污染物生物效应检测.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第四章 污染物生物效应检测,第一节 生物测试及方式,第二节 生物毒性试验,第三节 生物三致效应检测,1,1/103,第一节生物测试及方式,一、生物测试,生物测试,（Bioassay）指利用生物反应测定一个或各种污染物或环境原因单独或联合存在时，所造成影响或危害。实际上就是用生物去测定污染物危害。,可在分子、细胞、组织、器官、甚至个体和种群各种水平上进行。,2,2/103,污染物毒性生物测试优点,：,1)生物测试不需特殊仪器、方法简单。2)可提供污染物生物毒性，而常规物理和化学检测只能测定污染物浓度。3）可测定污染物之间相互作用,以及它们对生物体综合效应,而常规物理和化学检测则做不到。4）还可了解环境原因对污染物毒性影响。如水体pH、溶氧量、氧化还原电位、水体中有机和元机配位体对污染物毒性影响等。,3,3/103,生物测试意义,：,1）研究各种污染物联合作用生物效应。,2）监测环境质量改变。,3）制订环境质量标准。,4）对制订排污标准，以及对污染物生态风险评价有主要意义。,4,4/103,但注意：,（1）污染物结构、性质、毒作用机理不一样，同一个生物对不一样污染物反应不一样。,（2）不一样生物解毒机制、及能力不一样，因而不一样生物对相同污染物有不一样反应。,（3）不一样发育阶段生物对同种污染物反应也不一样。,（4）受污染毒害经验也会影响生物对有毒污染物反应。,5,5/103,（一）生物测试方式,依据不一样研究要求和目标，可进行不一样测试。测试方法多样，有按时间分、有按试验溶液和气体给予方式分。,1、短期生物测试,（Short term bioassays）,指被测试生物在,短时间,内暴露于,高浓度,污染物下，测定污染物对生物有机体影响。例：急性毒性试验，以快速估价污染物毒性。,6,6/103,1)测试目标：,（1）快速预计污染物毒性；（2）评价几个毒物相对毒性；（3）评价不一样生物对不一样条件如温度、pH相对敏感性等。,主要用于测定半致死浓度(LC50)、或半抑制浓度(IC50)或半效应浓度(EC50)。,2)时间设定,：普通小于1周，如 普通水蚤类 2d，藻类 3d，鱼类 4d。,7,7/103,3)测试特点,（1）暴露时间短；仅几天。（2）污染物浓度高；,（3）普通采取静止式给予有毒溶液或气体。,但对于以下情况，应用流动式给药：1）不稳定且易挥发污染物（浓度会渐低)；2）BOD较高污水(低O2)；3）代谢速率快受试生物（产生高代谢产物如CO2和NH3会影响受试生物代谢。,8,8/103,2、长久生物测试,（Long term bioassays）,在,低浓度,下，受试生物,长久,被暴露于污染物下测试，又称,全部生活史生物测试,，常见有,慢性毒性试验,。,1）测定目标,测定在长久污染下，不造成有害效应毒物最大浓度，或,最大允许毒物浓度（MATC）,。,测定包含毒物对生物生长、生殖、产卵、孵卵、幼体成活等影响。,9,9/103,2）时间确定,（1）对动物而言，需要从一个卵期到下一个卵期或更长连续测定；,（2）对于更小生物如浮游生物，要连续好几代测试；,（3）但对生活史尤其长动物，人们则选择在整个生活史中最敏感几个阶段测试。如在鱼发育早期测定，这种测定又称部分生活史生物测试。,10,10/103,3)长久生物测试要求,(1)只能采取流动式染毒性。,(2)室内试验条件，如水温、pH、硬度等必需和自然季节改变相符。,(3)受试 生物生长、发育规律符合季节改变。,11,11/103,3、中期生物测试,（Intermediate term bioassays）,（,1,）目标:,介于短期和长久之间一类生物测试。如亚慢性毒性试验。,对毒物毒作用、靶器官和最大无作用剂量或中毒阈值作出预计,。,（,2,）测试时间：8天之内算是短期，8-90天之间中期。,（,3,）毒物给予方式：不论毒物是溶液还是气体，给予方式普通采取流动式，少数可采取静止式。,12,12/103,（二）受试生物选择,1）对毒物敏感性：,SO,2,敏感植物：紫苜蓿、大麦、棉花、小麦、三 叶草、甜菜、莴苣、大豆、向日葵。O,3,敏感植物：烟草、番茄、矮牵牛、菠菜、土豆、燕麦、丁香、秋海棠、女贞、梓树。2）具生态学价值或经济价值。3）试验室内易培养和繁殖。4）具清楚生物学背景资料如生活史、生长、发育特点等；5）足够数量。