标免-抗体(13).ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,Antibody,，,Ab,B,细胞识别抗原后，增殖、分化为浆细胞所产生的一种蛋白质，主要存在于血清等体液中，能与相应抗原特异性结合。,IgG,如何评价抗体质量？,效价（稀释度）,特异性（交叉反应率）,亲和性（平衡常数）,纯度（,IgG,）,种类（人工制备抗体）,多克隆抗体（免疫血清）,Polyclonal antibody,，,PcAb,单克隆抗体,Monoclonal antibody,，,McAb,基因工程抗体,Genetic engineering antibody,免疫原,Immunogen,指用于制备抗体的抗原（,antigen,）或半抗原（,hapten,）,免疫原,颗粒性,血细胞或细菌,可溶性,完全抗原,半抗原,-,载体,合成肽,-,载体,如何纯化单一蛋白质抗原？,制备组织匀浆,细胞溶解或破碎,选择性沉淀,色谱分离,鉴定,溶解细胞的措施,常规纯化蛋白技术,盐析,色谱,凝胶色谱,离子交换色谱,亲和色谱,色谱,免疫亲和色谱,纯化抗原重要手段,关于佐剂使用说明,佐剂,Adjuvant,指能够增强免疫应答或改变免疫应答类型的物质，应用时可与抗原同时或预先注射于机体。佐剂本身可以有免疫原性，也可以没有免疫原性。,佐剂种类：,具有免疫原性,抗酸杆菌（,BCG,）,无免疫原性,福氏佐剂,氢氧化铝,常用：,福氏佐剂,Freund adjuvant,Complete,Freund adjuvant,羊毛脂,石蜡油,BCG,In,Complete Freund adjuvant,羊毛脂,石蜡油,使用原则：,颗粒性抗原一般情况下不需使用；,可溶性大分子量的蛋白质免疫原、人工抗原，初次免疫时必须使用佐剂；,不连续两次使用完全福氏佐剂，以免导致动物严重反应；,Part 1,00000000,免疫原的制备,Part,2,多克隆抗体的制备,Part,3,单克隆抗体的制备,多克隆抗体,免疫血清,如何获得高质量免疫血清？,免疫原,合适动物,免疫方案,制备理想免疫原,选择免疫动物,确定免疫方案,实施免疫程序,检测抗体效价,采血分离血清,抗体纯化鉴定,如何选择动物？,免疫原与动物种属关系,动物个体状况的选择,抗血清用量和要求,免疫方案,免疫剂量,体积和浓度,免疫途径,次数与间隔,全量免疫方案,微量免疫方案,采血方法,待抗体效价合格，需加强免疫，,35,日后采血，采血前需禁食,外周静脉,颈动脉插管,心脏穿刺,抗体纯化,特异性,确保与类似物质不发生结合,蛋白纯度,丙球,IgG,Fab,纯化,-,免疫血清,特异性,免疫原的纯度,后期纯化,免疫吸附,交叉抗原（反向吸附）,特性抗原（正向吸附）,抗体纯化,纯度,饱和硫酸铵盐析,蛋白,A,亲和层析,盐析后需除盐,Protein A,蛋白,A,亲和层析,pH 7.4 PB,平衡,pH 3,洗脱缓冲液,pH 8.9,结合缓冲液,pH 6,洗脱缓冲液,pH 3,洗脱缓冲液,鉴定,特异性,效价,亲合力,纯度,PcAb,McAb,免疫血清储存,冷冻保存,冷冻干燥保存,4,保存,Part 1,00000000,免疫原的制备,Part,2,多克隆抗体的制备,Part,3,单克隆抗体的制备,定义,单克隆抗体,monoclonal antibody,，,McAb,由单个杂交瘤细胞增殖而成的细胞克隆产生的，针对某一抗原表位的、完全均一的、单一特异性的抗体,克隆选择学说,B,细胞表面具有单一一种抗原受体，只识别一种抗原表位，并产生针对该表位的抗体。,clonal selection theory,hybridoma cell,杂交瘤技术,关键,亲本细胞与选择细胞的融合,选择培养基与杂交瘤细胞的实现,亲本细胞,免疫脾细胞,抗原致敏且分泌抗体,骨髓瘤细胞,长期在体外无限繁殖,免疫脾细胞,动物免疫,同免疫血清制备,制备脾细胞悬液,BALB/,c,小鼠,骨髓瘤细胞（,SP2/0,or NS1,）,选择有,HGPRT,或,TK,缺陷的细胞株；,次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（,HGPRT,）,胸苷激酶（,TK,）,与,B,细胞杂交形成稳定的杂交瘤细胞；,骨髓瘤细胞本身不分泌免疫球蛋白；,具有较高融合效率；,骨髓瘤细胞（,SP2/0,or NS1,）,确保,酶缺陷需验证）,状态（活力）,+,8-,Azaguanine,Myeloma Cells,HGPRT,-,Myeloma Cells,融合（,fuse,）,生物法,化学法,PEG,物理法,筛选杂交瘤细胞,筛选杂交瘤细胞,选择培养基,HAT,次黄嘌呤（,H,）,氨基蝶吟（,A,）,胸腺嘧啶（,T,）,要点：,免疫脾细胞的制备,骨髓瘤细胞的培养与筛选,细胞融合,筛选阳性克隆,克隆化,抗体的大量制备,融合：,关键一步；,融合前亲本细胞需经预处理；,融合于,37,水浴中进行；,注意两种亲本细胞的比例；,选择高质量细胞融合剂；,缓慢终止融合作用；,Derived from different B Lymphocytes cell lines,POLYCLONAL.,MONOCLONAL.,Derived from a single B cell clone,Batch to Batch variation affecting Ab reactivity&titre,mAb offer Reproducible,Predictable&Potentially inexhaustible supply of Ab with exquisite specificity,Enable the development of secure immunoassay systems.,NOT Powerful tools for clinical diagnostic tests,