是甲酰甲硫氨酸，起始,tRNA,是,fMet-tRNA,F,。,真核生物第一个氨基酸是甲硫氨酸，起始,tRNA,是,Met-tRNA,MET,。,36/62,蛋白质合成起始,30 S,亚基,+IF,3,mRNA,30S-IF,3,-,mRNA,复合物,fMet-tRNA,F,+IF,2,+GTP,fMet-tRNA,F,-IF,2,-GTP,IF,1,30S,起始复合物,70S,核糖体,IF,1,、,IF,2,、,IF,3,GDP+Pi,37/62,38/62,进位,转位,成肽,肽链延伸,39/62,合成终止,40/62,高效率蛋白质合成体系,41/62,42/62,4,、酶生物合成调整,(regulation),43/62,组成酶：,DNA,酶，,RNA,酶，糖酵解路径酶（与生长发育条件无关，常进行定量合成酶）,调整酶：适应酶，,-,半乳糖苷酶（诱导酶）,酶类型,44/62,A B,E,X,底物水平,调整,酶水平,调整,酶活性调整,酶含量调整,酶定位调整,辅助因子调整,生长发育不一样时期,外界环境改变,酶合成,与分解速度改变,（基因表示调控）,产物调整,细胞内酶调控模式,45/62,1960,年,Jacob,和,Monod,提出操纵子学说,调整基因,(R),：产生阻遏蛋白,开启基因,(P),操纵基因,(O),：与阻遏蛋白结合,结构基因,(S),：蛋白多肽链产物,操纵子,1.RNA,聚合酶结合位点,2.cAMP,及其受体蛋白复合物（,cAMP-CRP,结合位点,（,1,）操纵子学说,46/62,操纵子学说,莫诺与雅可布最初发觉是大肠杆菌乳糖,操纵子,。这是一个十分巧妙自动控制系统，这个自动控制系统负责调控大肠杆菌乳糖代谢。,乳糖可作为培养大肠杆菌能源。大肠杆菌能产生一个酶（叫做“半乳糖苷酶”），能够催化乳糖分解为半乳糖和葡萄糖，方便作深入代谢利用。编码半乳糖苷酶基因（简称,z,）是一个结构基因。这个结构基因与操纵基因共同组成操纵子。操纵基因受一个叫作阻遏蛋白蛋白质调控。当阻遏蛋白结合到操纵基因之上时，乳糖会起诱导作用，它与阻遏蛋白结合，使之从操纵基因上脱落下来。这时，操纵基因开启，相邻结构基因也表现活性，细菌就能分解并利用乳糖了，这么，乳糖便成了诱导半乳糖苷酶产生诱导物。,60,年代中期，在操纵子中还发觉了另一个开关基因，称为,开启基因,。开启基因位于操纵基因之前，二者紧密相邻。开启基因由,环腺苷酸,（,cAMP,）开启，而环腺苷酸能被葡萄糖所抑制。这么，葡萄糖便经过抑制环腺苷酸而间接抑制开启基因，使结构基因失活，停顿合成半乳糖苷酶。由此可知，结构基因同时受两个开关基因,操纵基因与开启基因调控。只有当这两个开关都处于开启状态时，结构基因才能活化。当培养基中同时存在葡萄糖和乳糖时，,葡萄糖,经过抑制环腺苷酸而间接抑制开启基因，并进而抑制结构基因，使细菌不产生半乳糖苷酶。这种情况下，细菌便会自动优先利用葡萄糖，因为葡萄糖果是比乳糖更加好能源。,47/62,R P O S1 S2,DNA,调整,基因,开启基因,操纵基因,结构基因,与阻遏蛋白结合,1.RNA,聚合酶结合位点,2.cAMP,及其受体蛋白复合物（,cAMP-CRP,）,结合位点,产生阻遏蛋白,mRNA,操纵子,48/62,诱导型操纵子,无诱导物,不表示或低表示、,有诱导物,转录成,mRNA,合成酶,阻遏型操纵子,无诱导物,正常表示,有诱导物,转录受阻,49/62,（,2,）原核生物中酶生物合成调整机制,a.,分解代谢物阻遏作用,b.,酶生物合成诱导作用,c.,酶生物合成反馈阻遏作用,50/62,a.,分解代谢物阻遏作用,是指轻易利用碳源经过分解代谢产生物质阻遏一些酶（主要是诱导酶）生物合成现象。,cAMP,+H,2,O AMP,磷酸二酯酶,葡萄糖过,量降解,ATP,ADP,AMP,cAMP-CRP,开启基因上没有,cAMP-CRP,结合,酶合成,例：葡萄糖阻遏,-,半乳糖苷酶生物合成,实质：,cAMP,经过开启基因对,酶生物合成进行调整控制。,51/62,b.,酶生物合成诱导作用,加进某种物质，使酶生物合成开始或加速进行过程。,举例：,乳糖诱导,-,半乳糖苷酶合成,R P O S1 S2,DNA,无诱导物时：,添加诱导物时：,R P O S1 S2,DNA,诱导物,转录,翻译,mRNA,酶,乳糖 别,乳糖,52/62,c.,酶生物合成反馈阻遏作用,产物阻遏作用）,是指酶催化作用产物或代谢路径末端产物使该酶生物合成受阻过程。