6）对毒物反应易测性。,另外，个体大小、生活史长短，以及以前受污染情况也需考虑。,13,13/103,二、生物测试标准化,（一）影响生物测试原因,1、受试生物,：受试生物种类、生终年纪（生活阶段、尺寸大小、脱皮阶段）、发育阶段、食物供给程度等均影响生物对毒物敏感性。,2、试验条件,：如试验水质温度和含盐量、水流速度和溶解氧、水域酸碱度、受试生物总量，不但影响生物对毒物反应，而且影响作用于生物毒物浓度、性质和形态。,3、试验操作,：试验结果还受人员操作水平、仪器设备精度、测定方法影响。,14,14/103,（二）标准化测试优点,1）增加数据准确度，利于数据比较。,2）测试能够被其它试验室重复。,3）筛选不一样试验室一致试验结果。,4）可为环境标准建立提供可靠数据，如饮用水环境质量标准等。,15,15/103,（三）标准化生物测试方法,有水质物质对蚤类急性毒性测定方法B/T13266-91)、水质物质对淡水鱼（斑马鱼）急性毒性测定方法(GB/T13267-91)等。,主要,对1）毒物分析方法、环境条件测定方法，2）仪器设备,3）生物大小、生物量，4）水溶解氧和pH,5）统计方法作出了国家要求。,但对那些易分解、非常见和混合污染物测定还极难进行标准化测定。,16,16/103,第二节 生物毒性试验,一、生物毒性,（一）生物毒性基本概念,1、毒物（Toxicant）和,毒性,（1）毒物,：在一定条件下，以,较小剂量,给予有机体时，与生物相互作用后而引发,功效或器质性损伤,化学物质称,毒物,。,或,剂量虽微,，但,积累到一定量时，就能干扰或破坏机体正常生理功效，而引发暂时或持久性病变，甚至危及生命化合物，称,毒物,。,17,17/103,（2）毒性,(Toxicity),:指毒物产生有害作用能力。,与以下原因相关：,1）进入机体剂量。体内,潜在性有毒物质存在,并不意味发生中毒，通常只有达中毒剂量时，才可引发中毒。,2）进入机体方式（如经口、皮肤或呼吸）。,3）接触时间及频率。时间越长、频率越高，越引发中毒。,18,18/103,2、中毒（toxication）,受到毒物作用，引发生物有机体功效和器质性损伤后，所出现,疾病状态,称中毒。,如有机磷中毒后出现震颤、出汗、瞳孔缩小等。中毒是在各种毒物作用下，在局部或全身综合表现。,（1）毒效应或毒性作用,化学物引发生物有机体损伤总称为,毒性作用或毒效应,。可用相关生理生化指标表示。如有机磷农药对胆碱酯酶活性抑制；苯抑制造血功效而引发贫血。,19,19/103,（2）毒物反应（reaction）,指接触化学物质后，表现某种效应个体在一个群体中所占百分比。,（3）毒物危险性,和危害性,1,）,毒物,危,险,性,指某一化学物质,在正常,生产、使用,过程中，能引发有机体发生,中毒可能性,，,称毒物,危险性，,是,毒物,对个人或群体毒性效应和产生疾病甚至死亡,定量预计,。,20,20/103,2,）,毒物危害性,：,指有毒物质与有机体,接触和使用,过程中，有引发,中毒可能性,，,称,毒物危害性，用来,定性,表示毒物对人群健康引发有害作用。,物质危害性大小普通与物质进入体内能力和数量相关，挥发性小，易溶于水或血液中，并能快速到达中毒浓度物质危害性大。,21,21/103,（二）毒性参数,1、惯用毒性参数,（1）致死剂量或致死浓度,(LD，lethal dose or LC，lethal concentration),绝对致死剂量或浓度（LD100，Absolute lethal dose or LC100，Absolute lethal concentration）,指一群动物全部死亡最低剂量或浓度。,半致死剂量或浓度（LD50，Median lethal dose or LC50，Median lethal concentration）指能引发一群动物死亡50%最低剂量或浓度。,22,22/103,最小致死剂量或浓度（MLD，Minimum lethal dose，MLC，Minimum lethal concentration）：能使一群动物仅个别死亡最高剂量或浓度。,(2)最大耐受剂量和最大无作用剂量,最大耐受剂量或浓度（MTD0，Maximum tolerance dose or MTC0，Maximum tolerance concentration）,能使一群动物即使发生严重中毒，但全部存活无一死亡最高剂量或浓度。,23,23/103,最大无作用剂量（Maximum no effect dose）,污染物对生物产生效应随污染物浓度或剂量降低而减弱，当外来化学物剂量,减到一定量,时，生物学改变已到达0，,不能观察到任何损害作用最高剂量,称最大无作用剂量。,其是制订,人体每日允许摄入量,、,最高允许浓度,和评定污染物毒性作用主要依据。,24,24/103,最小有作用剂量（Minimal effect level）,指能使有机体发生某种异常改变所需最小剂量。其普通大于最大无作用剂量，所以又称中毒阈剂量。,半数效应浓度(EC50,Median effect concentration),指能引发50%受试生物某种效应改变浓度。,半数抑制浓度(IC50,Median inhibition concentration),指能引发受试生物某种效应50%抑制浓度。,25,25/103,（3）毒作用带（Toxic effect zone）,：是恒量污染物,危险性,大小一个指标。,急性毒性作用带,：,为半致死量与急性毒性最小有作用剂量比值。,此值愈大，污染物危险性愈小，反之危险性愈大。,26,26/103,慢性毒性作用带,：,是恒量毒物急、慢性毒性一个指标，急性毒性最小有作用剂量与慢性毒性最小有作用剂量之比。,比值愈小，表明引发急性中毒危险性相对较大。反之，引发慢性毒性中毒可能性愈大。,27,27/103,2、毒物单位与分级,（1）毒物单位（浓度）：,毒物在空气中浓度以mg/m3或mg/L表示；哺乳动物以mg/Kg或ml/kg体重表示；水环境中毒物以mg/L或g/L表示。,（2）毒物分级,：毒物,毒性大小与半数致死量成反比,，但不一样化合物之间毒性差异很大，可达百万甚至几千万倍。,为了加强毒物在生产、运输、使用和贮存方面管理；便于制订和比较环境质量标准；在发生意外时,采取对应保护办法，必须对毒物进行分级。,28,28/103,1）我国工业毒物急性毒性分级,29,29/103,2）我国农药急性毒性分级,30,30/103,3）水生生物评价体系,31,31/103,二、毒性试验,（一）急性毒性试验,指研究化学物质大剂量,一次染毒,或者说,24h内屡次染毒,，动物所引发毒性试验。,目标：为了在短期内了解某物质,毒性大小,，需做急性毒性试验(Acute toxicity test)。,有哺乳动物急性毒性试验、水生生物急性毒性试验和蚯蚓急性毒性试验。,32,32/103,1、哺乳动物急性毒性试验,：,（1）试验材料：小鼠和大鼠，若,进,行毒物皮试试验，还可用家兔和豚鼠。,（2）确定动物全活和全致死量,查阅文件中与受试物类似物LD,50,(LC,50,)，普通以3倍之差配制三个剂量组进行预试验（1/3 LD,50,，LD,50,3 LD,50,），每组3只动物，求出全致死量和全活剂量。,33,33/103,34,34/103,（3）在预试验全活量和全致死量之间，以各组间距1.2 1.5“等比级数”计设56个剂量组，进行染毒。观察2周内死亡情况。,（4）病了解剖检验：剖检死亡或濒死动物及部分存活动物，计算LD,50,或LC,50,。,（5）依急性毒性分级标准，依据LD,50,或LC,50,，评定毒物毒性，LD,50,值愈小，毒性愈大。,35,35/103,2、水生生物急性毒性试验,依据试验对象，可分为鱼类、水蚤类和藻类毒性试验。,（1）试验用鱼,：选择有区域代表性、便于试验喂养、对物质敏感鱼苗，如青、草、鲢及鳙四大淡水鱼。体长普通小于7 cm为宜。有时还可用体长小于3 cm金鱼。,（2）试验条件,：采取玻璃缸或白搪瓷桶。盛水量以每条2 3L水为宜，pH6.7 8.5，冷水温度12 18温水温度20 28，水温改变 2，水中溶解氧不能低于4 mg/L，可用清洁河水、湖水或放置3天自来水。,36,36/103,37,37/103,（3）LC,50,测定,1）确定鱼全活和全致死量：方法同哺乳动物，也从文件中查阅与受试物类似物LD,50,(LC,50,)，做预试验，确定全致死量和全活剂量。,2）以此浓度范围，按“等对数间距”确定57个浓度组。每组1020尾鱼，染毒4896 h。染毒刚开始8 h内经常观察，以后作24、48、72和96小时定时观察，统计中毒反应和死亡时间。（试验期间注意保持水体溶解氧、pH、水温稳定，并马上取出死鱼）。,3）依据24、48和96 h 各组鱼死亡数，计算LC,50,。