,举例：无机磷酸阻遏碱性磷酸酶,无阻遏物时：,添加阻遏物时：,R P O S1 S2,DNA,翻译,mRNA,R P O S1 S2,DNA,共阻遏物,磷酸单酯 磷酸,+,醇,碱性磷酸酶,53/62,（,3,）酶生物合成模式,细胞在一定条件下培养生长，其生长过程普通经历调整期、生长久、平衡期和衰退期等,4,个阶段,经过分析比较细胞生长与酶产生关系,能够把酶生物合成模式分为,4,种类型。即,同时合成型,，,延续合成型，中期合成型,和,滞后合成型,。,54/62,a,、同时合成型,酶生物合成与细胞生长同时进行一个酶生物合成模式。该类型酶生物合成速度与细胞生长速度紧密联络，又称为,生长偶联型。,大部分组成酶生物合成属于同时合成型，有部分诱导酶也按照此种模式进行生物合成,。,比如米曲霉在含有单宁或者没食子酸培养基中生长，在单宁或没食子酸诱导作用下，合成单宁酶（,tanase EC 3.1.1.20,）。,55/62,属于同时合成型酶，其生物合成伴伴随细胞生长而开始；在细胞进入旺盛生长久时，酶大量生成；当细胞生长进入平衡期后，酶合成伴随停顿。,细胞,浓度,mg/ml,酶,浓度,U/ml,总细胞浓度 活细胞浓度,胞外酶浓度 胞内酶浓度,特点：该类酶所对应,mRNA,很不稳定，其寿命一,般只有几十分钟，细胞进入平衡期后新,mRNA,不再生成，原有,mRNA,被降解，酶生物合成停顿。,mRNA,不稳定，无阻遏作用,56/62,b,、延续合成型,酶生物合成在细胞生长阶段开始，在细胞生长进入平衡期后，酶还能够延续合成一段较长时间。,属于该类型酶能够是组成酶，也能够是诱导酶。比如，在黑曲霉在以半乳糖醛酸或果胶为单一碳源培养基中培养，能够诱导聚半乳糖醛酸酶（,Polygalacturonase,，,EC3.2.1.15,）生物合成。,细胞,浓度,mg/ml,酶,浓度,U/ml,细胞,浓度,mg/ml,酶,浓度,U/ml,以半乳糖醛酸为诱导物,以含有葡萄糖果胶为诱导物,特点：这些酶所对应,mRNA,相当稳定，,在平衡期后仍 可合成相对应酶,mRNA,稳定，不受阻遏,57/62,c.,中期合成型,该类型酶在细胞生长一段时间以后才开始，而在细胞生长进入平衡期以后，酶生物合成也伴随停顿。,比如，枯草杆菌碱性磷酸酶（,Alkaline phophatase,，,EC 3.1.3.1),生物合成模式属于中期合成型。,细胞,浓度,mg/ml,酶,浓度,U/ml,特点：酶生物合成受产物或分解代谢产物,阻遏作用，而酶对庆,mRNA,稳定性较差,mRNA,不稳定，受阻遏,58/62,d.,滞后合成型,这类型酶是在细胞生长一段时间或者进入平衡期以后才开始其生物合成并大量积累。又称为,非生长偶联型,。,许多水解酶生物合成都属于这一类型。,原因是,因为受到培养基中存在阻遏物阻遏作用。只有伴随细胞生长，阻遏物几乎被细胞用完而使阻遏解除后，酶才开始大量合成。,若培养基中不存在阻遏物，该酶合成能够转为延续合成型。该类型酶所对应,mRNA,稳定性很好，能够在细胞生长进入平衡期后相当长一段时间内，继续进行酶生物合成。,黑曲霉羧基蛋白酶生物合成,放线菌素,D,对产酶影响,细胞,浓度,mg/ml,酶,浓度,U/ml,酶,浓度,U/ml,酶,浓度,U/ml,30,22,不加,加入,不加,加入,mRNA,稳定，受阻遏作用,59/62,理想酶合成模式,酶所对应,mRNA,稳定性以及培养基中阻遏物存在是影响酶生物合成模式主要原因。,mRNA,稳定性好，能够在细胞生长进入平衡期以后，继续合成其所对应酶；,mRNA,稳定性差，就伴随细胞生长进入平衡期而停顿酶生物合成；,不受培养基中存在一些物质阻遏，能够伴伴随细胞生长而开始酶合成；,受到培养基中一些物质阻遏，则要在细胞生长一段时间甚至在平衡期后，酶才开始合成并大量积累。,60/62,在酶发酵生产中，为了提升产酶率和缩短发酵周期，,最理想合成模式应是延续合成型。,因为属于延续合成型酶，在发酵过程中没有生长久和产酶期显著差异。细胞一开始生长就有酶产生，直至细胞生长进入平衡期以后，酶还能够继续合成一段较长时间。,61/62,改良方法：,同时合成型,尽可能提升其对应,mRNA,稳定性，为此适当降低发酵温度是可取办法；,滞后合成型酶,设法降低培养基中阻遏物浓度，尽可能降低甚至解除产物阻遏或分解代谢物阻遏作用，使酶生物合成提早开始；,中期合成型酶,在提升,mRNA,稳定性以及解除阻遏两方面下功夫，使其生物合成开始时间提前，并尽可能延迟其生物合成停顿时间。,62/62,