,38,38/103,（二）亚慢性毒性试验,（Subchronic toxicity test）,人类接触环境污染物水平通,常低于急性中毒剂量,或浓度，为了得到更靠近实际情况毒作用资料，需进行亚慢性和慢性毒性试验。,在较长时期内（约动物生命周期1/301/20），使动物,每日或重复屡次染毒,所进行试验。,目标是为对毒物,毒作用机理、靶器官,和,最大无作用剂量或中毒阈值,作出预计。,39,39/103,1、动物选择,（1）普通选取对毒物敏感动物种和品系，且应与慢性毒性作用试验中预计使用动物相同。,（2）要求选择两种试验动物，啮齿类和非啮齿类各一个，啮齿动物惯用鼠和兔，非啮齿惯用狗和猫。这么可更全方面了解受试物毒草效应。,40,40/103,（3）动物大小、只数和雌雄,选取健康、年幼动物。小鼠约1417g，大鼠5080g，家兔和猫体重约12 kg，狗体重为58 Kg。各动物体重不应超出组平均体重20%。,大鼠各组不少于20只，兔、猫和狗较大动物不少于46只。雌雄各半。,41,41/103,2、染毒剂量和试验期限,（1）染毒剂量:普通用LD,50,或LC,50,1/80 1/50作为亚慢性试验剂量，也设三个剂量组。1）高剂量组：能引发显著中毒反应，但又不引发很多动物死亡为高剂量组。2）低剂量组：不引发任何中毒反应为低剂量组。3）中间剂量组：介于二者之间。,（2）试验期限:试验期限随目标和要求或动物大小而异。大鼠可90天，较大动物可46月。,42,42/103,3、染毒路径,主要经胃肠道、呼吸道和皮肤接触。注意：染毒路径应与预期进行慢性毒性作用试验相一致。,4、指标观察与检验,：3个,（1）综合指标观察：1）观察动物普通活动、症状和死亡情况。2）每七天称重一次，统计饲料或饮水量，计算生长率（各组每七天摄入食量与体重增加量之比）。3）各脏器鲜重与单位体重比重（脏器系数）。,43,43/103,（2）血液及生化检验：主要指血清、肝和肾功效检验。常规项目包含血红蛋白、红、白细胞数、血小板数、谷草转氨酶、血清尿素氮等。,（3）病理组织学检验：尸检死亡和濒死动物，以及试验结束后被处死动物。主要对肝、肾、睾丸等器官进行检验。必要时还需进行组织化学和电镜检验。,44,44/103,5、试验评价,对受试物主要毒作用、靶器官和最大无作用剂量及中毒阈剂量作出初步估价，并为深入开展慢性毒性试验提供依据。,45,45/103,（三）慢性毒性试验(哺乳动物),（Chronic toxicity test）,以,低剂量,外来化合物，,长久,与试验动物接触，观察其对试验动物所产生生物学效应试验。,目标是确定,最大无作用剂量，,为制订人体每日允许摄入量(ADI，Allowable daily intake)和,最高允许浓度(MAC,，Maximum allowable concentration)提供毒理学依据。,有哺乳动物、水生生物慢性毒性试验。,46,46/103,1、试验动物和分组,1）试验动物年纪应低于亚慢性试验。,普通选取断奶动物，如出生后3周小鼠，体重约10 12g，出生后34周大鼠，体重5070g。,2）试验动物雌雄各半。,其它与亚慢性试验相同。,47,47/103,2、染毒剂量和试验期限,依据亚慢性试验，取其最低中毒剂量1/10、1/20和1/50或LD,50,1/1001/20中取34个剂量作为慢性试验剂量。,（1）高剂量组：能引发显著中毒反应为高剂量组。,（2）低剂量组：不引发中毒反应为低剂量组。,（3）中间剂量组：介于二者之间。,试验期限：普通112月，若是致癌试验则需18 24月。,48,48/103,3、染毒路径,经胃肠道、呼吸道和皮肤接触同亚慢性试验,4、观察指标,基本同亚慢性试验，另外：,（1）在试验第1个月，每七天称体重一次，在46个月期间，每2周称体重一次，以后每4周称体重一次。,（2）每2月进行一次血液及其它生长指标(生长率、脏器系数)测定。,（3）对病理检验作半定量评定，即随染毒时间延长，器官形态结构会发生改变，需依据病变程度加以分级评分。,49,49/103,50,50/103,5、试验评价:评价受试物在低剂量长时间接触有机体时所引发毒性作用。有2个方面：,1）依据敏感观察指标，出现异常最小阈剂量，找出该受试物慢性毒作用最大无作用剂量，为受试物能否可被应用或为制订其在环境中卫生标准，提供依据。,2）经过对动物普通观察及其对各脏器病理学检验，对受试物致癌性评定提供依据。,51,51/103,（四）蓄积毒性试验,1、,低于中毒阈剂量,外来化合物，重复屡次地与机体连续接触，经,一定时间,后使机体出现显著中毒表现，即为,蓄积毒性作用,(Cumulative toxicity action)。,（1）物质蓄积,：环境污染物不停进入有机体，若吸收量大于排出量，使其在体内量逐步积累增多。,（2）功效蓄积,：不停进入有机体污染物重复作用于机体，引发机体一定结构或功效改变，并逐步累积加重，最终造成出现损害作用。,52,52/103,2、试验方法,（1）蓄积系数法,（Cumulative Coefficient method）,蓄积系数,（Cumulative Coefficient）：指屡次给受试物后，引发50%受试动物出现某种毒效应总剂量()，与一次给受试物后引发50%受试动物出现,同一毒效应,剂量（）比值。,比值愈大，说明引发50%动物出现某种毒效应使用剂量较大，药品代谢作用强，而蓄积作用较小，反之，表示蓄积作用愈强。,53,53/103,54,54/103,有两种试验方法测定K,1）固定剂量天天连续染毒法,对受试动物以1/101/20 LD,50,固定剂量，天天进行染毒一次，观察统计动物死亡情况。,当染毒累计达5个,LD,50,以上时，若受试动物死亡数未超出半数，此时蓄积系数已大于5，表明该受试动物蓄积作用不显著。,55,55/103,2）剂量定时递增染毒法,取一组受试动物，天天染毒一次，以,4天为一期,，开始第一期天天染毒剂量为,1/10 LD,50,随即染毒剂量每隔4天按,1.5倍,递增一次。,56,56/103,天天统计动物死亡情况，若连续染毒已达20天，此时,天天染毒剂量0.5 LD,50,(=1.54LD,50,/10)，累计总剂量达(1+1.5+1.52+1.53+1.54)4 LD,50,/10=5.30LD,50,。,假如受试动物死亡未到达50%,则表示该受试物蓄积作用不显著，试验可停顿。假如受试动物出现死亡达50%，就可算出染毒系数K。,57,57/103,（2）20天蓄积试验法,按LD,50,1/20、1/10、1/5、1/2和0随机分成5组，天天对动物进行染毒，连续20天，各组总剂量分别为0、1、2、4、10 LD,50,。观察停药7天内死亡情况。,1）如1/2,LD,50,组有死亡，且各剂量组呈剂量-反应关系，则受试动物有较强蓄积作用。,2）若1/20 LD,50,组有死亡，且各剂量组呈剂量-反应关系，则为中等蓄积作用。,3）若1/20 LD,50,组无死亡，且各剂量组无剂量-反应关系，则为无显著蓄积作用。,58,58/103,（3）受试物生物半减期测定法,生物半减期（T 1/2）：,指一个外来化合物在体内量或浓度下降到原来浓度或量二分之一所需时间。T 1/2越大，表明在体内存留时间越长，蓄积作用越大。,测定方法：机体接触污染物后，在间隔一定时间内分别测定血液、尿液、器官组织中该物质浓度，然后求出T。,（y1和y2分别是t1和t2时间测得该物质浓度）,59,59/103,第三节 生物致突变、致畸和致癌效应检测,一、生物致突变,1、突变,：生物体遗传物质发生了基因结构改变称为突变（mutation）。,可分为,基因突变,和,染色体突变,两大类，此两类突变本质上无差异，只是染色体突变可凭光学显微镜观察。,60,60/103,2、突变意义,（1）农业作物育种：在农业生产中，农作物就是经过定向突变筛选取得优良品种。,（2）从理论上讲，突变可能会出现有益后果，但因为概率极小，且无法判别和控制，所以，外来化学物对人类引发致突变可能有很大,潜在危险,。所以，从毒理学角度，突变普通认为是外来化合物,毒性作用表现,。,61,61/103,3、致突变试验试验方法,致突变试验：可分,基因点突变试验、染色体畸变试验和DNA损伤试验,等，可在活体或体外进行。,有（1）体外基因突变试验，（2）细胞遗传学试验，（3）体内基因突变试验，（4）DNA损伤试验等。,62,62/103,（一）体外基因突变试验（In vitro mutation test）,1、鼠伤寒沙门氏菌试验法,（1）基本原理,将一个营养缺点型如,不能合成,组氨酸,鼠伤寒沙门氏菌和化学致突变物接触，若此化合物是致突变性，则可使此突变微生物发生,回复突变,，重新成为野生型，而能在不含或少含His培养基中生长。据此判定化合物致突变作用。,为使受试物在体外测试中取得同,活体类似代谢活性,，在培养基中常加入哺乳动物肝细胞,微粒体,和,受氢系统,。,63,63/103,（2）方法优缺点,优点：方法简单；快速，普通在48 h内可得出结论；费用低；灵敏，检测结果与动物致癌性相符率达90%。,缺点：,1）,微生物遗传信息含量低，仅为哺乳动物1/6。2）微生物DNA修复系统没有哺乳动物复杂而精巧。3）微生物无免疫功效。4）对于不在肝脏代谢转化化合物，如苏铁素，不能检测其突变性。,64,64/103,2、哺乳动物体细胞株突变试验,基本原理：有些哺乳动物,突变细胞株系,，当与化学致突变物接触后会发生回复突变，代谢发生改变，依此确定毒物致突变性。,惯用细胞突变系：中国地鼠肺细胞V79、中国地鼠卵巢细胞株CHO和小鼠淋巴瘤L5178Y细胞株等。,65,65/103,（1）肺细胞V79和卵巢细胞株CHO细胞突变株系,因为嘌呤碱类似物如6-巯基嘌呤可抑制DNA合成，正常细胞株系生长会受到抑制。而 V79和CHO细胞突变株系因为缺乏,次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶,(HGPRT)，当在培养基中加入一些嘌呤碱类似物如6-巯基嘌呤等时，它们仍能生长。,当V79和CHO细胞突变系与这些嘌呤碱类似物接触后，会发生,回复突变,成正常株，生长受到抑制，说明发生了致突变。,66,66/103,（2）小鼠淋巴瘤L5178Y细胞株,此,细胞株系缺乏,胸苷激酶(TK),如在培养基中加入细胞毒素,5-溴脱氧尿苷,，仍能生长。,但当此种细胞系与致突变物接触后会发生,回复突变,，又转化为正常细胞，而恢复对此毒素利用，而抑制其生长。说明发生了致突变。,67,67/103,（二）,细胞遗传学试验(Cytogenetics Test),1、,染色体,畸变试验(,Chromosome aberration test),利用光学显微镜直接观察生物体细胞在受致突变物作用后,染色体数目和结构,改变。,(1),离体试验,：惯用,中国地鼠卵巢细胞株CHO,（缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶)和,人类外周血,（指进入血液循环血液，即,平时所采血,），检测,卵巢细胞株CHO和人类淋巴细胞,染色体改变。,(2),体内试验,：常检验骨髓细胞、胸腺、脾、精原细胞染色体畸变。,68,68/103,CHO细胞系或人类淋巴细胞染色体畸变分析,1）选取细胞培养液如DMEM、RPM或1640任一个，加入化学致突变物，在3下，培养CHO（缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶)细胞24 h或人类淋巴细胞为72 h。,2）在收获细胞前2 h，向培养液中加入秋水仙碱,，以终止细胞分裂，使细胞分裂同时于分裂中期。,3）离心得到沉淀细胞，然后制片,镜检有没有染色体畸变,。,4）观察染色体有,无断裂、缺失、易位、形成环状结构,等畸变，以及出现多处断裂百分率。,69,69/103,70,70/103,染色体畸变结果评定,确定受试物能否引发染色体,损伤或数目标改变,，以及要确定有这些改变细胞能否存活,一个细胞周期以上,。,1）一些小缺失和相互易位畸变，因其可能长久存在而比大缺失有更大危险性。,2）染色体断裂、缺失、易位、形成环状结构等是,染色体开放性断裂,结果，但也可能是,断裂后修复,结果。,3）有些化合物只作用于,细胞分裂某一时期,，故试验时要注意收获时间。,71,71/103,2、微核试验（Micronucleus test）,（1）微核形成,核膜受损,：在受化学致突变作用下，若核膜受损，核物质会向外突出延伸，形成一个或几个规则圆形或椭圆形小体，称微核。,纺锤体受伤,：因为,纺锤体受伤,或染色体,无着丝点断裂,，受伤染色体在分裂后期,仍停留在细胞质,，而形成微核结构。,有,动物细胞微核率试验,、,细胞培养微核试验,和,蚕豆根尖微核试验,等。,72,72/103,73,73/103,（2）动物细胞微核率试验,1,）骨髓嗜多染红细胞微核试验,以颈椎,脱臼,处死动物，用,小牛血清,将,骨髓细胞,冲洗入离心管。离心，弃去上清液，留少许血清悬浮细胞后进行涂片。甲醇固定、Giemsa染色（,核染色,）后进行观察。,每只动物要求观察计数,1000个嗜多染红细胞,，求出出现微核细胞频率。,74,74/103,2）外周血淋巴细胞微核试验,取人或动物外周血23滴(骨髓外血），于盛有1.5 ml Tris-NH,4,Cl缓冲液离心管中，混匀后置于37 下保温5 h，使,红细胞溶解,。,取5滴溶解液，混匀后离心，弃上清液，于沉淀物中再加 5 ml固定液，放置10 min后离心，弃上清液，取沉淀物涂片，镜检。,75,75/103,二、致畸效应,（一）基本概念,1、致畸作用,（Teratogenesis）,胚胎细胞分化和器官形成不正常,，而造成组织器官上缺点，并出现肉眼可见形态结构异常称,畸形,。致畸物经过母体作用于胚胎，引发胎儿畸形现象称,致畸作用。,当前已知1000各种环境原因可引发动物及人畸胎。60年代初，孕妇因服用“,反应停,”而造成近万名畸形儿。,许多国家对一些药品、农药、食品添加剂、防腐剂以及工业化学品要求应经过致畸试验。,76,76/103,77,77/103,2、致畸作用毒理学特点,(1)不一样发育阶段胚胎对致畸物有不一样敏感性，普通在胚胎形成早期，对致畸物最敏感。致畸物在接触胚胎时，可因胚胎处于不一样发育阶段而引发不一样畸形。,(2)不一样种系动物，因为代谢和胎盘结构不一样，对致畸物展现不一样敏感性。,（,3,）致畸作用剂量反应曲线很陡，最大无作用剂量与引发胚胎死亡最低剂量仅相差23倍。,78,78/103,3、化学致畸作用机理,(1)母体正常代谢过程受到破坏,致畸物使母体正常代谢过程受到破坏，使子代细胞在生物合成过程中,缺乏必需物质,，而影响胚胎正常发育。,(2)生殖细胞分裂过程障碍,致畸物可干扰细胞分裂过程,引发,生殖细胞减数分裂,或合子细胞,有丝分裂过程,障碍,造成细胞死亡,胚胎出现畸形。,79,79/103,(3)突变引发胚胎体细胞发育异常,致畸物可使,胚胎体细胞,发生突变,有时还可引发酶分子氨基酸组成发生改变,而引发代谢功效缺点,胚胎致畸。,(4)经过抑制或破坏主要代谢酶活性起作用,这些致畸物虽不影响生殖细胞减数分裂或细胞有丝分裂或诱发染色体突变，但可经过抑制或破坏对细胞生长分化较为主要酶活性,如,DNA聚合酶、核糖核苷酸还原酶等,活性，而影响胚胎正常发育。,80,80/103,（二）试验方法,致畸试验：是检测一些环境污染物能否经过妊娠母体引发胚胎畸形一个动物试验法。,1、动物选择要求,：,(1)选择与人类代谢相同动物，并具与,人类相同,胎盘结构,，如胎盘层数和厚度。(2)妊娠期短,利于观察。(3)产仔多,以取得足够标本。(4)另外,还应符合试验动物普通要求,如体型小、易驯服、繁殖以及价廉。,普通选择大鼠和小鼠和家兔。,81,81/103,2、剂量设定,(1)受试物剂量大小，应依据试验时给予受试物次数及连续时间长短而定，若试验期间只给一次，此时剂量稍大，反之则小。,（2）高剂量组，以不使母体产生显著中毒而造成流产为程度。普通能够LD,50,1/31/2为最高剂量组，LD,50,1/30 1/100为低剂量组。,（3）试验动物数：均以经交配确定已受精雌性动物为计数对象，每组不少于15 20只，家兔7 8只。,82,82/103,3、受试动物处理,（1）动物受孕：选择一批性成熟，未交配过雌鼠和雄鼠，以一雄一雌或二雌一雄百分比，同笼过夜，次日清晨检验雌鼠是否受孕。查到日为孕期0天，次日为第一天，孕期约1月,。,（2）药品处理方法和时间：普通多采取,灌胃,方法，在,胚胎敏感期,给药。若过早,给予可影响受精卵着床，,过迟,则对发育成熟胚胎往往不能显示致畸作用。,83,83/103,4、试验动物解剖,（1）解剖时间：预计自然分娩前12天为宜，以预防胎仔自然分娩后被吃或被咬伤。可留,1/4,动物待其,自然分娩,，并将,胎仔喂养到断奶,，进行仔细观察和检验。,（2）解剖检验,1）胎仔外部检验：如活胎数、早、晚期死胎数和吸收胎数；对活胎要检验性别、体重、身长、尾长及全窝胎盘总重量等。,84,84/103,2）胎仔骨骼检验,先用,75%90%乙醇-1%KOH,固定至,肌肉透明,;再用,茜素红,染色25d，至,骨骼染成桃或紫红色,;再经透明处理后，检验骨骼形态、大小、数量有没有异常及骨化程度。,3）胎仔内脏检验,经外观检验后活胎仔，按随机法，将胎仔数1/21/3置于,Bouin氏液中,固定12周后，取,内脏和软组织如腭裂、肾等，用徒手切片法制片,，观察结构改变。,P126，表3-11（外观畸形）；表3-12（骨骼畸形）；表3-13（脏器畸形）。,85,85/103,5、致畸作用评价,为科学评价受试物有没有致畸作用。应注意：,(1)试验结果中出现畸形率高低,须从出现,畸胎孕仔率、胎仔发生畸形率、单项畸形率、总畸形率,等多方面进行统计综合分析；比较试验组,与对照组有没有差异,；有,无剂量-反应关系,；而后才能作用评定。,(2)同种动物重复试验和,各种动物试验,结果一致,才能得出一致结论。,86,86/103,(3)生物在正常情况下也有变异，有时难以区分。但普通致畸率高、有特异性、且有剂量-效应或反应关系，应作致畸论。,(4)不一样种系动物对同种致畸物致畸作用可能有差异。当在,其它动物,上试验结果，和从,临床观察、流行病学调查等,假如,也取得一样结果,，才能下正确结论。,87,87/103,三、致癌效应,（一）基本概念,当前中国癌症诊疗率,6人/min,，其中有1 人得肺癌。据预计人类肿瘤有,80%90%,与环境原因相关，其中化学原因相关者占80%85%，所以，化学致癌作用极其主要。,化学物质（有机、无机、合成）引发肿瘤过程称化学致癌作用。能诱发肿瘤化学物质称,化学,致癌物,。,88,88/103,癌细胞主要特征,1、丧失细胞,接触性,生长,抑制,特征，恶性增加,不死细胞,。,2、形态显著改变,变态细胞,。,3、,细胞膜上糖蛋白降低，易在体内分散和转移。为,粘着性降低,扩散细胞,。,89,89/103,癌变诱发因子：,1、物理致癌因子：紫外线、X射线、辐射等。,2、化学致癌因子：1）无机物：砷化物、铬化物、镉化物、石棉等。2）有机物：联苯胺、烯环烃、亚硝胺、黄曲霉毒素等。,3、病毒致癌因子：肝炎病毒：肝癌，Rous肉瘤病毒,90,90/103,世界卫生组织下属,“,国际癌症研究中心,”,对,900,多个原因进行评定，,公布,116,种明确致癌物,和,66,种可能致癌物,（,年搜狐网）,。,其中，明确致癌物中有：,（,1,）食品类,：酒精、烟草、发霉谷物或坚果（黄曲霉素）、槟榔果、,烤熏食品,（苯并芘）、,火腿、培根,等加工类肉食、自来水中亚硝基二甲胺。,（,2,）环境类,：空气污染（,PM2.5),、电离辐射、紫外辐射、劣质装修建材：苯和甲醛,91/103,（,3,）致病菌,：肝炎病毒、幽门螺杆菌、人类乳头瘤病毒、华支睾吸虫（生鱼、螺）。,1、细胞癌变学说,（1）体细胞突变说,（Somatic mutation theory）,认为致癌原因作用于,体细胞遗传物质DNA,，使其发生突变，致使细胞功效发生异常，而致癌。,92,92/103,（,2,分化障碍学说,（Differentiatioin obstacle theory）,认为细胞癌变不一定需要体细胞,遗传物质发生突变,，而只是,细胞分化,过程中,相关,基因调控过程,受到,致癌原因干扰，因而使,细胞分化和增殖发生紊乱,而出现癌变。,（3）癌基因学说,(Oncogene theory),认为全部细胞都有癌基因(oncogene)。在正常情况下这种癌基因处于阻遏状态，只有当细胞内相关调整机制遭到破坏时，癌基因才表示，而造成细胞发生癌变。,93,93/103,3、癌变过程 普通经3个阶段,（1）引发阶段,：即正常细胞转化为癌细胞过程。,当致癌物与细胞接触时，致癌物与DNA结合发生反应使细胞内遗传物质染色体或基因发生突变，也可能与蛋白质发生反应，使细胞中基因控制过程发生改变，并出当代谢障碍，而形成癌变，为不可逆过程。,94,94/103,（2）促长阶段,癌变细胞不停增殖直到形成一个临床上可被检出肿块过程。此过程需较长时间，是一个可逆过程。,（3）浸润和转移阶段,已形成癌肿块不停发展，逐步侵害周围正常组织，经血液循环或淋巴系统，扩散到其它较远部位。,95/103,96,96/103,（二）试验方法,致癌试验,：是检验受试物及其代谢产物，是否含有致癌作用或诱发肿瘤作用慢性试验方法。,有,短期快速筛选试验方法,和,长久动物诱癌试验,。,97,97/103,1、短期筛检方法,:（哺乳动物细胞体外转化法筛选）,惯用,“,原代叙利亚仓鼠胚胎细胞,”,和,“,小鼠C3H/10T1/2和BALB/C-2T3细胞系,”,，当它们与各种化学或物理致癌物接触后，会发生表型如,形态、核型、生长特征,等改变，经过增殖，可形成与正常细胞不一样集落，即,转化集落,。,经过,转化集落,存在,和,形成率,，以及转化细胞,接种到裸鼠,中发生肿瘤，来评价化学物致癌性。,98,98/103,99,99/103,2、长久动物诱癌试验,当经,短期试验证实,一个化学物质具,有潜在致癌性,，或其化学,结构与某种已知致癌物十分近似,，又在人类社会中有实际应用价值时，应进行长久动物诱癌试验。,（1）试验动物及饲